黎莉，于德涵，蘇適，王廣慧

綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院（綏化 152061）

葛根[Puerɑriɑ lobɑtɑ（Willd.）Ohwi]為豆科植物野葛的干燥根[1-2]，我國葛根植物資源豐富，具有數(shù)量、質(zhì)量等經(jīng)濟(jì)價值的優(yōu)勢，是我國傳統(tǒng)的天然中藥材[3]，富含淀粉、氨基酸、植物蛋白，黃酮類物質(zhì)和維生素等成分。葛根中主要活性成分是葛根素，其化學(xué)本質(zhì)屬于異黃酮類化合物[4]具有較高的藥用價值和保健作用，研究表明葛根素對心腦血管疾病[5]、抗炎癥[6]、肥胖[7]和微循環(huán)障礙[8]等都具有一定的治療和改善效果。因此，葛根素的含量可以作為葛根提取物的質(zhì)量評價指標(biāo)。

傳統(tǒng)提取葛根素的方法存在耗時長、工藝復(fù)雜、溶劑用量大、純化難等缺陷。微波輔助萃取法是提取天然產(chǎn)物的有效方法，微波具有較強(qiáng)的穿透和加熱能力，能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)部大量產(chǎn)熱導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，顯著提高細(xì)胞內(nèi)成分的溶出速度，縮短提取時間，產(chǎn)品易純化，并能有效保護(hù)天然產(chǎn)物功效[9]。傳統(tǒng)的微波萃取法一般選用甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙醚等有機(jī)溶劑，傳統(tǒng)溶劑有較強(qiáng)的揮發(fā)性或毒性，給天然產(chǎn)物的提取和利用帶來了極大的不便和環(huán)境污染問題。離子液體（ionic liquid）是一種新型的綠色溶劑，與傳統(tǒng)有機(jī)劑相比，溶解能力強(qiáng)，熱穩(wěn)定性好、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、不易揮發(fā)且可重復(fù)利用[10-11]，能溶解纖維素并破壞植物細(xì)胞壁，并能很好的吸收微波輻射。因此，研究利用離子液體結(jié)合微波輔助提取葛根中的葛根素，通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化葛根素的提取工藝。目前，葛根的應(yīng)用主要集中于食品原料的粗開發(fā)，產(chǎn)品附加值較低，制約了葛根資源的開發(fā)和利用，針對葛利用提供一個高效、快捷的提取方法，并能保持葛根素的活性和產(chǎn)品純度，為合理開發(fā)葛根資源提根素的提取方面的研究較少，該研究為葛根素的有效供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

葛根：北京同仁堂參茸中藥制品有限公司。

葛根素標(biāo)準(zhǔn)品，純度98%，北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；[Bmim]Cl（1-正丁基-3-甲基咪唑氯），純度97%，國藥試劑有限公司；1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），分析純，國藥試劑有限公司；抗壞血酸，分析純，國藥試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

MKX-E1微波萃取儀，青島邁可威微波創(chuàng)新科技有限公司；TDZ5-WS離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；DZF-6050E真空干燥箱，無錫瑪瑞特科技有限公司；UV1800PC紫外分光光度計，上海向帆儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)文獻(xiàn)[12]方法，稱取葛根素對照品5 mg，加少量乙醇溶解并加蒸餾水于50 mL容量瓶中定容，配制成0.1 mg/mL的葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.5和2.0 mL分別置于10 mL容量瓶，用95%乙醇定容至刻度線。在250 nm處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：X=6.820 6Y+0.210，R2=0.996 8。

1.2.2 葛根素的提取工藝及含量測定

葛根洗凈→60 ℃烘干→粉碎→過60目篩→稱取1.0 g葛根粉→微波輔助[Bmim]Cl的水溶液提?。?0℃）→葛根素提取液離心（30 min，3 000 r/min）→取上清液→測定葛根素含量。

式中：R為葛根素提取率，%；C為測得質(zhì)量濃度，μg/mL；V為定容體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；M為原料質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗方法

單因素試驗依次考察離子液體濃度（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mol·L-1）、料液比（1︰5，1︰10，1︰15，1︰20，1︰25和1︰30 g·mL-1）、提取時間（2，4，6，8，10和12 min）、微波功率（100，200，300，400，500和600 W）4個因素對葛根素提取率的影響結(jié)果，平行進(jìn)行3次試驗，在250 nm處測定吸光度，計算葛根素提取率。1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗方法

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，以葛根素的提取率為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行Box-Behnken試驗設(shè)計。選取離子液體濃度（A）、提取時間（B）、料液比（C）、提取溫度（D）4個變量，設(shè)計響應(yīng)面試驗，具體因素與水平設(shè)計見表1。

表1 微波輔助離子液體提取葛根素Box-Behnken因素設(shè)計與編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 離子液體濃度對提取率的影響

固定微功率350 W、提取時間 10 min、料液比1︰15 g/mL，分別在不同離子液體濃度下進(jìn)行提取，確定響應(yīng)面試驗離子液體濃度的優(yōu)化范圍，結(jié)果見圖1。

隨著離子液體濃度的增加，葛根素提取率明顯升高，當(dāng)[Bmim]Cl濃度高于1.0 mol/L時，葛根素提取率開始下降?？赡苁请x子液體濃度低，溶劑與葛根素類化合物接觸的概率小，故提取率低；但[Bmim]Cl濃度不斷增加會導(dǎo)致溶劑體系的黏度增大，降低溶劑滲透到植物組織的能力，阻礙了葛根素在溶液中的擴(kuò)散[13]。因此，選擇離子液體濃度0.8，1.0和1.2 mol/L作為響應(yīng)面試驗考察條件。

圖1 離子液體濃度對提取率的影響

2.1.2 微波功率對提取率的影響

固定離子液體濃度1.0 mol/L、提取時間 10 min、料液比1︰15 g/mL，分別在不同微波功率下進(jìn)行提取，確定響應(yīng)面試驗微波功率的優(yōu)化范圍，結(jié)果見圖2。

圖2 微波功率對提取率的影響

隨著微波功率的增大，葛根素的提取率先增大后降低，當(dāng)微波功率達(dá)到400 W時，葛根素提取率達(dá)到最大值，隨后開始下降。可能是微波功率過小，無法充分破壞葛根植物，葛根素不能完全釋放出來；微波功率過高也會加速植物細(xì)胞內(nèi)其他雜質(zhì)的溶出，葛根素提取率降低[14]。因此，微波功率選擇350，400和450 W作為響應(yīng)面試驗考察條件。

2.1.3 料液比對提取率的影響

固定離子液體濃度1.0 mol/L、微波功率400 W、提取時間10 min，分別在不同料液比下進(jìn)行提取，確定響應(yīng)面試驗微波功率的優(yōu)化范圍，結(jié)果見圖3。

葛根素提取率隨著料液比的增長而顯著增加，當(dāng)料液比為1︰20（g/mL）時，葛根素的溶解度和溶出速度達(dá)到最大，隨后開始下降。可能是料液比過小，提取液粘度較大，不能保證葛根素轉(zhuǎn)移到提取液中。料液比增大，大量溶劑會吸收一定的微波輻射，降低了細(xì)胞內(nèi)葛根素溶出量[15]。因此，料液比選擇1︰15，1︰20和1︰25 g/mL作為響應(yīng)面試驗考察條件。

2.1.4 提取時間對提取率的影響

固定離子液體濃度1.0 mol/L、微波功率400 W、提取時間10 min，分別在不同料液比下進(jìn)行提取，確定響應(yīng)面試驗提取時間優(yōu)化范圍，結(jié)果見圖4。

圖3 料液比對提取率的影響

圖4 提取時間提取率的影響

提取時間在2～12 min時，葛根素提取率隨著時間的延長迅速增加，提取8 min時，提取率達(dá)到最大值，隨后開始下降。可能是提取時間短，葛根中有效成分不能充分溶出；提取時間過長，微波產(chǎn)生高溫破壞有效成分[16]。因此，微波時間選擇6，8和10 min作為響應(yīng)面試驗考察條件。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化葛根素提取率的最佳工藝參數(shù)

2.2.1 回歸模型建立與顯著性檢驗

對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式回歸擬合，獲得葛根素提取率得與離子液體濃度、微波功率、料液比、提取時間4個因素的回歸方程為：Y=+4.22+0.068A+0.024B+0.065C-0.030D-7.250×10-3AB+3.500×10-3AC-4.75×10-3AD+0.018BC+0.023BD-1.000×10-3CD-0.36A2-0.16B2-0.075C2-0.22D2。

由表3可知，根據(jù)回歸方差分析顯著性檢驗，p＜0.000 1，說明回歸模型方程達(dá)到極顯著水平；失擬值p=0.055 1＞0.05，不顯著；回歸模型的決定性系數(shù)R2=0.988 8，模型校正系數(shù)R2Adj=0.977 6，說明回歸方程與試驗擬合良好，誤差小。由表3中F值可知，A和B對葛根素提取率影響極顯著（p＜0.01），C和D為模型顯著因素（p＜0.05）；交互項AB和BD對葛根素提取率影響顯著（p＜0.01）；二次項A2、B2、C2和D2對葛根素提取率影響極顯著（p＜0.01），其余各項對葛根素得率影響均不明顯。方差分析可知，即各因素對葛根素提取率影響的大小順序為：離子液體濃度＞料液比＞微波功率＞提取時間。因此，可用該模型分析和預(yù)測葛根中葛根素的提取工藝。

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 微波輔助離子液體提取葛根素回歸方程方差分析

2.2.2 數(shù)學(xué)模型及響應(yīng)面分析[17]

采用Design Expert 8.0軟件對離子液體濃度（A）、微波功率（B）、料液比（C）和提取時間（D）之間交互作用的關(guān)系進(jìn)行分析。響應(yīng)曲面和等高線的平緩與陡峭程度能夠直觀體現(xiàn)出反映各因素之間相互作用的強(qiáng)弱，提取參數(shù)交互作用對葛根素提取率的響應(yīng)曲面見圖5～圖10。

由圖5～圖10可知，隨著離子液體濃度、微波功率、料液比和提取時間的增大，葛根素的提取率先升高后降低，影響葛根中的葛根素提取率的各交互作用因素順序為AD＞AB＞BD＞BC＞CD＞AC。

圖5 離子液體濃度和微波功率對葛根素提取率的影響

圖6 離子液體濃度和料液比對葛根素提取率的影響

圖8 微波功率和料液比對葛根素提取率的影響

圖9 微波功率和提取時間對葛根素提取率的影響

圖10 提取時間和料液比對葛根素提取率的影響

2.2.3 驗證試驗

通過Design Expert 8.0對試驗?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行分析，求解方程得到最佳提取工藝為：離子液體濃度1.02 mol/L，提取時間7.87 min，料液比1︰21.97（g/mL），微波功率度407.92 W，理論預(yù)計值4.227%?？紤]操作條件，將實際工藝參數(shù)調(diào)整為離子液體濃度1.0 mol/L，提取時間8 min，料液比1︰22（g/mL），微波功率度400 W，在此條件下葛根素提取率的實際值為4.201%，與軟件模擬值預(yù)測誤差為0.61%，實際與模型符合良好，因此，證實了模型的有效性。

3 結(jié)論與討論

試驗研究采用微波輔助離子液體提取葛根中的葛根素。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，運用響應(yīng)面法對葛根素提取條件進(jìn)行優(yōu)化，建立回歸模型方程，得到最佳提取工藝參數(shù)為：離子液體濃度1.0 mol/L，提取時間8 min，料液比1︰22（g/mL），微波功率度400 W。此條件下葛根素的提取率為4.201%，較文獻(xiàn)已報道的提取率有較大提高[18]。與傳統(tǒng)溶劑提取方法相比，離子液體的極性可控，可對樣品高效、充分的萃取，所需溶劑少，離子液體可重復(fù)利用，是一種快速高效提取葛根素的理想方法。