張增帥，郭俊花，馬欣，成少寧，許先猛

運城職業(yè)技術(shù)大學(xué)健康學(xué)院（運城 044000）

水果采后極易受微生物污染，導(dǎo)致成品率下降，經(jīng)濟損失[1-5]。有研究表明，造成水果常見腐敗微生物有擴展青霉、灰葡萄孢、鏈格孢抑菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等[6-10]。采用化學(xué)防腐劑是常用方式，化學(xué)防腐劑會造成果蔬農(nóng)殘量增加風(fēng)險，食藥同源植物安全性高，其對果蔬保鮮效果的研究成為熱點。食藥同源植物對細菌和霉菌的抑制作用均有報道，但對其抑制霉菌和細菌的共同作用研究較少。

選取丁香、槐米、魚腥草、葛根、薤白、荷葉、薄荷、決明子、茯苓、菊花等食藥同源植物，探索這些食藥同源植物提取液對擴展青霉、灰葡萄孢、鏈格孢抑菌3種霉菌和大腸桿菌、金黃色葡萄球菌2種細菌抑菌的抑制效果，并將其應(yīng)用于藍莓的防腐保鮮上，以期為新型綠色安全食品保鮮劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試食藥同源植物材料均購于臨猗百草堂醫(yī)藥有限公司，種類及所供部位見表1。供試菌種名稱及來源見表2。

土豆（運城美特好超市）；酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；葡萄糖、氯化鈉（廣東光華化學(xué)試劑廠）。其他試劑均為分析純。

表1 供試食藥同源植物材料

表2 供試菌種

1.2 儀器設(shè)備

CPA124S型電子分析天平（德國賽多利斯有限公司）；FW100高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；LDZX-50KBS高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；SPX-250智能生化培養(yǎng)箱（寧波海曙賽福實驗儀器廠）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 食藥同源植物提取液的制備

陰干的食藥同源備用植物于50 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，材料粉碎并過80目篩得植物粉末。分別取100 g植物粉末于1 L燒杯中，用600 mL乙醇浸泡24 h后55 ℃ 800 W超聲提取1 h，抽濾，將濾液濃縮后定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度1.0 g/mL植物提取液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 供試霉菌菌絲抑菌效果

將3.0 mL植物提取液加到融化的PDA培養(yǎng)基中，空白對照為3.0 mL 70%乙醇。用直徑6 mm打孔器取活化后的霉菌菌塊，用接種針轉(zhuǎn)接至加植物提取液的PDA培養(yǎng)基中間，28 ℃培養(yǎng)5 d，十字交叉法測定抑菌圈直徑，平行3次，計算植物提取液對霉菌菌絲的抑制效果。

式中：dc為對照菌落直徑，mm；dT為處理菌落直徑，mm；6為接種菌塊的直徑，mm。

1.3.3 供試菌霉菌最小抑菌濃度及最小殺菌濃度測定

將植物提取液稀釋制作成質(zhì)量濃度為100，50.0，25.0，12.5，6.25和3.13 mg/mL的PDA培養(yǎng)基，空白對照為50%乙醇PDA培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基凝固后，取200 μL濃度達到106～108CFU/mL菌懸液于培養(yǎng)基上，用無菌涂布棒涂布均勻，每個濃度做3個平行。72 h后觀察，以無菌生長的培養(yǎng)皿的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC），將無菌生長的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)96 h后觀察，以無菌生長的培養(yǎng)皿的最低濃度為最小殺菌濃度（MBC）。

1.3.4 植物提取液對供試霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用

采用稀釋平板計數(shù)法[11]測定植物提取液對供試霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用。將植物提取液濃度釋制作成濃度為MIC，1/2 MIC，1/4 MIC，1/8 MIC和1/16 MIC的PDA培養(yǎng)基，制備106～108CFU/mL霉菌菌懸液，稀釋至約100 CFU/mL，吸取20 μL涂布植物提取液培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)96 h，每個處理重復(fù)3次，培養(yǎng)完成后進行菌落計數(shù)，涂布植物提取液平板菌落數(shù)記為C，對照組菌落總數(shù)記為C0，計算抑制率。

1.3.5 供試細菌抑菌效果

采用濾紙片法測定11種植物提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果。在制好的LB培養(yǎng)基上，加入100 μL濃度106～108CFU/mL菌懸液，用無菌涂布棒涂布均勻，在培養(yǎng)皿上放置直徑為0.6 cm無菌濾紙片，每個濾紙片加入20 μL植物提取液，采用十字交叉法測定濾紙片的抑菌圈大小，每個處理重復(fù)3次。

1.3.6 供試細菌MIC和MBC測定

將植物提取液稀釋制作成質(zhì)量濃度分別為120，60.0，30.0，15.0和7.50 mg/mL的LB培養(yǎng)基，空白對照采用50%乙醇PDA培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基凝固后，取200 μL濃度達到106～108CFU/mL菌懸液于培養(yǎng)基上，用無菌涂布棒涂布均勻，每個濃度做3個平行，24 h后觀察，以無菌生長的培養(yǎng)皿的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC），將無菌生長的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)168 h后觀察，以無菌生長的培養(yǎng)皿的最低濃度為最小殺菌濃度（MBC）。

1.3.7 供試細菌生長曲線測定

調(diào)整LB液體培養(yǎng)基中植物提取液的質(zhì)量濃度為MIC和1/2 MIC，分別接入含有106～108CFU/mL金黃色葡萄球菌的菌懸液各200 μL，37 ℃、120 r/min連續(xù)培養(yǎng)24 h，每隔1 h取樣測定OD600，以不含植物提取液的LB液體培養(yǎng)基為對照，每組3個平行[12]。

1.3.8 丁香對藍莓果實腐爛率影響

挑選顏色、大小統(tǒng)一，無機械損傷和病蟲斑的藍莓果實進行腐爛率測定[1]。藍莓果置于MIC濃度丁香提取液中浸泡5 min，藍莓果實與浸泡液固液比為1︰2（g/mL），以無菌水浸泡處理作對照，晾干后置于塑料盒中并密封完好，平均每盒果實50個，置于溫度4±0.5 ℃冰箱貯藏，每7 d取1次樣直到第42天，每階段取3組重復(fù)樣，測定腐爛率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用WPS和SPSS 19.0軟件計算、作圖及數(shù)據(jù)處理，p＜0.05為有顯著性差異，p＜0.01為有極顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 食藥同源植物對供試霉菌的抑菌效果

2.1.1 食藥同源植物對供試霉菌菌絲抑菌效果

由表3可知，丁香對3種供試霉菌抑菌效果最好，抑菌率均達100%。葛根、薤白、薄荷和決明子對青霉的抑菌效果均超過50%，薄荷達到67.51%；薄荷、天麻、決明子和菊花對鏈格孢的抑菌效果均超過50%，薄荷達到76.58%。選取丁香和薄荷進行最小抑菌濃度及最小殺菌濃度的測定。

表3 食藥同源提取物對3種供試霉菌的抑制效果

2.1.2 供試菌霉菌最小抑菌濃度及最小殺菌濃度

由表4可知，丁香對擴展青霉、灰葡萄孢和鏈格孢的MIC均為3.13 mg/mL，MBC分別為3.13，6.25和3.13 mg/mL。薄荷對擴展青霉和鏈格孢的MIC均為100 mg/mL。

表4 食藥同源提取物對供試霉菌的MIC、MBC測定結(jié)果 mg·mL-1

2.1.3 植物提取液對供試霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用

由表5可知，3.13 mg/mL丁香提取液對3種霉菌孢子萌發(fā)抑制率均為100%，丁香提取液濃度與3種霉菌的孢子萌發(fā)抑制率均呈正相關(guān)。

2.2 食藥同源植物對供試細菌的抑菌效果

2.2.1 植物提取液對2種細菌的抑菌效果

從表6可知，丁香和天麻對大腸桿菌有一定抑制作用，抑菌圈直徑分別為17.77和11.67 mm，其他植物提取液均無作用；丁香、葛根和茯苓對金黃色葡萄球菌無抑制作用，其他植物提取液對其均有一定作用。天麻和魚腥草對黃色葡萄球菌抑制效果顯著，抑菌圈直徑分別為31.77和29.00 mm。選取天麻和魚腥草研究其對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度及最小殺菌濃度。

表5 丁香對3種霉菌的孢子萌發(fā)的抑制效果 %

表6 植物提取液對2種細菌的抑菌效果 mm

2.2.2 植物提取液對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC

由表7可知，天麻對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為30.0和60.00 mg/mL，魚腥草對金黃色葡萄球菌MIC和MBC分別為60.0和120 mg/mL。天麻對金黃色葡萄球菌抑菌效果優(yōu)于魚腥草。2.2.3 藥食同源植物提取液對金黃色葡萄球菌生長狀況的影響

表7 植物提取液對金黃色葡萄球菌的MICs和MBCs mg·mL-1

由圖1可知，添加魚腥草和天麻的金黃色葡萄球菌生長曲線與空白組變化明顯，OD600值顯著降低，魚腥草和天麻添加量為MIC時，延長期均延長，對數(shù)期變短。這可能是因為魚腥草提取物主要通過破壞細菌細胞壁，造成細胞內(nèi)容物泄漏來實現(xiàn)抑菌功效[13]；天麻中抑菌蛋白發(fā)揮抑菌作用實現(xiàn)抑菌功效[14]。

圖1 不同濃度藥食同源植物提取液對金黃色葡萄球菌生長狀況的影響

2.3 藥食同源植物提取液對藍莓果實腐爛率影響

藍莓果置于質(zhì)量濃度3.13 mg/mL丁香和30.0 mg/mL天麻混合液中浸泡5 min，藍莓果實與浸泡液固液比為1︰2，以無菌水浸泡處理作對照，測定藍莓腐爛率，結(jié)果見表6。前21 d處理組與對照組沒有顯著差異，到28 d以后處理組與對照組具有極顯著差異，說明丁香和天麻混合液結(jié)合4 ℃冷藏，能夠有效降低藍莓腐爛率，延長藍莓保質(zhì)期。

表8 丁香和天麻復(fù)合液對藍莓腐爛率的影響 %

3 討論與結(jié)論

試驗探究11種食藥同源植物提取液對水果常見的腐敗菌擴展青霉、灰葡萄孢、鏈格孢抑菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果。丁香對3種霉菌的抑制效果顯著，抑菌率均達到100%，且MIC濃度對3種霉菌孢子萌發(fā)均100%抑制，這與彭方杰等[15]、付振喜[16]研究結(jié)果一致；薄荷對擴展青霉和鏈格孢的抑菌效果次于丁香但優(yōu)于其他植物，與余興等[17]研究結(jié)果一致。丁香和天麻對大腸桿菌有一定抑制作用，其他植物均沒有抑制效果。天麻和魚腥草對金黃色葡萄球菌抑制效果顯著。以藍莓腐敗率為指標(biāo)，藍莓置于質(zhì)量濃度3.13 mg/mL的丁香和30.0 mg/mL的天麻混合液后浸泡5 min，晾干后在4 ℃條件下28 d后腐敗率極顯著低于對照組。

試驗結(jié)果為食藥同源提取液在果實采后抑菌劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)，對食藥同源植物的提取方式、抑菌機理及在果蔬中應(yīng)用等方面有待進一步研究。