楊小梅，周文紅，陳偉玲，谷毅鵬*

1. 賀州學院食品科學與工程技術研究院（賀州 542899）；2. 廣西大學輕工與食品工程學院（南寧 530004）

亞硝酸鹽是食品加工過程中用于改善食品色澤及風味的一種添加劑，本身并無毒性，但其作為亞硝胺的前體物質，在體內(nèi)酸性環(huán)境中與微生物的作用下，可與胺類物質反應生成強致癌物——N-亞硝胺[1-2]。攝入0.3～0.5 g亞硝酸鹽即可引起中毒甚至死亡[3-4]。當前主要通過使用合成類抗氧化劑來清除亞硝酸鹽，抑制亞硝化反應，但這些合成類化合物可能含有潛在毒性，因此人們轉向使用更安全、高效的天然活性成分作為新的亞硝酸鹽清除劑[5-6]。

荸薺是一種藥食同源類蔬菜，對呼吸道疾病、糖尿病、高血壓、腸炎、慢性腎炎等均有很好的療效[7-8]。荸薺皮占荸薺總質量的20%～25%，有研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抑菌、抗癌、抑制丙烯酰胺等活性，但作為荸薺加工過程中的廢棄物，大量堆積且腐敗后會造成環(huán)境污染[9-10]。目前針對荸薺皮已有較多研究，但有關荸薺皮皂苷的活性卻鮮有報道。在此背景下，通過建立體外模擬胃液體系，對荸薺皮皂苷的亞硝酸鹽清除能力、亞硝胺合成的阻斷能力進行評估，為拓展荸薺皮的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮荸薺皮（賀州荸薺加工批發(fā)部，清洗干凈，除去腐爛質變的壞皮，于鼓風干燥箱40 ℃、24 h烘干，用粉碎機粉碎，備用）。

亞硝酸鈉、濃鹽酸、碳酸鈉、氯化鈉、對氨基苯磺酸（天津市化學試劑研究所）；鹽酸萘乙二胺（天津市永大化學試劑有限公司）；α-萘胺（上海展云化工有限公司）；二甲胺（廣州市酷泰貿(mào)易有限公司）；胃蛋白酶（西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；AB-8大孔樹脂（山東君鴻生物科技有限公司）；抗壞血酸（天津瑞金特化學品有限公司）等?；瘜W試劑均為分析純。

模擬胃液A配制：用少量蒸餾水溶解2.0 g NaCl，加入5 mL HCl，加蒸餾水定容至1 L，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

模擬胃液B配制：分別用蒸餾水溶解2.0 g NaCl與3.2 g胃蛋白酶，加入5 mL HCl，加蒸餾水定容至1 L，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設備

KQ3200DE數(shù)控超聲波清洗器（蘇州江東精密儀器有限公司）；FA2004B電子天平（上海精科天美科學儀器有限公司）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海百典儀器有限公司）；UV-1800PC紫外分光光度計（上海美普達儀器有限公司）；RE-5000旋轉蒸發(fā)器（上海振榮科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 荸薺皮皂苷的提取純化

準確稱取10.00 g荸薺皮粉置于圓底燒瓶中，加入150 mL甲醇，用冷凝管搭建冷凝回流裝置，放入超聲波清洗器中60 ℃下100 W提取2 h，過濾并收集濾液，減壓濃縮成膏狀后加少量水懸浮，加入等體積乙醚洗滌，反復3次除去脂溶性成分。再加100 mL水飽和正丁醇攪拌1 h，靜置分層，收集正丁醇層濃縮干燥，即為荸薺皮皂苷粗提物。將粗皂苷用少量甲醇溶解，加入AB-8大孔樹脂（提前用甲醇浸泡溶脹），攪拌、混勻，用蒸餾水洗滌至無色無沉淀后，再用80%甲醇洗脫至無色，收集洗脫液，蒸發(fā)濃縮后得到荸薺皮皂苷。

1.3.2 亞硝酸鈉標準曲線的建立

準確移取2 mL NaNO2標準溶液（5 μg/mL），加入2 mL對氨基苯磺酸（0.4%），搖勻后靜置5 min，加入1 mL鹽酸萘乙二胺（0.2%），移至25 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，靜置15 min后用以測定吸光度。用蒸餾水代替NaNO2標準溶液按上述方法作為空白調零，用紫外可見光分光光度計進行全波長掃描，確定最大吸收峰處的波長λmax。分別移取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL NaNO2標準溶液（5 μg/mL），采用上述方法進行反應，使反應體系中NaNO2的最終濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 μg/mL，最后在最大吸收波長λmax處測定吸光度，根據(jù)測量的吸光度繪制標準曲線。

1.3.3 亞硝酸鹽清除率的測定

亞硝酸鹽清除率的測定采用鹽酸萘乙二胺法[11]。取10 mL在37 ℃預熱 10 min后的胃液移至25 mL比色管內(nèi)，加入2 mL一定濃度的皂苷溶液（空白組用蒸餾水代替皂苷溶液）、2 mL NaNO2標準溶液（5 μg/mL）（背景組用蒸餾水代替亞硝酸鈉），混勻，于37 ℃水浴30 min，加入2 mL的0.4%對氨基苯磺酸溶，混勻，靜置5 min后加入1 mL 的鹽酸萘乙二胺（0.2%）溶液，加入蒸餾水定容，混勻并靜置15 min。在λmax處測定其吸光度，每組試驗重復3次，用式（1）計算清除率。

1.3.4 亞硝胺阻斷率測定

亞硝胺阻斷率測定采用α-萘胺法[12-13]。移取10 mL在37 ℃水浴10 min后的胃液到25 mL比色管中，加入2.0 mL的不同濃度皂苷溶液（空白組用蒸餾水代替皂苷）。加入2 mL的1 mmol/L NaNO2溶液（背景組用蒸餾水代替亞硝酸鈉）與2 mL二甲胺溶液（1 mmol/L），用蒸餾水定容，在37 ℃下水浴1 h。用移液管吸取1.0 mL上述溶液加到7 cm培養(yǎng)皿中，加入0.5 mL Na2CO3溶液，紫外線照射15 min。加入1.5 mL對氨基苯磺酸溶液，1.5 mL萘胺溶液，0.5 mL蒸餾水，搖勻靜置15 min。在λmax處測其吸光度，每組試驗重復3次，用式（2）計算阻斷率。

1.3.5 荸薺皮皂苷清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成在兩種模擬胃液體系下的作用效力對比

取37 ℃預熱10 min后的模擬胃液A和模擬胃液B，各10 mL，于25 mL比色管中，分別加入2 mL濃度為6.25，12.50和25.00 μg/mL的荸薺皮皂苷溶液，按照1.2.3及1.2.4的方法，測試不同濃度的荸薺皮皂苷對亞硝酸鈉的清除率及對亞硝胺合成的阻斷率，同時以抗壞血酸（VC）為陽性對照。

1.3.6 不同條件對荸薺皮皂苷亞硝酸鹽清除作用及阻斷作用的影響

建立體外模擬胃液B體系，分別加入2 mL不同濃度（3.125，6.250，12.500，25.000和50.000 μg/mL）荸薺皮皂苷樣液，于37 ℃水浴反應15 min，檢測不同濃度皂苷對亞硝酸鹽的清除率及對亞硝胺合成的阻斷率，并計算荸薺皮皂苷對清除亞硝酸鹽的IC50及阻斷亞硝胺合成能力的IC50。

模擬胃液B體系中，加入2 mL濃度為IC50的皂苷樣液，在37 ℃水浴中反應不同時間（15，30，45，60和75 min），檢測不同反應時間對荸薺皮皂苷清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成能力的影響。

模擬胃液B體系中，分別加入不同體積（0.2，0.5，1.0，2.0和3.0 mL）濃度為IC50皂苷樣液，在37 ℃水浴中反應15 min，檢測不同劑量對皂苷清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成能力的影響。

先將濃度為IC50的皂苷樣液經(jīng)過不同溫度（37，50，60，80和100 ℃）預處理15 min，在模擬胃液B體系中，分別加入2 mL預處理后的皂苷樣液，在37 ℃水浴中反應15 min，檢測溫度對皂苷清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成能力的影響。

2 結果與分析

2.1 亞硝酸鈉標準曲線的繪制

如圖1所示，亞硝酸鹽標準溶液在546 nm處有最大吸光度，因此后續(xù)反應的測定選定在該波長處。以亞硝酸鈉濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線（圖2），擬合出亞硝酸鈉標準曲線方程y=0.128 6x+0.002 9，方程的R2=0.999 78＞0.99，說明標準曲線具有良好的線性關系。

圖1 亞硝酸鈉標準溶液可見光光譜掃描

圖2 亞硝酸鈉標準曲線

2.2 荸薺皮皂苷清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的作用效力

由圖3與圖4可知，在模擬胃液A與B體系中，隨著皂苷濃度的加大，亞硝酸鹽清除率和亞硝胺合成阻斷率也隨之上升，質量濃度25 μg/mL時，荸薺皮皂苷在胃液A條件下清除率為71%、阻斷率為57.1%，胃液B條件下清除率為78.5%、阻斷率為65%；VC在模擬胃液A與B體系中對硝酸鹽清除率和亞硝胺合成阻斷率也隨濃度升高而升高，在相同濃度下均明顯高于荸薺皮皂苷。質量濃度6.25 μg/mL時，VC在胃液A和胃液B條件下亞硝酸鈉清除率分別達70.4%和75.7%，亞硝胺合成阻斷率分別為71.4%和80%，其在模擬胃液B條件下的清除率及阻斷率也均高于胃液A。因此，說明在2種模擬胃液體系下荸薺皮皂苷呈現(xiàn)出較好的亞硝酸鹽清除效果，在檢測的濃度下荸薺皮皂苷在胃液B中的清除率均高于胃液A；但與VC相比，其清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的作用效力不及VC。此外，由于胃液B中含有胃蛋白酶，比胃液A更接近真實人體內(nèi)環(huán)境，因此在后續(xù)的亞硝酸鈉清除試驗選用模擬胃液B進行測定。

2.3 荸薺皮皂苷濃度對其清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成作用的影響

荸薺皮皂苷在胃液B環(huán)境下對亞硝酸鹽清除率影響見圖5。結果表明，皂苷對亞硝酸鹽清除率及亞硝胺合成的阻斷率隨著其濃度增加而增強，呈現(xiàn)明顯的劑量關系；皂苷質量濃度達到25 μg/mL后其亞硝酸鹽清除率趨于穩(wěn)定，50 μg/mL時達到最大值，為84.5%；在皂苷質量濃度超過6.25 μg/mL后亞硝胺合成的阻斷率增幅減緩，最終在皂苷50 μg/mL質量濃度下其亞硝胺的阻斷率達到75%，說明荸薺皮皂苷有較好的清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝酸鹽合成的效果。通過統(tǒng)計分析軟件SPSS Statistics 19.0對不同濃度荸薺皮皂苷對亞硝酸鹽清除率的結果進行分析后，計算出在胃液B環(huán)境下荸薺皮皂苷清除亞硝酸鹽的IC50為6.02 μg/mL，阻斷亞硝酸鹽合成的IC50為7.58 μg/mL，因此在后續(xù)試驗選用這兩個濃度分別作為檢測荸薺皮皂苷對亞硝酸鹽清除及亞硝胺合成的阻斷作用的檢測濃度。

圖3 荸薺皮皂苷清除亞硝酸鹽作用效力對比

圖4 荸薺皮皂苷阻斷亞硝胺合成作用效力對比

圖5 荸薺皮皂苷濃度對清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的影響

2.4 反應時間對荸薺皮皂苷清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成作用的影響

在模擬胃液B條件下，荸薺皮皂苷在不同反應時間下對亞硝酸鈉清除率的影響如圖6所示。結果表明，荸薺皮皂苷的清除率及阻斷率隨反應時間的增加而不斷增大，30 min前清除率和阻斷率增加明顯，而在45 min后清除率趨于穩(wěn)定但阻斷率出現(xiàn)波動，在60 min時均達到最大值，說明在60 min左右時反應已經(jīng)完全，60 min之后不再上升。

圖6 反應時間對清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的影響

2.5 反應體積對荸薺皮皂苷清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成作用的影響

在模擬胃液B環(huán)境中，加入不同體積劑量的荸薺皮皂苷對亞硝酸鈉清除率影響如圖7所示。結果表明，隨著荸薺皮皂苷加入體積增加，其對亞硝酸鹽的清除率和阻斷率也不斷增強，其中阻斷率呈現(xiàn)出明顯的線性關系，而清除率在體積高于0.8 mL時趨于平緩，兩者在2.0 mL處達到最大值。

圖7 反應體積對清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的影響

2.6 處理溫度對荸薺皮皂苷清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成作用的影響

在模擬胃液B環(huán)境下，荸薺皮皂苷在不同溫度處理后對清除亞硝酸鈉與阻斷亞硝胺合成的影響如圖8所示。溫度處理對清除亞硝酸鹽與阻斷亞硝胺合成的作用沒有太大影響，隨著溫度升高，只有在100 ℃時亞硝酸鹽的清除率有少許下降，而此時其對亞硝胺合成的阻斷率有少許上升，但整體趨勢未出現(xiàn)明顯波動，清除率和阻斷率都維持在相同水平。說明荸薺皮皂苷在經(jīng)過100 ℃以下的熱處理后，并未影響到其對清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成作用，熱穩(wěn)定性良好。

圖8 處理溫度對清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的影響

3 討論與結論

亞硝酸鹽攝入量過多可引發(fā)高鐵血紅蛋白癥，會增加癌變風險[14]。因此，解除亞硝酸鹽威脅、控制食品中亞硝酸鹽的殘留顯得十分重要。試驗以荸薺皮皂苷為研究對象，在不同體外模擬胃液環(huán)境、不同皂苷濃度、不同反應時間、不同反應體積及不同預處理溫度條件下，考察其對亞硝酸鹽清除作用與亞硝胺合成的阻斷作用的影響。結果表明，荸薺皮皂苷具有較好的亞硝酸鈉清除力與亞硝胺合成阻斷力，其在更接近真實胃液的模擬胃液B環(huán)境下其效果發(fā)揮更好，對亞硝酸鹽的清除率可達84.5%，對亞硝胺的阻斷率達75%，這兩者的IC50分別為6.02和7.58 μg/mL；荸薺皮皂苷對亞硝酸鹽清除作用與亞硝胺合成的阻斷作用隨濃度、時間和體積的增加而增強，在不同溫度處理后也未受影響，熱穩(wěn)定性好，具有開發(fā)新型保健食品的潛力。此外，荸薺皮皂苷清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的作用效力雖然不及VC，但為荸薺皮的精深加工及高值化利用提供新途徑，仍然有深入研究價值。