游新勇，崔利華，周亞麗*，李瓊，張進(jìn)

安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院（安陽 455000）

藜麥（Chenopodium quinoɑ Willd），藜科藜屬植物，最早種植于南美洲的安第斯山區(qū)，具有特征性的高遺傳變異性，為不同地點(diǎn)和氣候條件下的生長提供必要的抵抗力[1-3]。由于藜麥的營養(yǎng)價(jià)值很高，在其他國家也廣泛引種種植。20世紀(jì)，我國西北地區(qū)開始引進(jìn)藜麥，隨后在青海、山西、甘肅、內(nèi)蒙古等高海拔地區(qū)廣泛種植。2017年，我國的藜麥種植面積超過9 000 hm2，每年的藜麥產(chǎn)量超過1.76萬 t[4-5]。

與普通谷物不同，藜麥?zhǔn)谴罅繝I養(yǎng)元素的極好來源，特別是含有大量蛋白質(zhì)和必需氨基酸。此外，藜麥還是維生素、礦物質(zhì)等微量營養(yǎng)元素[6-9]和酚類化合物[10-11]的良好來源。這些化合物具有很強(qiáng)的體外抗氧化能力，可預(yù)防癌癥、過敏、炎癥和心血管疾病等疾病發(fā)生[10,12-13]。近年來，由于功能性食品具有降低疾病的風(fēng)險(xiǎn)并發(fā)揮了促進(jìn)健康的作用，人們對(duì)這些新產(chǎn)品的興趣日益增加。藜麥的營養(yǎng)和開發(fā)利用價(jià)值也在最近幾十年得到廣泛認(rèn)識(shí)和重視[14]。

藜麥中含有豐富酚類物質(zhì)，如多酚、黃酮、皂苷等，這些化合物具有藥理學(xué)特性，可作為開發(fā)新功能性食品的主要成分[15]。有研究表明，藜麥多酚的含量與抗氧化力有關(guān)，而且藜麥中大部分多酚化合物在體外仍具有生物活性[7,16-17]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，藜麥葉片的提取的酚類物質(zhì)，具有很強(qiáng)地抗氧化活性、單體酚還可以抑制癌細(xì)胞的增殖[18-19]。但藜麥種子中多酚物質(zhì)的提取工藝及深入研究還鮮見報(bào)道。

試驗(yàn)采用乙醇作為提取劑提取藜麥多酚，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，使用福林肖卡比色法測(cè)定藜麥多酚的得率。采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥多酚提取工藝，對(duì)藜麥多酚深入的科學(xué)研究及藜麥產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青海藜麥（2018年購于山東老鄉(xiāng)生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，4 ℃保存）。

無水乙醇（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；沒食子酸（上海麥克林生化試劑有限公司）；福林酚試劑（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無水碳酸鈉（天津市北辰方正試劑廠）。試劑均為分析純。

電熱鼓風(fēng)干燥箱（HDG-9240，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；藥材粉碎機(jī)（FW-2，浙江武義屹立工具有限公司）；離心機(jī)（H1850，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；紫外光可見光分光光度計(jì)（T9，北京普析通用有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 藜麥提取液的制備

選用新鮮且較飽滿的青海藜麥種子為原料，清洗干凈去除雜質(zhì)、麩皮，干燥后采用粉碎機(jī)制粉。粉碎后用80目篩子篩分后得藜麥粉末，干燥避光保存。

準(zhǔn)確稱取1.00 g研磨好的藜麥粉末放入燒杯，加入提取溶液，設(shè)定超聲波功率，進(jìn)行提取。超聲波提取過后將提取液用蒸餾水定容至50 mL，離心（3 500 r/min，10 min），測(cè)定740 nm吸光度，計(jì)算藜麥粉末中多酚的得率，確定最佳的提取條件。

1.2.2 超聲波提取藜麥多酚的單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 提取時(shí)間的確定

準(zhǔn)確稱取6份1.00 g藜麥粉末，設(shè)置時(shí)間梯度范圍10～60 min，每組間隔為10 min，加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇，料液比1︰20（g/mL），提取溫度60 ℃，超聲波功率200 W條件下提取，將提取液定容至50 mL，離心，取上清，測(cè)定740 nm處吸光度，計(jì)算多酚得率。

1.2.2.2 料液比的確定

稱取5份1.00 g藜麥粉末，設(shè)置料液比梯度1︰10，1︰15，1︰20，1︰25和1︰30（g/mL）。加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇，溫度60 ℃，超聲波提取功率200 W，提取30 min。將提取液定容至50 mL，離心，取上清，測(cè)定740 nm處吸光度，計(jì)算多酚得率。

1.2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

取5份1.00 g藜麥粉末，分別用體積分?jǐn)?shù)40%，50%，60%，70%和80%乙醇，料液比1︰20（g/mL），溫度60 ℃，功率200 W，提取30 min。離心，取上清，測(cè)定740 nm處吸光度，計(jì)算多酚得率。

1.2.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥多酚的提取工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)Box-Behnken中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)[20-21]。藜麥多酚的提取得率為響應(yīng)值，并將提取時(shí)間（A）、料液比（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）作為自變量，優(yōu)化其提取工藝。自變量的試驗(yàn)水平用-1、0、1作為編碼，共設(shè)計(jì)15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)作為析因點(diǎn)，3個(gè)為區(qū)域的中心零點(diǎn)，用來估計(jì)試驗(yàn)誤差[22]。試驗(yàn)因素和水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表2。并用Minitab和Design-Expert軟件進(jìn)行對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸方差分析，得出其最優(yōu)提取工藝。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.2.3 藜麥總酚含量的測(cè)定[23]

準(zhǔn)確吸取藜麥粉末提取液1 mL，放入10 mL比色管中，加入0.5 mL福林酚，靜置反應(yīng)1 min，加入1.5 mL 10% Na2CO3，定容到刻度線，搖勻，避光靜置1 h，取出，在740 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)回歸方程計(jì)算藜麥多酚質(zhì)量濃度c，根據(jù)式（1）計(jì)算藜麥多酚得率。

式中：c為多酚質(zhì)量濃度，μg/mL；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；w為投料量，g。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：配置30 μg/mL沒食子酸溶液，分別吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL，于10 mL的比色管中，加入0.5 mL福林酚試劑，靜置1 min，加入1.5 mL 10% Na2CO3溶液，定容，搖勻，避光靜置1 h，在740 nm處測(cè)定其吸光度。吸光度作為縱坐標(biāo)，溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制回歸方程y=0.094 6x+0.113 3（R2=0.995 9）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)使用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 17.0軟件分別進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和顯著性分析（p＜0.05），使用Origin 2016軟件繪圖，采用Minitab和Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。所有的數(shù)據(jù)均為3個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥多酚提取工藝參數(shù)的確定

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)藜麥多酚得率的影響

由表2和圖1可知，提取時(shí)間在10～30 min范圍內(nèi)，藜麥多酚得率逐漸增大；提取時(shí)間到30 min時(shí)，藜麥多酚得率最大；隨著提取時(shí)間增加，藜麥多酚得率顯著下降。因此，選擇最佳的提取時(shí)間30 min。

表2 提取時(shí)間對(duì)藜麥多酚的影響

圖1 提取時(shí)間對(duì)藜麥多酚得率的影響

2.1.2 料液比對(duì)藜麥多酚得率的影響

由表3和圖2可知，隨著提取溶劑體積增大，料液比升高，藜麥多酚得率逐漸增大，料液比1︰20（g/mL）時(shí)，藜麥多酚得率達(dá)到最大值，顯著高于其他組（p＜0.05）；但隨著料液比增加，藜麥多酚得率顯著降低。因此，選擇最佳料液比1︰20（g/mL）。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藜麥多酚得率的影響

乙醇價(jià)格低廉，無毒，選擇性好，極性較高，對(duì)酚類物質(zhì)有較高的溶解度。由表4和圖3可知，在其他提取工藝相同的條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～60%范圍內(nèi)，藜麥多酚得率逐漸增加，并在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)，藜麥中多酚得率達(dá)到最大值；之后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，藜麥多酚得率顯著下降，這是由于在植物體內(nèi)，多酚物質(zhì)以氫鍵結(jié)合蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)完成傳質(zhì)過程，而高濃度乙醇會(huì)引起植物體內(nèi)蛋白質(zhì)變性，阻止多酚物質(zhì)的傳質(zhì)過程，降低多酚的提取量[24]。因此，選擇最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。

表3 料液比對(duì)藜麥多酚的影響

圖2 料液比對(duì)藜麥多酚提取得率的影響

表4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藜麥多酚的影響

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藜麥多酚提取得率的影響

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化藜麥多酚提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

通過Design-Expert分析軟件對(duì)藜麥提取條件進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析，響應(yīng)面分析見表5，方差分析結(jié)果見表6。

通過多遠(yuǎn)回歸分析，得到二次多項(xiàng)式擬合方程為Y=0.23-3.250×10-3A+2.0×10-2B-5.5×10-3C+2.5×10-4AB-7.5×10-4AC-5.25×10-3BC-0.015A2-0.019B2-0.011C2，其中，Y為藜麥多酚得率，A為提取時(shí)間（min），B為料液比（g/mL），C為乙醇體積分?jǐn)?shù)（%）。方程中，各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小和正負(fù)，分別反映各單因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度和影響方向[25]。

方差分析結(jié)果，如表6所示，多元二次模型p＜0.000 1，表明該回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)p=0.039 2＜0.05，說明回歸模型顯著；相關(guān)系數(shù)R2=0.987 9，說明該方程擬合度較好，可用該模型預(yù)測(cè)藜麥多酚得率。顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，A、C、A2、B2、C2極顯著影響藜麥多酚得率（p＜0.01），三因素兩兩交互中BC項(xiàng)p＜0.01，說明料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)兩因素的交互作用對(duì)藜麥多酚得率的影響極顯著；而B、AB、AC項(xiàng)對(duì)藜麥多酚得率影響不顯著（p＞0.05）。各因素對(duì)藜麥多酚得率的影響次序依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）＞提取時(shí)間（A）＞料液比（B），即乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藜麥多酚得率的影響程度最大。

表5 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果

表6 方差分析結(jié)果

根據(jù)回歸方程，繪制響應(yīng)面。由圖4（a）可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)處于0水平時(shí)，提取時(shí)間與料液比的交互作用較弱。比較圖4（a）和圖4（c）可知，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藜麥多酚得率的影響比提取時(shí)間大；由圖4（b）和圖4（c）可知，提取時(shí)間對(duì)藜麥多酚得率的影響比料液比大，這與方差分析的結(jié)果一致。

圖4 兩因素交互作用對(duì)多酚得率的響應(yīng)面圖

2.2.2 最佳提取工藝條件的確定

根據(jù)回歸方程計(jì)算，最佳的提取工藝參數(shù)為：提取時(shí)間31 min，料液比1︰20.45（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)57.2%。如表7所示，在此工藝條件下，藜麥多酚的最大提取得率百分比為0.227%。為了方便試驗(yàn)的進(jìn)行，最終確定最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1︰20（g/mL），提取時(shí)間30 min，并在這個(gè)條件下進(jìn)行3次相互平行試驗(yàn)，結(jié)果表明，藜麥多酚的提取得率為0.227%，試驗(yàn)結(jié)果與Minitab和Design-Expert軟件設(shè)計(jì)最優(yōu)的設(shè)計(jì)模型預(yù)測(cè)值相近，說明試驗(yàn)設(shè)計(jì)的模型，預(yù)測(cè)的試驗(yàn)參數(shù)比較精準(zhǔn)，證明結(jié)果合理可靠。

表7 藜麥多酚的最優(yōu)提取工藝

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，確定提取時(shí)間30 min、料液比1︰20（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%為最佳工藝條件，該條件下藜麥多酚得率最大為0.227%，與預(yù)測(cè)值誤差在1%內(nèi)，得到的回歸方程合理可靠，具有一定可行性。試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化藜麥多酚的提取工藝，對(duì)藜麥功能性食品研發(fā)具有指導(dǎo)意義。