尹永磊 ，畢生雷，楊磊，張乃群*

1. 南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（南陽(yáng) 473061）；2. 河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司車用生物燃料技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南陽(yáng) 473000）

藻類食品是既傳統(tǒng)又新穎的食品，繼螺旋藻之后，小球藻、雨生紅球藻也越來越多地被用于保健品，微藻食品受到越來越多關(guān)注。異養(yǎng)小球藻生長(zhǎng)速度是自養(yǎng)藻的40倍、生物量是自養(yǎng)藻的60倍，而且含油量高、占地面積小、可利用工業(yè)發(fā)酵裝置進(jìn)行集約化生產(chǎn)，不僅可用于食品原料，同時(shí)也被認(rèn)為是生產(chǎn)生物柴油的良好原料[1]。微藻收集成本較高，一般占藻粉總成本的1/3[2]。藻類收集方法研究較多的是大型藻類、自養(yǎng)微藻類，規(guī)模化收集微藻主要使用工藝和設(shè)備均較成熟的離心法，但該方法能耗大、成本高。絮凝法在收集細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)細(xì)胞傷害極小，絮凝團(tuán)內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)完好，游離細(xì)胞則可保持良好的活性[3]，對(duì)后序提取工藝沒有不良影響，有研究表明絮凝法能夠使自養(yǎng)微藻收集成本降低68.8%[4]。試驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上，探索絮凝法收集異養(yǎng)小球藻工藝，以期為規(guī)?；瘧?yīng)用提供參考。

絮凝法大致可分為無機(jī)絮凝法、有機(jī)絮凝法、生物絮凝法。薛蓉等[5]研究表明，殼聚糖、瓊脂等有機(jī)絮凝劑對(duì)自養(yǎng)小球藻沒有任何絮凝作用，無機(jī)絮凝劑絮凝效果均比較理想。趙奎等[6]研究8種絮凝劑對(duì)自養(yǎng)小球藻的影響，結(jié)果表明氫氧化鈣是最理想的絮凝劑，自養(yǎng)小球藻絮凝率可達(dá)97%?，F(xiàn)有文獻(xiàn)僅涉及異養(yǎng)小球藻的生物絮凝法[2]，其他絮凝法尚未報(bào)道。異養(yǎng)小球藻的藻細(xì)胞油脂含量達(dá)50%以上，但藻蛋白含量?jī)H15%左右，與自養(yǎng)小球藻培養(yǎng)液相比，異養(yǎng)小球藻發(fā)酵液生物量較高、發(fā)酵液成分復(fù)雜，不僅含有培養(yǎng)基中殘留的葡萄糖、酵母粉、營(yíng)養(yǎng)鹽等物質(zhì)，還有大量的細(xì)胞碎片、膠體、代謝產(chǎn)物等物質(zhì)，這些物質(zhì)都是自養(yǎng)小球藻培養(yǎng)液不含有的。因此，直接借鑒以往經(jīng)驗(yàn)可能無法獲得理想結(jié)果，試驗(yàn)在綜合比較不同絮凝方法的絮凝效果基礎(chǔ)上，對(duì)絮凝率高的方法進(jìn)行工藝優(yōu)化，探索適合異養(yǎng)小球藻發(fā)酵液的絮凝方法。

1 材料與方法

1.1 材料及設(shè)備

異養(yǎng)小球藻（Chlorellɑ protothecoides）藻種（清華大學(xué)生命科學(xué)院）；異養(yǎng)小球藻發(fā)酵液（車用生物燃料技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）；異養(yǎng)小球藻發(fā)酵液由異養(yǎng)小球藻使用葡萄糖、酵母粉等原料發(fā)酵所得，發(fā)酵終了生物量為121 g/L、pH 6.3，發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)100 ℃滅菌、降溫，備用；三氯化鐵、氯化鋁、殼聚糖、陽(yáng)離子型高分子改性絮凝劑聚丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱聚丙烯酰胺）、醋酸（均為市售）；黑曲霉（Aspergillus niger 3.3928，車用生物燃料技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）。

ME1002E型電子天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司）；WH220-HT數(shù)字式加熱磁力攪拌器（伊孚森生物技術(shù)（中國(guó)）有限公司）；FE28-Bio型pH計(jì)（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司）；XSP-9CA型顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同絮凝方法的比較

無機(jī)絮凝法和有機(jī)絮凝法：取1 000 mL發(fā)酵液，分別置于5個(gè)500 mL小燒杯中，并分別加入1.5 g/L三氯化鐵、氯化鋁、殼聚糖、聚丙烯酰胺，在磁力攪拌器上以150 r/min速率攪拌2 min后靜置80 min（添加聚丙烯酰胺的同時(shí)需要同時(shí)添加醋酸，添加比例為1︰100 g/mL），使用移液槍從燒杯中上部吸取適量液體測(cè)定細(xì)胞數(shù)，參照文獻(xiàn)[6]計(jì)算絮凝率。

生物絮凝法：參照文獻(xiàn)[2]在搖瓶發(fā)酵液中補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并接入黑曲霉繼續(xù)培養(yǎng)，直到霉菌吸附球不再增加為止，使用移液槍從燒杯中上部吸取適量液體測(cè)定細(xì)胞數(shù)，參照文獻(xiàn)[6]計(jì)算絮凝率。

1.2.2 絮凝條件優(yōu)化

絮凝劑添加量對(duì)絮凝率的影響：取1 000 mL發(fā)酵液，分別置于5個(gè)500 mL小燒杯中，并分別加入0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 g/L的聚丙烯酰胺（添加聚丙烯酰胺的同時(shí)需要同時(shí)添加醋酸，添加比例為1︰100 g/mL），在磁力攪拌器上以150 r/min速率攪拌2 min后靜置80 min，使用移液槍從燒杯中上部吸取適量液體測(cè)定細(xì)胞數(shù)，參照文獻(xiàn)[6]計(jì)算絮凝率。

攪拌速率對(duì)絮凝率的影響：取1 000 mL發(fā)酵液，分別置于5個(gè)500 mL小燒杯中，并分別加入2.0 g/L的聚丙烯酰胺（添加聚丙烯酰胺的同時(shí)需要同時(shí)添加醋酸，添加比例1︰100 g/mL），在磁力攪拌器上以0，100，200，300和400 r/min速率攪拌2 min后靜置80 min，使用移液槍從燒杯中上部吸取適量液體測(cè)定細(xì)胞數(shù)，參照文獻(xiàn)[6]計(jì)算絮凝率。

攪拌時(shí)間對(duì)絮凝率的影響：取1 000 mL發(fā)酵液，分別置于5個(gè)500 mL小燒杯中，并分別加入2.0 g/L聚丙烯酰胺（添加聚丙烯酰胺的同時(shí)需要同時(shí)添加醋酸，添加比例1︰100 g/mL），在磁力攪拌器上以300 r/min速率攪拌0，10，20，40和80 min后靜置80 min，使用移液槍從燒杯中上部吸取適量液體測(cè)定細(xì)胞數(shù)，參照文獻(xiàn)[6]計(jì)算絮凝率。

1.2.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的主要影響因素，利用Box-Behnken組合設(shè)計(jì)的方法對(duì)其進(jìn)行試驗(yàn)，利用響應(yīng)面分析方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行回歸模擬，確定最優(yōu)絮凝條件。1.2.4 絮凝率的計(jì)算

1.2.5 數(shù)據(jù)分析方法

單因素試驗(yàn)使用Origin 75軟件繪圖并分析，響應(yīng)面分析使用Design-Expert 8.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 絮凝方法選擇

無機(jī)絮凝法可分為鐵系、鋁系，無機(jī)絮凝法主要通過釋放離子到細(xì)胞表面，通過電中和作用消除細(xì)胞表面的靜電斥力，從而使細(xì)胞之間由原來的相互排斥變成相互吸引、凝聚成團(tuán)。有機(jī)絮凝法可分為殼聚糖等天然型和聚丙烯酰胺等合成型，通過吸附等作用凝聚細(xì)胞。生物絮凝法一般使用真菌、霉菌等菌絲體較長(zhǎng)的細(xì)胞，霉菌等細(xì)胞通過菌絲包裹其他細(xì)胞凝聚成團(tuán)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的絮凝，也有研究將生物法劃歸到有機(jī)絮凝法中。

圖1是不同絮凝方法對(duì)異養(yǎng)小球藻的絮凝效果。從圖1可知，霉菌吸附效果最差，僅43.18%，原因可能是異養(yǎng)小球藻發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)、發(fā)酵液中成分復(fù)雜，霉菌生長(zhǎng)狀況不太理想，異養(yǎng)小球藻細(xì)胞較小，霉菌絲無法形成致密的菌絲團(tuán)包裹細(xì)胞。三氯化鐵、氯化鋁的絮凝效果略高于霉菌吸附，原因可能是異養(yǎng)小球藻經(jīng)過十幾天的發(fā)酵，發(fā)酵液中不僅有大量的代謝產(chǎn)物，還存在膠體、細(xì)胞碎片等物質(zhì)，干擾了無機(jī)離子的電中和作用。聚丙烯酰胺絮凝率最高，可能是人工合成的有機(jī)絮凝劑攜帶大量的帶電官能團(tuán)，能夠強(qiáng)烈吸附膠體、細(xì)胞，并迅速凝聚成團(tuán)沉積下來。試驗(yàn)所用絮凝方法與其他文獻(xiàn)相比略低，可能是異養(yǎng)小球藻發(fā)酵液質(zhì)量體積濃度達(dá)121 g/L，遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)所用自養(yǎng)小球藻的2 g/L，這導(dǎo)致溶液黏度過大、不利于高分子鏈的分散，導(dǎo)致絮凝效果較差[7-9]。

圖1 不同絮凝方法的絮凝率

2.2 工藝參數(shù)對(duì)絮凝率的影響

影響絮凝的參數(shù)有絮凝劑添加量、攪拌速率、攪拌時(shí)間、沉降時(shí)間、pH等。對(duì)于沉降時(shí)間，陳曉燕等[10]研究結(jié)果表明，絮凝后沉降一般在10 min內(nèi)即可完成，絮凝時(shí)間對(duì)絮凝率影響并不大，而調(diào)節(jié)pH將會(huì)使用額外的酸和堿，絮凝率較高的pH區(qū)間也往往處于中性范圍[11]。因此著重考察絮凝劑添加量、攪拌速率、攪拌時(shí)間對(duì)絮凝率的影響。

2.2.1 絮凝劑添加量對(duì)絮凝率的影響

聚丙烯酰胺是人工合成的高分子有機(jī)絮凝劑，它的作用機(jī)理是絮凝劑能夠釋放帶電官能團(tuán)吸附膠體、細(xì)胞，從而使細(xì)胞橋架成大團(tuán)并沉降，可見這種絮凝劑實(shí)現(xiàn)絮凝效果的前提是能夠與細(xì)胞接觸、細(xì)胞之間橋架成團(tuán)。如果絮凝劑添加量較少，絮凝劑不足以吸附全部膠體、細(xì)胞，不能聚集成團(tuán)并沉積，而如果絮凝劑添加量過多，每個(gè)細(xì)胞都被數(shù)個(gè)絮凝劑基團(tuán)吸附、包裹沒有空間去橋架，而絮凝劑基團(tuán)之間無法橋架，所以細(xì)胞之間可能無法實(shí)現(xiàn)橋架、無法絮凝成團(tuán)并沉降[11]。因此合適的絮凝劑添加量不僅與絮凝劑成本有關(guān)，還影響著絮凝效果。

圖2是絮凝劑添加量對(duì)絮凝率的影響。隨著絮凝劑添加量提高，絮凝率不斷提高，但絮凝劑添加量2 g/L時(shí)絮凝率達(dá)到68.03%，繼續(xù)增加用量絮凝率反而快速下降。趙奎等[6]研究表明，殼聚糖、聚丙烯酰胺的用量越大越好，與試驗(yàn)結(jié)果存在差異，這可能是趙奎等研究所用研究對(duì)象是自養(yǎng)藻，培養(yǎng)液中成分簡(jiǎn)單，只有水、少量的可溶性無機(jī)鹽和藻細(xì)胞，另外試驗(yàn)的絮凝率并沒有達(dá)到最大值，從而得出絮凝劑用量越大越好的結(jié)論。因此，試驗(yàn)選擇絮凝劑添加量2 g/L。

圖2 絮凝劑添加量對(duì)絮凝率的影響

2.2.2 攪拌速率對(duì)絮凝率的影響

攪拌是生化反應(yīng)中的常用操作，目的是為了使溶液中的各種成分能夠混合均勻，以防局部反應(yīng)物濃度過高，從而縮短反應(yīng)時(shí)間，提高反應(yīng)速率。絮凝劑、發(fā)酵液均是可溶性物質(zhì)，但它們之間吸附、橋架作用并不劇烈。因此對(duì)攪拌速率需要進(jìn)一步考察。

圖3是攪拌速率對(duì)絮凝率的影響。隨著攪拌速率提高，絮凝率快速提高，說明攪拌使絮凝劑、發(fā)酵液在容器中分布均勻、充分接觸，從而在攪拌速率提高時(shí)絮凝率也得到相應(yīng)提高。但攪拌速率超過300 r/min后，絮凝率反而有所下降，這可能是由于攪拌速率過高而產(chǎn)生的剪切力過大，這種作用力超過了絮凝劑與細(xì)胞之間的橋架、吸附作用力，從而將部分絮凝團(tuán)打散、絮凝率下降，試驗(yàn)結(jié)果與陳曉燕等[10]的研究結(jié)果相同，因此試驗(yàn)選擇攪拌速率300 r/min。

2.2.3 攪拌時(shí)間對(duì)絮凝率的影響

絮凝是一個(gè)緩慢的過程，沒有酸堿中和之類的生化反應(yīng)那樣劇烈，因此絮凝過程需要一定時(shí)間。攪拌能讓反應(yīng)體系中各成分混合均勻、充分接觸，如果攪拌時(shí)間過短，就會(huì)導(dǎo)致絮凝不完全，絮凝率不理想。

圖4是攪拌時(shí)間對(duì)絮凝率的影響。隨著攪拌時(shí)間增加，絮凝率快速提高，攪拌時(shí)間達(dá)到20 min后，絮凝率增加速度放慢，攪拌時(shí)間達(dá)到40 min時(shí)絮凝率達(dá)到88.93%，繼續(xù)增加攪拌時(shí)間絮凝率反而有所降低。這說明在合適的剪切力范圍內(nèi)，隨著絮凝的完成，絮凝團(tuán)內(nèi)部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。陳曉燕等[10]研究表明，使用陽(yáng)離子淀粉絮凝劑收獲自養(yǎng)斜生柵藻攪拌10 min即可達(dá)到最高絮凝率，繼續(xù)攪拌將浪費(fèi)能源，試驗(yàn)所用攪拌時(shí)間較長(zhǎng)的原因是生物量高、發(fā)酵液成分極其復(fù)雜。因此，試驗(yàn)選擇攪拌時(shí)間40 min。

圖3 攪拌速率對(duì)絮凝率的影響

圖4 攪拌時(shí)間對(duì)絮凝率的影響

2.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，使用Design-Expert 8.0軟件對(duì)絮凝劑添加量、攪拌速率、攪拌時(shí)間3個(gè)變量進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)（見表1），以絮凝率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析（見表2），利用軟件進(jìn)行建立回歸模型，并選擇最優(yōu)變量。

通過軟件分析，進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，獲得回歸方程：絮凝率=89-0.75A-1.00B+0.00C+1.00AB+0.00AC+0.50BC-8.50A2-15.00B2-6.50C2?；貧w方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)的R2為98.72%，校正后的R2為97.09%，說明試驗(yàn)可靠度高，而變異系數(shù)C.V.值為2.29%，說明試驗(yàn)穩(wěn)定性強(qiáng)，試驗(yàn)操作可信，該回歸方程為絮凝法收集異養(yǎng)小球藻提供良好模型。

根據(jù)二次回歸模型繪制響應(yīng)面分析圖，如圖5所示。

表1 因素水平表

圖5 響面分析圖

圖6 絮凝前后對(duì)比

從表3可知，絮凝劑添加量、攪拌速率、攪拌時(shí)間對(duì)絮凝率影響均不太顯著，絮凝劑添加量、攪拌速率、攪拌時(shí)間各變量之間的交互作用不太明顯。二項(xiàng)式模型選擇的最優(yōu)變量為絮凝劑添加量2.0 g/L、300 r/min、攪拌時(shí)間40 min，此時(shí)理論絮凝率達(dá)到89%，根據(jù)最優(yōu)變量進(jìn)行驗(yàn)證，三次重復(fù)試驗(yàn)的平均結(jié)果為89.15%，與理論值僅相差0.17%，說明通過響應(yīng)面分析獲得的絮凝法收集工藝條件是可行的。從圖6可以看出，使用最佳條件進(jìn)行絮凝，在絮凝后異養(yǎng)小球藻在燒杯底部沉積明顯，收集效果較好，絕大部分細(xì)胞沉積，能夠滿足藻細(xì)胞收集要求。結(jié)果顯示發(fā)酵液中上部仍為不透明液體，原因在于培養(yǎng)基和流加補(bǔ)料均使用大量葡萄糖、酵母粉，滅菌以后培養(yǎng)基顏色為深褐色，高含油異養(yǎng)小球藻細(xì)胞為米黃色，因此在發(fā)酵中后期異養(yǎng)小球藻濃度較高時(shí)發(fā)酵液偏黃色，但藻細(xì)胞沉積后發(fā)酵液中上部仍殘留個(gè)別細(xì)胞、色素等物質(zhì)，不會(huì)像自養(yǎng)藻培養(yǎng)液絮凝后變得透明。

表3 方差分析結(jié)果

試驗(yàn)獲得的最佳工藝條件下絮凝率仍然比傳統(tǒng)離心法所得采收率低，這說明單一絮凝劑的絮凝效果比離心法差，這也是絮凝法在異養(yǎng)小球藻實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用相對(duì)較少的原因之一。彭超等[12]研究表明，復(fù)合絮凝劑選擇合適將產(chǎn)生明顯的協(xié)同作用，使絮凝率遠(yuǎn)高于單一絮凝劑，絮凝效果更好，將在后序試驗(yàn)中開展進(jìn)一步研究。

聚丙烯酰胺低毒，但丙烯酰胺單體會(huì)對(duì)動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷，如果收集到的藻粉用于生產(chǎn)保健品、餌料等產(chǎn)品，將影響產(chǎn)品質(zhì)量，因此，將在后序試驗(yàn)中進(jìn)一步研究低毒、無害的收集方法。

3 結(jié)論

由于發(fā)酵液成分復(fù)雜、雜質(zhì)過多，無機(jī)絮凝劑、霉菌吸附均對(duì)異養(yǎng)小球藻絮凝效果不太理想，有機(jī)絮凝劑顯示出較好的絮凝效果。通過單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面分析，獲得最優(yōu)變量：絮凝劑添加量2.0 g/L、300 r/min、攪拌時(shí)間40 min，在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，絮凝率達(dá)到89.15%，回歸分析和驗(yàn)證試驗(yàn)均表明響應(yīng)面分析結(jié)果合理、可信。

復(fù)合絮凝劑絮凝效果更理想，有待于進(jìn)一步研究，但在發(fā)酵液中添加絮凝劑將改變上清液、藻粉的物質(zhì)構(gòu)成，對(duì)上清液處理、藻粉制取工藝造成不利影響。新興的磁性粒子絮凝、藻細(xì)胞自絮凝等絮凝工藝具有不改變發(fā)酵液物質(zhì)構(gòu)成、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，有待于跟蹤研究進(jìn)展，進(jìn)行相應(yīng)技術(shù)儲(chǔ)備，低成本、高效率絮凝法新工藝的不斷涌現(xiàn)將推動(dòng)絮凝法收集微藻細(xì)胞的廣泛應(yīng)用，進(jìn)而推動(dòng)微藻產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。