吳興雨，曹闊，孫凱楊，姚玥，孫豐梅, *

1. 河北北方學(xué)院食品科學(xué)系（張家口 075000）；2. 河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全分析檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（張家口 075000）；3. 河北北方學(xué)院經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院（張家口 075000）

谷子起源于黃河流域，是禾本科狗尾草屬植物，是我國重要的糧食作物之一。我國谷子的種植面積廣且產(chǎn)量高，谷子產(chǎn)量占全世界的80.0%[1]。研究表明谷子的營養(yǎng)價(jià)值十分豐富，其中蛋白質(zhì)含量為9.28%～15.8%，碳水化合物含量約為70.0%，脂肪含量為3.8%～5.2%[2-3]。小米由谷子脫殼而成，其包含豐富的蛋白質(zhì)、油脂、多糖、膳食纖維、多種維生素等人體所必需的營養(yǎng)物質(zhì)[4-5]。小米谷糠是谷子加工成小米時(shí)所產(chǎn)生的麩皮、糊粉層、小米碎渣和小米胚芽等副產(chǎn)物。研究顯示谷糠中包含蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、膳食纖維、維生素、礦物元素、硫胺素、核黃素、尼克酸及多種不飽和脂肪酸等營養(yǎng)成分[6]。

蛋白質(zhì)在食品加工中的應(yīng)用不僅依賴于營養(yǎng)性，功能性質(zhì)也很重要。例如在多油食品中加入蛋白質(zhì)可使口感變得清爽；在烘焙食品中加入蛋白質(zhì)可保留一定水分，使其變得軟嫩并保持其風(fēng)味[7]。蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)是指使食品出現(xiàn)人們所期望的特征作出貢獻(xiàn)的蛋白質(zhì)物理性質(zhì)。蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)主要分為3類：蛋白質(zhì)的水合性質(zhì)、蛋白質(zhì)的凝膠性、蛋白質(zhì)的表面性質(zhì)。其中蛋白質(zhì)的水合性質(zhì)主要是分散性、溶解性、吸水性、吸油性、持水性等，表面性質(zhì)主要是起泡性和乳化性[3]。對小米谷糠蛋白的起泡性、乳化性、溶解性研究較少，但對小米谷糠蛋白的抗肝損傷和抑制腫瘤效果有肯定意義的研究。許潔[8]建立CCl4和過量酒精對小鼠肝損傷的模型，用添加高劑量小米谷糠清蛋白的飼料喂養(yǎng)，通過切片觀察，證明了小米谷糠清蛋白對肝損傷具有抑制作用。于書佳等[9]利用氨基比林-NaNO2誘導(dǎo)小鼠發(fā)生肝損傷及前期癌變，用菠蘿蛋白酶水解提取的小米谷糠蛋白添加到小鼠的飼料中，試驗(yàn)表明在添加量為10 g/（kg·d）時(shí)，其對小鼠的肝損傷及前期癌變有抑制作用，證明小米谷糠蛋白在保健品和抗腫瘤藥品方面的開發(fā)潛力。

試驗(yàn)旨在研究小米谷糠蛋白的營養(yǎng)組成和功能性質(zhì)分析，為小米谷糠蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米谷糠（張雜谷13號(hào)，河北巡天農(nóng)業(yè)科技有限公司）；堿性蛋白酶（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；G250-考馬斯亮藍(lán)（北京亞米生物科技有限公司）；牛血清蛋白（北京博爾西科技有限公司）；G-100葡聚糖凝膠（4～150 kDa，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院商城分院）；無水乙醇（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；鹽酸（北京化工廠）；氫氧化鈉（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；磷酸（上海譜振生物科技有限公司）；正己烷（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；氯化鈣、氯化鈉、氯化鎂（濰坊坤陽化工有限公司）?；瘜W(xué)試劑純度均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BCD-249CF美菱電冰箱（合肥美菱股份有限公司）；79-1磁力加熱攪拌器（常州澳華儀器有限公司）；JA-1003N電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；JYL-C50T九陽料理機(jī)（九陽股份有限公司）；HC-3018高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；PHS-3C酸度計(jì)（上海佑科儀表有限公司）；A-25高速分散器（上海喬榮電子科技有限公司）；UV-76紫外可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；BDF86V158低溫冷凍箱（濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司）；GZLYZ真空冷凍干燥機(jī)（北京松源華興生物科技有限公司）；NB-100D超聲器（鄭州南北儀器設(shè)備有限公司）；5 kDa 15 mL內(nèi)管×50 mL外管超濾離心管（密理博中國有限公司）；50 mm×500 mm凝膠柱/四氟活塞標(biāo)準(zhǔn)口（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院商城分院）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小米谷糠基本成分測定

小米谷糠中的水分、蛋白質(zhì)、灰分、油脂和淀粉含量測定分別參考GB 5009.3—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》[10]、GB/T 5009.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》[11]、GB/T 5009.4—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定》[12]、GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的測定》[13]和GB/T 5009.9—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中淀粉的測定》[14]。

1.3.2 谷糠蛋白制備及純化

使用料理機(jī)粉碎小米谷糠，過40目篩，在85 ℃恒溫干燥箱中干燥4 h。加入5倍正己烷浸泡，干燥后樣品，密封后在35 ℃恒溫箱中放置12 h，后倒掉上層溶劑，重復(fù)操作2次。自然干燥后即得脫脂小米谷糠。

稱取20 g小米谷糠，加入200 mL蒸餾水，放入超聲波清洗器中超聲30 min，加速蛋白質(zhì)溶出[7]。再加入堿性蛋白酶，在60 ℃、pH 10的條件下水浴3 h，100 ℃滅酶，冷卻至室溫，以4 000 r/min離心15 min，取沉淀物真空干燥即為谷糠蛋白。

由于提取液的量較大，故采用超濾管進(jìn)行脫鹽以濃縮蛋白質(zhì)[15]。取20 mL溶液置于超濾離心管中，轉(zhuǎn)速為2 000 r/min，離心15 min。

采用葡聚糖凝膠柱進(jìn)行蛋白質(zhì)純化，參考文獻(xiàn)[19]的方法制備葡聚糖凝膠柱。加入100 mL蛋白液后進(jìn)行恒流洗脫。每5 min收集1次洗脫液，并用考馬斯亮藍(lán)法測定洗脫液是否含有蛋白質(zhì)，若無則停止洗脫。

將上述洗脫液進(jìn)行收集，調(diào)制等電點(diǎn)，過濾收集沉淀，于-40 ℃冷凍沉淀物12 h，在低溫冷凍干燥機(jī)干燥48 h，得到純化后小米谷糠蛋白樣品，用凱氏定氮法測定蛋白純度。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量測定

采用考馬斯亮藍(lán)法測定提取液中蛋白質(zhì)的含量，具體操作方法參照SN/T 3926—2014《出口乳、蛋、豆類食品中蛋白質(zhì)含量的測定-考馬斯亮藍(lán)法》[16]。

1.3.4 氨基酸分析

委托內(nèi)蒙古農(nóng)牧漁業(yè)生物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行小米谷糠蛋白的氨基酸組分分析。

1.3.5 等電點(diǎn)測定

取1 g制備的小米谷糠蛋白樣品溶解于5 mL超純水中，調(diào)節(jié)溶液酸堿度pH 7，過濾，以4 000 r/min離心10 min后取上清液，用0.1 mol/L鹽酸調(diào)pH至沉淀量最大，此時(shí)pH即為小米谷糠蛋白的等電點(diǎn)。

1.3.6 功能性質(zhì)測定

將小米谷糠蛋白與PBS磷酸緩沖液配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%分散系，調(diào)節(jié)溶液酸堿度梯度pH 3，4，5，6，7，8，9和10，于25 ℃攪拌1 h，以2 000 r/min離心20 min[15]，用考馬斯亮藍(lán)法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)的溶解度按式（1）計(jì)算。

金屬離子對小米谷糠蛋白溶解性的影響。分別配制1 L NaCl、MgCl2、CaCl2溶液，濃度分別為0.1，0.8和1.2 mol/L。加入1 g小米谷糠蛋白，調(diào)節(jié)pH 2，3，4，5，6，7，8，9和10，離心速度2 000 r/min，離心半徑20 cm，離心20 min。用考馬斯亮藍(lán)法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量。

小米谷糠蛋白起泡性及穩(wěn)定性測定。分別配制1，3，5，7和9 g/mL小米谷糠蛋白懸浮液，取25 mL溶液，用高速分散器10 000 r/min攪拌3 min，記錄攪打后的總體積和泡沫體積。隨后靜置樣品10 min，記錄泡沫體積。起泡性及穩(wěn)定性按式（2）和（3）計(jì)算。

小米谷糠蛋白乳化性及穩(wěn)定性測定。配制30 mL 1，3，5和7 g/100 mL不同質(zhì)量濃度梯度的小米谷糠蛋白懸浮液，用高速分散器10 000 r/min攪打30 s，加入5 mL花生油，攪打30 s，加入5 mL花生油，攪打90 s，攪打完成后測定此時(shí)的乳濁液體積。將乳濁液在2 000 r/min離心5 min，測量此時(shí)乳化層的體積。將離心后的混合液在85 ℃水浴鍋中加熱15 min，冷卻后在2 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，測定此時(shí)的乳化層體積。乳化力和乳化穩(wěn)定性按式（4）和（5）計(jì)算。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 小米谷糠基本成分測定

經(jīng)測定，小米谷糠中蛋白質(zhì)、油脂、水分、淀粉、灰分含量分別為8.69%，2.41%，12.37%，27.55%和6.75%。

2.2 考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別配制系列濃度梯度的牛血清蛋白質(zhì)量，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=5.397 7x-0.809 7，R2=0.990 2，如圖1所示。

圖1 考馬斯亮藍(lán)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 小米谷糠蛋白純度

采用超濾管濃縮法可得到濃縮率70%樣品。經(jīng)葡聚糖凝膠柱純化后樣品純度為82.61%。許潔[8]采用超濾膜技術(shù)提純蛋白質(zhì)，提純后的蛋白質(zhì)純度為73.61%，試驗(yàn)提純蛋白質(zhì)采用凝膠層析法提純，提純后的純度為82.61%，初步證明凝膠層析法提純蛋白質(zhì)優(yōu)于超濾膜技術(shù)。

2.4 氨基酸測定

谷糠清蛋白氨基酸測定結(jié)果見表1。含量最高的是谷氨酸，最低的是色氨酸，從測定結(jié)果來看，必需氨基酸種類齊全。小米谷糠清蛋白中含有8種必需氨基酸，達(dá)到全價(jià)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)，且必需氨基酸占到氨基酸總量的36.3%，除苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的（ASS）值＜100以外，其他必需氨基酸的ASS值＞100。小米谷糠清蛋白中8種必需氨基酸的含量接近聯(lián)合食品標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃（FAO/WHO）推薦的標(biāo)準(zhǔn)模式。小米谷糠中的組氨酸含量為205，大于（FAO/WHO）推薦的170，并且有低致敏性，非常適合作為嬰幼兒的蛋白營養(yǎng)補(bǔ)劑，可作為嬰幼兒奶粉或保健食品的蛋白質(zhì)類補(bǔ)充劑。小米谷糠清蛋白中蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的含量約22.1%，這類氨基酸具有減脂增肌的作用，可作為運(yùn)動(dòng)員的營養(yǎng)補(bǔ)劑。組氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、精氨酸、賴氨酸具有抗氧化活性的氨基酸占20%左右，這類氨基酸能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)與氨基酸的代謝。小米谷糠清蛋白氨基酸種類齊全，營養(yǎng)價(jià)值比較高，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

表1 小米谷糠清蛋白氨基酸分析結(jié)果

表2 小米谷糠蛋白中必需氨基酸營養(yǎng)價(jià)值評定mg/100 g

2.5 小米谷糠蛋白溶解性分析

小米谷糠蛋白的溶解度隨溶液pH的變化曲線如圖2所示。pH 4～6時(shí)，溶解度較低，說明越接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，溶解度越低。pH＜4或pH＞5時(shí)，蛋白質(zhì)分子所帶的電荷沒有達(dá)到平衡的狀態(tài)，水合性質(zhì)增強(qiáng)，蛋白質(zhì)溶解度隨之增加。在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的溶液中蛋白質(zhì)發(fā)生解離，溶解性隨之升高，但此時(shí)溶解度已是分子解離后蛋白質(zhì)濃度。

2.6 金屬離子對小米谷糠蛋白溶解性的影響

不同濃度鹽溶液對小米谷糠清蛋白溶解度見圖3。谷糠蛋白分別溶解在0.1 mol/L的Na+、Mg2+、Ca+溶液中，在相同pH下，Na+對谷糠蛋白的溶解性比Mg+、Ca+影響要小，即在0.1 mol/L的Na+溶液中溶解性高于同等濃度的Mg+、Ca+溶液。整體來看，不論是哪一種金屬離子，pH接近等電點(diǎn)時(shí)，蛋白的溶解性均較差。pH偏離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解性升高，尤其是在堿性環(huán)境下，隨著pH升高，蛋白質(zhì)的溶解性快速提升。離子濃度為0.8 mol/L時(shí)，其對谷糠蛋白溶解性的影響總體趨勢與離子濃度0.1 mol/L時(shí)一致，但無論是哪一種金屬離子，在相同pH下，谷糖蛋白的溶解性均小于濃度為0.1 mol/L時(shí)，說明鹽離子濃度增大能夠降低谷糠蛋白在水中的溶解性。

圖2 pH對小米谷糠清蛋白溶解性影響

圖3 不同濃度鹽溶液對小米谷糠清蛋白溶解性影響

2.7 小米谷糠蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性分析

由圖4可知，蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%時(shí)，起泡力達(dá)到最大，為193%。隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的增加，起泡性反而降低?？赡苁怯捎谛∶坠瓤返鞍踪|(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，使溶液黏度過高，影響了起泡的產(chǎn)生。隨著小米谷糠清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，起泡穩(wěn)定性液隨之增加。起泡穩(wěn)定性呈現(xiàn)一直增加的趨勢，但試驗(yàn)中小米谷糠蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)取值可能沒有達(dá)到起泡穩(wěn)定性的最大值。小米谷糠蛋白的起泡力和起泡穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)的濃度密切相關(guān)，這是因?yàn)殡S著蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的升高，黏度也會(huì)隨之升高，會(huì)更加容易形成水膜，但黏度過高，則不容易形成水泡。起泡穩(wěn)定性主要和攪打后形成的水膜穩(wěn)定性有關(guān)，蛋白質(zhì)濃度升高時(shí)，溶液的黏度增大，水膜形成的穩(wěn)定性更好，不容易破裂。蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%時(shí)達(dá)到最大值之后，隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，黏度升高，起泡力降低。起泡穩(wěn)定性則隨著蛋白質(zhì)濃度升高而升高。在食品工業(yè)中最常使用的蛋白是大豆蛋白，計(jì)曉曼等[20]研究發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶改性后大豆蛋白的起泡能力為217.50%，泡沫穩(wěn)定性為93.10%。試驗(yàn)研究得到的谷糠蛋白的最優(yōu)起泡能力和起泡穩(wěn)定性結(jié)果為193%和73%。此功能性質(zhì)比之大豆蛋白略低，但也可應(yīng)用于食品工業(yè)，如可在糖霜和烘焙食品中作為發(fā)泡劑使用。

圖4 小米谷糠清蛋白濃度對起泡力和泡沫穩(wěn)定性的影響

2.8 小米谷糠谷蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性分析

乳化性是蛋白質(zhì)重要的加工功能特性之一，蛋白質(zhì)的乳化特性的存在是由于其內(nèi)部存在著親油和親水基團(tuán)，乳化穩(wěn)定性也與蛋白質(zhì)中的親水和親油基團(tuán)相關(guān)[20]。由圖5可得，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5%時(shí)，乳化力為51.3%，在此之前，乳化力穩(wěn)定性隨之升高；蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5%之后，乳化力變化不明顯?？紤]到成本和產(chǎn)量情況，小米谷糠蛋白在實(shí)際中的應(yīng)用應(yīng)選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%作為適宜乳化濃度。隨著蛋白質(zhì)濃度升高，乳化穩(wěn)定性也隨之增高，但增高的趨勢趨于平緩。小米谷糠蛋白的濃度升高對乳化穩(wěn)定性有促進(jìn)作用，但促進(jìn)效果越來越小。王喜波[21]研究發(fā)現(xiàn)均質(zhì)后的大豆蛋白乳化性為50.3%，和小米谷糠蛋白基本一致，說明在乳化性方面小米谷糠蛋白具有和大豆蛋白相同的應(yīng)用價(jià)值，如可以在肉制品中作乳化劑使用，在高湯內(nèi)作乳化劑和增稠劑使用。

圖5 小米谷糠清蛋白濃度對乳化力和乳化穩(wěn)定性影響

3 結(jié)論

小米谷糠蛋白具有巨大的利用價(jià)值，若能夠成功利用并且投入生產(chǎn)，不僅是一筆巨大財(cái)富，更能減少資源浪費(fèi)，貫徹可持續(xù)發(fā)展觀。試驗(yàn)對小米谷糠蛋白的一些組成成分進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：小米谷糠中蛋白質(zhì)、油脂、水分、淀粉、灰分含量分別為8.69%，2.41%，12.37%，27.55%和6.75%。選用超濾管離心和凝膠層析法純化谷糠清蛋白，經(jīng)測定小米谷糠清蛋白的純度為82.61%，對比其他文獻(xiàn)的試驗(yàn)結(jié)果，此方法得到的蛋白質(zhì)純度比較理想。小米谷糠清蛋白經(jīng)氨基酸分析測定，其中必需氨基酸含量占到氨基酸總量的36.3%，除苯丙氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的含量稍微低于FAO/WTO推薦值外，其他必需氨基酸都符合標(biāo)準(zhǔn)，組氨酸是嬰幼兒所必需的氨基酸，其AAS值為205，大于（FAO/WHO）推薦的170。通過等電點(diǎn)沉淀法得出小米谷糠蛋白的等電點(diǎn)為pH 4.4，小米谷糠蛋白的溶解性、起泡性和乳化性良好，適用于食品工業(yè)中。