韋婷，何靖柳，劉翔，張恒，楊冬雪，程金權(quán)

1. 雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)院（雅安 625000）；2. 四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院（成都 611130）

獼猴桃被譽(yù)為“果中之王”“天然植物維生素C”。紅陽(yáng)獼猴桃屬于獼猴桃科獼猴桃屬，是四川省蒼溪縣野生紅肉獼猴桃中選育出來(lái)的紅肉新品種，其果肉細(xì)嫩多汁，橫截面呈現(xiàn)放射性紅黃色條紋，十分美觀，且具有豐富的維生素C等，深受人們喜愛(ài)。在四川省大面積種植，形成蒼溪縣、都江堰市、蒲江縣等地為中心，以雅安市、安縣、北川縣、汶川縣等地為輻射區(qū)的獼猴桃產(chǎn)業(yè)帶。獼猴桃產(chǎn)量高又是呼吸躍變型水果，不易貯藏運(yùn)輸，各地都在積極探索果品深加工技術(shù)。因?yàn)楂J猴桃含糖分高，成熟后柔軟多汁，并且富含鈣、鐵、鉀等多種礦物質(zhì)及17種氨基酸[1]，加工成果酒后酒精度數(shù)不高、成分豐富，是近年研究較多的產(chǎn)品形式，并且已經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)。但在果酒生產(chǎn)貯藏中因原料中果膠、單寧、奎寧酸、酒石酸等含量高，使得產(chǎn)品存在出汁率低、酸澀味重及裝瓶后沉淀渾濁現(xiàn)象[2-4]，嚴(yán)重影響獼猴桃果酒的品質(zhì)和企業(yè)效益。根據(jù)果膠酶應(yīng)用于獼猴桃酒的研究報(bào)道，證實(shí)果膠酶能有效分解果實(shí)中果膠質(zhì)，從而提高果汁的出汁率[5-9]。但果膠酶應(yīng)用于紅陽(yáng)獼猴桃的報(bào)道還較少，以四川雅安市出產(chǎn)紅陽(yáng)獼猴為原料，探索果膠酶在紅陽(yáng)獼猴桃果酒加工中對(duì)出汁率、原酒感官、酒精度、澄清度等方面的影響，為紅陽(yáng)獼猴桃果酒的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與試劑

紅陽(yáng)獼猴桃（雅安市雨城區(qū)）；優(yōu)質(zhì)白砂糖（蔗糖分≥99.6%，雅安市吉選超市）；發(fā)酵菌種GT-2（實(shí)驗(yàn)室自行篩選鑒定保藏）；果膠酶（食品級(jí)，酶活力單位＞50 000 U/g，河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司）；濃鹽酸（含量≥36.0%，四川西隴化工）；氫氧化鈉（成都科龍化工）；葡萄糖（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑）；無(wú)水硫酸銅（成都科龍化工）；酒石酸鉀鈉（成都科龍化工）。試劑均為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

獼猴桃清汁培養(yǎng)基[2]：成熟紅陽(yáng)獼猴桃去皮破碎榨汁，按20 mg/L比例加入果膠酶于40 ℃下酶解2 h，加入白砂糖調(diào)整糖度至200 g/L，115 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 主要儀器設(shè)備

YXQ-LS-100S11型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；BSC-1600ⅡA2型生物安全柜（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；ZWYR-2012C型氣浴恒溫振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；VAL-3N型酒精比重計(jì)（杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司）；LB32T型手持糖度折光儀（廣州市速為電子科技有限公司）；ME204E/02電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；UV-1601型分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器）；雷磁DZ-2型自動(dòng)電位滴定儀（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 果酒工藝流程

紅陽(yáng)獼猴桃→挑選→清洗→破碎壓榨→果膠酶酶解→過(guò)濾→成分調(diào)整→滅菌→接種酵母→主發(fā)酵→后發(fā)酵→陳釀→滅菌→成品

1.3.2 工藝關(guān)鍵條件

1) 原料及處理

選用無(wú)病害，八成熟，雅安市雨城區(qū)所產(chǎn)紅陽(yáng)獼猴桃。果實(shí)80～120 g，果實(shí)可溶性固形物含量13%～15%，研究多以去皮果肉為原料，考慮工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)際情況，全部以帶皮果實(shí)為原料。將原料清洗瀝干，打漿混勻，置于帶棉塞滅菌三角瓶中。

2) 果膠酶配制及酶解

精確稱量果膠酶2 g，用4～5倍40～50 ℃溫水溶解后，加入40～50 ℃溫水稀釋定容，配制成1%（10 mg/mL）溶液，放置備用[5]。用移液管吸取不同量的果膠酶液加入獼猴桃果漿中，于不同溫度水浴鍋中保溫酶解不同時(shí)間。酶解結(jié)束后用300目濾網(wǎng)過(guò)濾取汁，調(diào)整成分，分裝于250 mL三角瓶。

3) 菌種制備

在生物安全柜內(nèi)，將GT-2從斜面保藏管取出，接種到用白砂糖調(diào)整糖度200 g/L滅菌獼猴桃清汁液體培養(yǎng)基，置于氣浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)，設(shè)置轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度28 ℃，培養(yǎng)72 h后，鏡檢確認(rèn)無(wú)雜菌污染，生長(zhǎng)良好后按體積分?jǐn)?shù)5%接種到酶解后的獼猴桃原料中。

4) 前發(fā)酵

將不同酶解處理的酶解液置于22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d。

5) 后發(fā)酵

前發(fā)酵完成后用400目濾網(wǎng)過(guò)濾裝瓶，置于15 ℃下后發(fā)酵30 d。

1.3.3 酶解溫度對(duì)出汁率和原酒品質(zhì)的影響

1) 寬范圍酶解溫度試驗(yàn)

將獼猴桃壓榨破碎成全果漿后混勻，稱取6份150 mL樣品分別置于250 mL帶棉塞的滅菌三角瓶，固定添加果膠酶添加量80 mg/L，酶解時(shí)間120 min，選擇20，30，40，50，60和70 ℃[5]較寬溫度范圍下進(jìn)行酶解，酶解完成立即榨汁過(guò)濾計(jì)算出汁率。濾液用白砂糖調(diào)整糖分至200 g/L，加5%菌液后置于22 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵7 d，過(guò)濾，進(jìn)行原酒感官評(píng)價(jià)。出汁率按照式（1）進(jìn)行計(jì)算，原酒感官按照表1進(jìn)行評(píng)分。

表1 紅陽(yáng)獼猴桃果酒原酒感官評(píng)分表

2) 細(xì)化溫度區(qū)間試驗(yàn)

通過(guò)寬范圍試驗(yàn)以后，發(fā)現(xiàn)60 ℃酶解后出汁率最高，細(xì)化溫度區(qū)間，以45，55，60，65和75 ℃重復(fù)上述步驟，確定單因素下最佳酶解溫度。

1.3.4 酶添加量對(duì)出汁率和原酒品質(zhì)的影響

1) 寬范圍酶添加量試驗(yàn)

將獼猴桃壓榨破碎成全果漿后混勻，稱取5份150 mL樣品分別置于250 mL帶棉塞的滅菌三角瓶，固定酶解溫度60 ℃，酶解時(shí)間120 min，選擇40，60，80，100和120 mg/L[4,10]較寬溫度范圍下進(jìn)行酶解，酶解完成立即榨汁過(guò)濾計(jì)算出汁率。濾液用白砂糖調(diào)整糖分至200 g/L，加5%菌液后置于22 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵7 d，過(guò)濾，進(jìn)行原酒感官評(píng)價(jià)。

2) 細(xì)化酶添加量試驗(yàn)

通過(guò)寬范圍試驗(yàn)以后，發(fā)現(xiàn)100 mg/L酶添加量下出汁率最高，細(xì)化酶添加量區(qū)間，以90，100，110，120和130 mg/L重復(fù)上述步驟，確定單因素下最佳酶添加量。

1.3.5 酶解時(shí)間對(duì)出汁率和原酒品質(zhì)的影響

1) 寬范圍酶解時(shí)間試驗(yàn)

將獼猴桃壓榨破碎成全果漿后混勻，稱取5份150 mL樣品分別置于250 mL帶棉塞的滅菌三角瓶，固定酶解溫度60 ℃，果膠酶添加量100 mg/L，通過(guò)文獻(xiàn)參考[5,8,11]并考慮獼猴桃果漿品質(zhì)保持和生產(chǎn)效率，選擇40，80，120，160和200 min較寬時(shí)間范圍下進(jìn)行酶解，酶解完成立即榨汁過(guò)濾計(jì)算出汁率。濾液用白砂糖調(diào)整糖分至200 g/L，加5%菌液后置于22 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵7 d，過(guò)濾，進(jìn)行原酒感官評(píng)價(jià)。

2) 細(xì)化酶解時(shí)間試驗(yàn)

通過(guò)寬范圍試驗(yàn)以后，發(fā)現(xiàn)酶解時(shí)間與出汁率呈波浪狀關(guān)系，細(xì)化酶解時(shí)間區(qū)間，以40，60，80，100，120，140和160 min重復(fù)上述步驟，確定單因素下最佳酶解時(shí)間。

1.3.6 酶解正交試驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)做過(guò)靜置酶解和搖床酶解（50 ℃，加酶量40 mg/L，空氣搖床120 r/min，酶解150 min）對(duì)比，發(fā)現(xiàn)靜置酶解的出汁率和原酒感官均優(yōu)于搖床酶解，所以酶解方式選擇靜置酶解。預(yù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)整酶解到最佳pH范圍，但通過(guò)文獻(xiàn)分析和實(shí)測(cè)獼猴桃果槳的pH，認(rèn)為獼猴桃果漿pH 3.5，本身就在果膠酶提高出汁率[12-13]、提高發(fā)酵風(fēng)味[8,14]和提高發(fā)酵液澄清度[5,15]各指標(biāo)較理想的pH范圍（pH 3.3～4.5），另外獼猴桃酸度已經(jīng)較高，其果酒制作中的關(guān)鍵技術(shù)之一就是降酸處理，不適合人為加入酸度調(diào)節(jié)劑，所以和孫強(qiáng)等[12]，選擇以紅陽(yáng)獼猴桃自然酸度進(jìn)行酶解。最終選擇酶解溫度（A）55，60和65 ℃，果膠酶添加量（B）100，110和120 mg/L，酶解時(shí)間（C）100，120和140 min，進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，以出汁率和感官評(píng)分的綜合得分率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.3.7 正交結(jié)果驗(yàn)證及原酒指標(biāo)檢測(cè)

按照正交試驗(yàn)所得的最佳酶解組合進(jìn)行酶解，接種5%的GT-2菌液，于22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d。做2個(gè)平行驗(yàn)證出汁率和原酒感官評(píng)分，檢測(cè)原酒中殘?zhí)牵偺牵?、酒精度、總酸含量和澄清度；同時(shí)做2個(gè)不酶解的樣品平行，做相同的指標(biāo)檢測(cè)，進(jìn)行對(duì)比。酒精度測(cè)定，采用酒精計(jì)法[16]；殘?zhí)菧y(cè)定，采用菲林試劑法[17]；總酸（以酒石酸計(jì)）測(cè)定，采用電位滴定法[18]；以蒸餾水為參比，用紫外分光光度計(jì)于680 nm[19]處測(cè)過(guò)濾后靜置24 h的透光率反映原酒的自然澄清度。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解溫度對(duì)出汁率和原酒品質(zhì)的影響

根據(jù)1.3.3的步驟（1）和步驟（2）試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)作表2和圖1。

由表2和圖1可知，紅陽(yáng)獼猴桃全果漿的出汁率在20～60 ℃溫度范圍內(nèi)，呈逐漸上升趨勢(shì)，60 ℃達(dá)到最高值82.58%，隨著溫度繼續(xù)上升，出汁率開(kāi)始小幅度下降；總體來(lái)說(shuō)50～65 ℃之間，出汁率均在81.5%以上，差別不大。說(shuō)明果膠酶酶解紅陽(yáng)獼猴桃漿的適宜溫度在50～65 ℃，繼續(xù)升高溫度，對(duì)出汁率沒(méi)有更大的貢獻(xiàn)。從酶解液發(fā)酵后的原酒感官來(lái)看，酶解溫度較低時(shí)，如20～30 ℃時(shí)，原酒香氣保留較好，整體評(píng)分還高于40～50 ℃，但低溫酶解對(duì)原酒酸澀滋味改善很??；滋味改善較突出和感官評(píng)分較高是在55～65 ℃區(qū)間，感官評(píng)價(jià)最優(yōu)的酶解溫度也是60 ℃，得分在70分。但溫度高于60 ℃，原酒感官開(kāi)始劣變，75 ℃酶解的發(fā)酵液感官評(píng)分降低顯著?？梢钥闯雒附鉁囟?0℃，紅陽(yáng)獼猴桃果槳出汁率和感官均最優(yōu)。分析原因應(yīng)是60 ℃下，果膠酶能有效將果汁中的果膠水解，并且會(huì)加快單寧的溶出[20]和沉淀[21]，提高其穩(wěn)定性，減輕澀味；但溫度再升高，使原料的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解揮發(fā)程度加大，不利于果酒保持品質(zhì)。

表2 不同酶解溫度原酒的感官評(píng)價(jià)

圖1 不同酶解溫度出汁率

2.2 酶添加量對(duì)出汁率和原酒品質(zhì)的影響

根據(jù)1.3.4的步驟（1）和步驟（2）試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)作表3和圖2。

由表3和圖2可知，果膠酶添加量40～120 mg/L時(shí)，與出汁率成正比，果膠酶添加量120 mg/L時(shí)，出汁率達(dá)到最高，為82.21%，果膠酶添加量100～130 mg/L時(shí)，出汁率均較高，在80%以上。結(jié)果表明，果膠酶添加量在一定范圍內(nèi)與獼猴桃果汁出汁率成正相關(guān)，但是不能無(wú)限制增加果膠酶含量，一是因?yàn)橛泄拯c(diǎn)存在；二是有研究顯示果膠酶的添加會(huì)增加果酒中甲醇[22]含量；三是增加生產(chǎn)成本。從感官指標(biāo)來(lái)看，40 mg/L果膠酶添加下，原酒的色澤橘紅明艷、香氣豐富，滋味典型，提高原酒感官評(píng)分；但是氣味和滋味中都帶有明顯澀味，缺陷明顯。分析應(yīng)為果汁中單寧沒(méi)有充分溶出和沉淀。果膠酶添加量60～130 mg/L時(shí)，感官指標(biāo)呈正態(tài)分布，果膠酶添加量100 mg/L時(shí)，原酒色澤橘紅、澄清，果香怡人，滋味微酸但無(wú)澀味，感官評(píng)分最高88分。果膠酶添加量130 mg/L時(shí)，原酒感官明顯劣變。因此，以出汁率為指標(biāo)，果膠酶添加量120 mg/L最優(yōu)，以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，果膠酶添加量100 mg/L最優(yōu)。

圖2 不同果膠酶添加量出汁率

2.3 酶解時(shí)間對(duì)出汁率和原酒品質(zhì)的影響

根據(jù)1.3.5的步驟（1）和步驟（2）試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)作表4和圖3。

由表4和圖3可知，試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，出汁率呈波浪上升狀態(tài)，酶解時(shí)間60 min達(dá)到第1個(gè)波峰，出汁率81.45%；酶解時(shí)間120 min時(shí)達(dá)到第2個(gè)波峰，出汁率82.93%；酶解時(shí)間200 min時(shí)出現(xiàn)最高值，出汁率83.59%?？傮w來(lái)看，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，酶解越充分，出汁率越高。從感官指標(biāo)來(lái)看，酶解40 min，原酒的顏色最為紅艷明亮、澄清，但是氣味和滋味中澀味明顯，所以感官得分偏高但不是最高。酶解時(shí)間60～200 min，感官得分率呈正態(tài)分布，酶解時(shí)間120 min下，感官得分最高，為88分。酶解時(shí)間200 min時(shí)，雖然出汁率最高，但是由于果漿中單寧、蘋果酸等澀味物質(zhì)溶出過(guò)多，使得原酒感官澀味很重，降低感官評(píng)分。因此，最佳酶解時(shí)間120 min。

表4 不同酶解時(shí)間原酒的感官評(píng)價(jià)

圖3 不同酶解時(shí)間出汁率

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

通過(guò)對(duì)表5和表6的分析可知，各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響大小A＞B＞C，即酶解溫度＞酶添加量＞酶解時(shí)間。得到最優(yōu)方案為A2B3C3，即60 ℃，酶添加量120 mg/L，酶解140 min的組合最優(yōu)。其中，因素A酶解溫度對(duì)酶解綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)有顯著性影響。分析應(yīng)為適當(dāng)溫度下，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，可溶性單寧不斷溶出[20]；果膠酶，主要是聚半乳糖醛酸酶[23]可以更有效地水解果汁中的果膠物質(zhì)以及多糖，使果膠黏度降低，果汁中的單寧失去果膠的保護(hù)作用而與其他膠體共同沉淀[22]；不僅提高出汁率，也降低果酒中的澀味。另外，適宜溫度加上果膠酶作用，是否能降低獼猴桃汁中有機(jī)酸研究未見(jiàn)報(bào)道，但有研究表明兩者的協(xié)同作用能降低山楂汁酸度[24]，試驗(yàn)從感官評(píng)價(jià)和總酸測(cè)定上也發(fā)現(xiàn)對(duì)獼猴桃果酒有降酸的作用，但具體影響還需進(jìn)一步研究。

表5 L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表6 方差分析

2.5 正交結(jié)果驗(yàn)證及指標(biāo)測(cè)定

按正交試驗(yàn)得到的最佳工藝進(jìn)行酶解驗(yàn)證，將出汁率、酶解后發(fā)酵的原酒和未酶解直接發(fā)酵的原酒進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果列于表7和表8。

數(shù)據(jù)對(duì)比來(lái)看，是否酶解對(duì)紅陽(yáng)獼猴桃原酒的殘?zhí)呛途凭然緵](méi)有影響，這2個(gè)指標(biāo)主要還是與起始糖度和菌種發(fā)酵能力有關(guān)；對(duì)總酸有一定降低作用；對(duì)果酒澄清度有較大提高；同時(shí)酶解對(duì)出汁率和原酒感官的貢獻(xiàn)很明顯，出汁率平均提高16%，感官得分率平均提高7%，達(dá)到并且提高主要在口感滋味方面，這對(duì)于生產(chǎn)企業(yè)降低生產(chǎn)成本、提高市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力都具有積極意義。

表7 最佳酶解和未酶解發(fā)酵原酒指標(biāo)對(duì)比

表8 最佳酶解和未酶解發(fā)酵原酒指標(biāo)對(duì)比

3 結(jié)論

通過(guò)酶解溫度、酶添加量、酶解時(shí)間等單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)探索果膠酶在紅陽(yáng)獼猴桃果酒加工中對(duì)出汁率、感官評(píng)價(jià)的影響。結(jié)果表明，酶解溫度對(duì)酶解后出汁率和原酒感官評(píng)價(jià)的綜合影響最顯著，酶添加量和酶解時(shí)間也是工藝中要調(diào)控的重要因素。酶解pH以獼猴桃自然pH較適宜，酶解以靜置方式為佳。試驗(yàn)證明，以紅陽(yáng)獼猴桃為原料發(fā)酵果酒，最佳酶解工藝為：自然pH 3.5，靜置狀態(tài)下，酶解溫度60 ℃、添加酶量120 mg/L、酶解時(shí)間140 min。該工藝下發(fā)酵的紅陽(yáng)獼猴桃果酒與未酶解樣品相比，出汁率平均提高16%，達(dá)到81.17%；感官得分率平均提高7%，得分率達(dá)到82%，并且顏色、香氣、口感滋味方面更加協(xié)調(diào)無(wú)明顯缺陷。同時(shí)總酸含量降低，自然澄清度增加，殘?zhí)呛途凭扰c未酶解的樣品無(wú)明顯區(qū)別，這對(duì)于生產(chǎn)企業(yè)降低生產(chǎn)成本、提高市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力都具有積極意義。