尹樂斌 *，周娟，何平，李立才，趙良忠

1. 邵陽(yáng)學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院（邵陽(yáng) 422000）；2. 豆制品加工技術(shù)湖南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究基地（邵陽(yáng) 422000）

豆清液是傳統(tǒng)豆制品生產(chǎn)蹲腦和壓榨過程中產(chǎn)生的廢水[1]，有研究表明每生產(chǎn)1萬(wàn) t大豆，可產(chǎn)生9.7萬(wàn) t的豆清液。隨著近年來(lái)豆制品行業(yè)的飛速發(fā)展，以及國(guó)家、人民環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，豆清液直接排放所帶來(lái)的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)的問題越來(lái)越受到關(guān)注，豆制品加工廢水資源化利用成了必然的趨勢(shì)。研究表明，傳統(tǒng)豆清液綜合利用主要集中在活性成分提取[2-4]、豆清發(fā)酵液凝固劑開發(fā)[5-7]以及豆清液產(chǎn)品開發(fā)[8-10]等，在很大程度上促進(jìn)了豆清液綜合利用的發(fā)展，但是一直處在摸索探究階段。近年來(lái)，在貴州地區(qū)也出現(xiàn)了利用豆清液發(fā)酵制備酸湯的研究，為豆清液綜合利用提供了新的思路，也得到了行業(yè)內(nèi)的認(rèn)可，具有較大的應(yīng)用前景[11]。

豆清多肽發(fā)酵液是豆清液經(jīng)過特定的菌種發(fā)酵得到的含豆清多肽的豆清液，是在豆清液微生物發(fā)酵的研究基礎(chǔ)上，為增加豆清液的附加值而拓展的豆清液綜合利用新途徑。此次試驗(yàn)通過超濾的方式，將豆清多肽發(fā)酵液進(jìn)行分級(jí)，分別測(cè)定不同組分的體外抗氧化活性及抑菌活性，并與未發(fā)酵的豆清多肽進(jìn)行比較，以期以最簡(jiǎn)單的方式了解不同超濾組分的生理活性功能，為進(jìn)一步開發(fā)豆清多肽類產(chǎn)品提供理論依據(jù)和方法參考。

1 材料與方法

1.1 主要原料與試劑

豆清液（收集于實(shí)驗(yàn)室）；乳酸菌（實(shí)驗(yàn)室分離鑒定）；N, N-亞甲基雙丙烯酰胺、丙烯酰胺（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限責(zé)任公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS）、甘氨酸、β-巰基乙醇（北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；溴酚蘭、考馬斯亮藍(lán)R-250：生工生物工程（上海）股份有限公司；TEMED；過硫酸銨（西隴科學(xué)股份有限公司）；2,2-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）[2,2’-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]、1, 1-二苯基-2-苦肼基自由基（1, 1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical，DPPH）：上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

培養(yǎng)箱；SW-CJ-2FD雙人單面（垂直）凈化工作臺(tái)（江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司）；UV2900紫外-可見分光光度計(jì)（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；SCIENTZ-18N冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；微濾機(jī)組（配制10 kDa，5 kDa，3 kDa和800 Da的超濾膜，上海摩速科學(xué)器材有限公司）；Czone系列抑菌圈測(cè)量及菌落計(jì)數(shù)儀（杭州迅數(shù)科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 豆清多肽發(fā)酵液制備

在已有的研究基礎(chǔ)上，將新鮮豆清液經(jīng)過高壓蒸汽滅菌（121 ℃，20 min）后將實(shí)驗(yàn)室已有乳酸菌種：鼠李糖乳桿菌3-1（Lɑctobɑcillus rhɑmnosusstrain 3-1）、玉米乳桿菌5-1（Lɑctobɑcillus zeɑestrain 5-1）、副干酪乳桿菌5-2（Lɑctobɑcillus cɑseistrain 5-2），按1︰1︰1的比例接種到豆清液中，菌種添加量為豆清液體積的4%，在37 ℃下發(fā)酵12 h，得到豆清多肽發(fā)酵液。

1.3.2 超濾分離

將豆清多肽發(fā)酵液和未發(fā)酵的豆清液分別離心（4 000 r/min，15 min），然后分別通過纖維膜和10 kDa，5 kDa，3 kDa和800 Da的超濾膜，設(shè)置壓力60 MPa，室溫下進(jìn)行回流超濾。樣液初始體積為1 500 mL，首先通過纖維膜過濾不溶性物質(zhì)，然后通過10 kDa的超濾膜，當(dāng)截留液體積剩下200 mL時(shí)，收集截留液，將濾過液繼續(xù)通過5 kDa的超濾膜，當(dāng)截留液剩下200 mL時(shí)，收集截留液，將濾過液繼續(xù)通過3 kDa的超濾膜，依次類推由大到小經(jīng)過超濾膜。分別收集＞10 kDa，5～10 kDa，3～5 kDa，800 Da～3 kDa和＜800 Da的組分。將收集的不同組分樣品冷凍干燥，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳

采用不連續(xù)體系垂直板電泳對(duì)發(fā)酵和未發(fā)酵的豆清多肽相對(duì)分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析，電泳濃縮膠的濃度為5%，分離膠濃度為12%。凝膠厚度為1 mm。在泳道中分別加入10 μL Marker未發(fā)酵和發(fā)酵豆清多肽凍干粉供試品溶液各30 μL，開始電泳。設(shè)置濃縮電泳電壓80 V、分離膠電泳電壓120 V，待溴酚藍(lán)染液完全遷移出凝膠后停止電泳。用0.05%的考馬斯亮藍(lán)G-250染液染色30 min，用脫色液（水-乙醇-冰乙酸體積比為60︰30︰10）進(jìn)行脫色，到條帶清晰為止，重復(fù)3次。

1.3.4 體外抗氧化活性測(cè)定方法

OH自由基清除率測(cè)定參考Smirnoff等[12]的方法；ABTS自由基清除率測(cè)定參考Re等[13]的方法；DPPH自由基清除率測(cè)定參考Moyo等[14]的方法。

1.3.5 抑菌活性測(cè)定

抑菌活性的測(cè)定采用牛津杯法，通過不同超濾組分抑菌圈大小判斷其對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑制效果。菌懸液制備：將供試大腸桿菌和金黃色葡萄球菌從固體斜面培養(yǎng)基上接種至平板上，于37 ℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接兩代。在無(wú)菌條件下，取活化好的菌株，用接種環(huán)分別挑取1環(huán)已活化好的菌種放入9 mL無(wú)菌生理鹽水中，振蕩搖勻，制成一系列菌懸液，濃度為107～108CFU/mL，備用[15]。用移液槍吸取100 μL菌懸液于平板中，用涂布棒涂布均勻，無(wú)菌操作，在培養(yǎng)基表面垂直放上牛津杯（內(nèi)短6 mm、外徑8 mm、高10 mm），輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙，在杯中加入100 μL豆清多肽的不同超濾組分樣品，勿使其外溢，每個(gè)樣品重復(fù)3次[18]，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈大小，采用全自動(dòng)菌落分析儀，測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)皿中抑菌圈的直徑，取平均值。無(wú)菌水作為空白對(duì)照[16-17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用Origin 9.0進(jìn)行處理分析，運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每組試驗(yàn)平行3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵與未發(fā)酵SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳結(jié)果

凝膠電泳的結(jié)果如圖1所示。對(duì)比Marker可知，未發(fā)酵豆清多肽在20～31 kDa以及31～45 kDa之間出現(xiàn)條帶，但大部分成彌散狀態(tài)，這可能是制備豆腐的過程中大豆的浸泡時(shí)間較長(zhǎng)，大豆的內(nèi)源蛋白酶對(duì)其蛋白質(zhì)的分解作用相關(guān)[19]，而發(fā)酵過后的豆清多肽沒有條帶，說明發(fā)酵對(duì)蛋白質(zhì)有降解作用，發(fā)酵過后多肽的相對(duì)分子質(zhì)量減小，這與劉麗莎等[20]的研究結(jié)果相似。

圖1 發(fā)酵與未發(fā)酵SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳結(jié)果圖

2.2 不同超濾組分體外抗氧化結(jié)果

2.2.1 不同超濾組分對(duì)DPPH自由基清除效果比較

DPPH是一種穩(wěn)定的氮中心自由基，由于其具有單電子，其醇溶液在517 nm具有明顯的吸收峰，當(dāng)DPPH中單電子與其他抗氧化中的單電子配對(duì)時(shí)，517 nm處吸光度降低，由于這種變化與接受電子數(shù)量呈定量關(guān)系，所以DPPH常被用作體外抗氧化的分析試劑[21]。從DPPH的清除效果來(lái)看，發(fā)酵和未發(fā)酵的樣品均對(duì)DPPH自由基表現(xiàn)出一定的清除活性（圖2和表1）。從不同超濾組分上看，無(wú)論是發(fā)酵還是未發(fā)酵樣品，800 Da～3 kDa組均比其他組分的清除活性要強(qiáng)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（p＜0.05），這與周婷婷等[22]的研究結(jié)果5 kDa以下相對(duì)分子質(zhì)量的大豆多肽自由基清除能力較強(qiáng)結(jié)果一致。對(duì)比發(fā)酵和未發(fā)酵樣品可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過發(fā)酵以后樣品的DPPH清除活性在一定程度上有所提高，這可能與低相對(duì)分子質(zhì)量的多肽含量增加，更多能與自由基結(jié)合的活性位點(diǎn)暴露出來(lái)有一定的關(guān)系。

圖2 不同超濾條件對(duì)樣品DPPH清除活性

表1 不同超濾條件發(fā)酵與未發(fā)酵DPPH清除效果EC50值

2.2.2 不同超濾組分對(duì)ABTS自由基清除效果比較

2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽，與過二硫酸鉀反應(yīng)，生成綠色的ABTS自由基，在734 nm處有特征吸收峰，當(dāng)ABTS溶液與具有抗氧化活性的物質(zhì)反應(yīng)時(shí)，體系顏色降低，在734 nm處的吸光度降低，由于其反應(yīng)靈敏、操作簡(jiǎn)單，也經(jīng)常被用作體外抗氧化活性的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[23]。如圖3所示，從不同超濾組分分析，在800 Da～3 kDa相對(duì)分子質(zhì)量范圍內(nèi)的樣品表現(xiàn)出較強(qiáng)的ABTS自由基清除活性，比同類型其他組分樣品清除活性強(qiáng)，但同一類型（發(fā)酵和未發(fā)酵）不同超濾組分之間對(duì)ABTS清除能力強(qiáng)弱沒有發(fā)現(xiàn)規(guī)律。比較同一組分發(fā)酵和未發(fā)酵超濾樣品的清除活性可以得出，經(jīng)過發(fā)酵部分組分的清除效果有所提高（＞10 kDa，3～5 kDa和＜800 Da），但是5～10 kDa和800 Da～3 kDa組分樣品發(fā)酵和未發(fā)酵的EC50值沒有顯著差異（p＞0.05），見表2。

圖3 不同超濾條件對(duì)樣品ABTS清除活性

表2 不同超濾條件發(fā)酵與未發(fā)酵ABTS清除效果EC50值

2.2.3 不同超濾組分對(duì)OH自由基清除效果的比較

OH自由基是生物體內(nèi)最重要的活性氧自由基之一，是活性氧中對(duì)生物體毒性最強(qiáng)，危害最大的一種自由基，與細(xì)胞輻射損傷、腫瘤、衰老等密切相關(guān)[24-25]。因此，OH自由基的清除效果常被作為體外抗氧化活性的重要考察標(biāo)準(zhǔn)。從表3可以看出，發(fā)酵和未發(fā)酵組分對(duì)OH自由基均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除效果，活性最強(qiáng)的組分當(dāng)其清除活性達(dá)到50%時(shí)，樣品的濃度為1.06±0.02 mg/mL。從不同超濾組分來(lái)看（圖4），800 Da～3 kDa的組分依然表現(xiàn)出最強(qiáng)的清除活性，與其他組分存在顯著差異（p＜0.05），不同組分之間的清除效果依然沒有規(guī)律；但是通過比較，在800 Da～5 kDa之間，表現(xiàn)出相對(duì)分子質(zhì)量越小，清除活性越強(qiáng)的規(guī)律，這與郁曉敏等[26]的研究結(jié)果抗氧化性和穩(wěn)定性最好的大豆肽組分的相對(duì)分子質(zhì)量在1 200～1 400 Da之間結(jié)果相似。比較發(fā)酵與未發(fā)酵各組分的OH自由基清除活性可以看出，經(jīng)過發(fā)酵以后，各組分的清除效果均有所提高，提高最大的組分（＞10 kDa）其EC50濃度降低了2.3 mg/mL，可能的原因與發(fā)酵使多肽與自由基結(jié)合的基團(tuán)暴露出來(lái)有關(guān)。

2.3 不同超濾組分抑菌活性分析

2.3.1 不同超濾組分對(duì)大腸桿菌的抑制效果分析

豆清液在發(fā)酵過程中乳酸菌利用豆清液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，一方面水解大分子蛋白質(zhì)，另一方面產(chǎn)生有機(jī)酸，特別是乳酸，使得發(fā)酵后不同的豆清液組分具有一定的抑菌效果，另外發(fā)酵過程中抑菌素產(chǎn)生也是使發(fā)酵液具有抑菌效果的原因[27]。對(duì)比發(fā)酵和未發(fā)酵的抑菌效果可以得出，發(fā)酵過后各組分均對(duì)大腸桿菌存在一定的抑菌活性，在平板中出現(xiàn)了比較明顯的抑菌圈，但是未發(fā)酵的樣品幾乎未出現(xiàn)抑菌圈，在添加3～5 kDa及5～10 kDa未發(fā)酵樣品的牛津杯周圍的細(xì)菌生長(zhǎng)狀況還比其他地方的細(xì)菌生長(zhǎng)狀況要好，說明未發(fā)酵的3～5 kDa及5～10 kDa樣品可能對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)狀況有促進(jìn)作用。比較發(fā)酵樣品不同超濾組分的抑菌圈直徑大?。ū?）可以得出，＞10 kDa的組分抑菌圈最小，800 Da～3 kDa的組分抑菌圈最大。當(dāng)超濾膜孔徑大于800 Da時(shí)，各組分之間存在隨著膜孔徑減小，各組分對(duì)大腸桿菌的抑制活性增強(qiáng)的趨勢(shì)，但＜800 Da的組分對(duì)大腸桿菌的抑制活性小于800 Da～3 kDa的組分，與3～5 kDa無(wú)顯著差異。

圖4 不同超濾條件對(duì)樣品OH自由基清除活性

表3 不同超濾條件發(fā)酵與未發(fā)酵OH自由基清除效果EC50值

表4 不同超濾組分發(fā)酵與未發(fā)酵樣品對(duì)大腸桿菌抑菌圈直徑

2.3.2 不同超濾組分對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果分析

金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，其細(xì)胞壁主要由肽聚糖和磷壁酸組成，抑菌機(jī)制和革蘭氏陰性菌有一定的差異。不同超濾組分對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果和大腸桿菌有一定的區(qū)別。雖然不同超濾組分的豆清多肽發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌有一定的抑制效果，平板上面出現(xiàn)了較明顯的抑菌圈，但是抑菌圈中間有一部分細(xì)菌又有重新生長(zhǎng)的趨勢(shì)。從抑菌圈直徑大小（表5）分析，800 Da～10 kDa之間各組分沒有顯著差異，＞10 kDa的部分表現(xiàn)出的抑菌活性較其他組分要稍弱一些。這可能與相對(duì)分子質(zhì)量較大的組分將抑菌類物質(zhì)包裹，無(wú)法發(fā)揮作用有關(guān)。未發(fā)酵的樣品對(duì)金黃色葡萄球菌未表現(xiàn)出抑制活性。具體原因還需要進(jìn)一步探討。

表5 不同超濾組分發(fā)酵與未發(fā)酵樣品對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑

3 結(jié)論

1) 通過乳酸菌發(fā)酵的方式得到了豆清多肽發(fā)酵液，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)發(fā)酵后得到的豆清多肽和未發(fā)酵豆清液中的多肽物質(zhì)進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，未發(fā)酵的豆清多肽相對(duì)分子質(zhì)量分布在20～45 kDa之間，經(jīng)過發(fā)酵后多肽相對(duì)分子質(zhì)量在20 kDa以下，說明發(fā)酵使豆清液中蛋白質(zhì)發(fā)生了降解。

2) 通過超濾技術(shù)對(duì)豆清多肽發(fā)酵液和新鮮豆清液進(jìn)行了分離處理，得到＞10 kDa，5～10 kDa，3～5 kDa，800 Da～3 kDa和＜800 Da的組分。對(duì)發(fā)酵和未發(fā)酵樣品的DPPH，ABTS，和OH自由基的清除效果進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵和未發(fā)酵的樣品各組分均對(duì)這幾種自由基顯示出較強(qiáng)的清除活性，經(jīng)過發(fā)酵以后清除活性在一定程度上有所增強(qiáng)，其中發(fā)酵的800 Da～3 kDa組分樣品表現(xiàn)出最強(qiáng)清除活性。

3) 對(duì)發(fā)酵和未發(fā)酵不同超濾組分的抑菌活性進(jìn)行探究，結(jié)果表明，經(jīng)過發(fā)酵的樣品對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制效果：對(duì)大腸桿菌的抑制效果，800 Da～3 kDa的組分效果最好；對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果，＜10 kDa的組分沒有顯著差異。