劉 芳, 孟桃于, 陳 練, 吳雅君, 熊 順, 丁 利

(1. 長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院, 湖南 長沙 410014; 2. 長沙和合醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司, 湖南 長沙 410000; 3. 長沙海關(guān)技術(shù)中心, 湖南 長沙 410004)

雙酚A(BPA)是重要的有機(jī)化工原料,在工業(yè)上雙酚A被用來合成聚碳酸酯(PC)和環(huán)氧樹脂等材料,常被用于制造塑料(奶)瓶、幼兒用吸口杯、食品和飲料(奶粉)罐內(nèi)側(cè)涂層。越來越多的證據(jù)表明,微量甚至痕量的雙酚A也會(huì)對(duì)人體造成潛在威脅,對(duì)生物體的生殖遺傳與生長發(fā)育[1]、免疫系統(tǒng)[2]、神經(jīng)系統(tǒng)[3]等均會(huì)產(chǎn)生不利影響。BPA一方面會(huì)通過內(nèi)分泌系統(tǒng)來干擾影響機(jī)體的正常激素水平[4],另一方面還可通過不同的受體途徑產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。研究表明,在人血清、母乳、尿液中均檢測(cè)到雙酚A[5-9],考慮到BPA對(duì)人體健康的威脅,許多國家提出了禁止生產(chǎn)或銷售含有BPA奶瓶的立法[10-12]。作為BPA類似物,雙酚S(BPS)、雙酚F(BPF)和雙酚B(BPB)已逐漸被用作塑料制造中BPA的替代品,但是部分研究表明,與BPA本身相比,這些BPA類似物顯示出與BPA相似的毒性或更嚴(yán)重的有害作用[13]。

目前,國內(nèi)外已報(bào)道雙酚類化合物,針對(duì)雙酚A的檢測(cè)方法主要包括熒光分析法[14]、氣相色譜法(GC)[15]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[16]、液相色譜法(LC)[17]、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[18]、酶聯(lián)免疫法[19]等。但這些方法主要是對(duì)食品、尿液中雙酚類環(huán)境激素含量的測(cè)定。對(duì)于血清中雙酚類環(huán)境激素含量測(cè)定的報(bào)道較少,尤其對(duì)于嬰幼兒血清樣本中雙酚類環(huán)境激素的報(bào)道幾乎沒有。此外,雙酚類化合物的前處理常采用酶解[20]、固相萃取[21-23]等前處理方法,對(duì)于大樣本分析存在操作煩瑣、成本昂貴的問題。

本研究以甲基叔丁基醚(MTBE)為提取溶劑,采用液液萃取方法進(jìn)行樣品前處理,建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)同時(shí)檢測(cè)血清中BPA、BPB、BPF、BPS的簡(jiǎn)便快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的方法,并對(duì)150例嬰幼兒血清樣本中雙酚類化合物含量進(jìn)行分析比較。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB4500,美國AB SCIEX公司);電子分析天平(MS106DU,瑞士Mettler Toledo公司);高速冷凍離心機(jī)(TGL-16M,湖南邁克爾儀器有限公司);超聲波振蕩器(KQ2200DE,昆山超聲儀器有限公司);氮吹儀(MD-200-2,杭州奧盛儀器有限公司);多管渦旋混合儀(LPD2500,北京萊普特科學(xué)儀器有限公司)；移液器(德國Eppendorf公司)。

雙酚A、雙酚B、雙酚F、雙酚S標(biāo)準(zhǔn)品均購于德國Dr. Ehrenstorfer公司;色譜純甲醇、乙腈均購于德國Merck公司;色譜純MTBE購于美國Tedia公司;分析純丙酮購于中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙酸銨購于德國Sigma公司,超純水購于中國屈臣氏集團(tuán)有限公司。

以湖南省人民醫(yī)院、湖南省旺旺醫(yī)院、益陽市婦幼保健院、湘潭市婦幼保健院4家醫(yī)院的嬰幼兒為研究對(duì)象,共收集150例血清樣本。研究對(duì)象家屬已簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取10 mg BPA、BPB、BPF、BPS標(biāo)準(zhǔn)品,置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于4 ℃保存。

用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成BPA、BPB、BPF、BPS質(zhì)量濃度分別為10 mg/L的中間標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃保存。

用甲醇將BPA、BPB、BPS中間標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成0.25、1、5、10、25、50、100 μg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,將BPF中間標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成1、2.5、5、10、25、50、100 μg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品采集及前處理

取清晨空腹?fàn)顟B(tài)下嬰幼兒血清樣本約3 mL,分離得血清1～2 mL,于-20 ℃冰箱保存。

使用前先將血清樣本從-20 ℃冰箱中取出,室溫下置于混勻器上溶解均勻。用移液器精確吸取100 μL血清樣本,置于1.5 mL離心管中,加入400 μL MTBE,振蕩5 min,于40 ℃超聲提取15 min,取出混合液于4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min,取320 μL上層液于干凈的1.5 mL離心管中,室溫下氮?dú)獯蹈?然后加入100 μL甲醇復(fù)溶,供HPLC-MS/MS進(jìn)樣分析。

1.4 色譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫:40 ℃;流速:0.2 mL/min;流動(dòng)相:A為超純水,B為含0.5 mmol/L乙酸銨的甲醇溶液。梯度洗脫程序:0～0.5 min, 10%B; 0.5～1.0 min, 10%B～60%B; 1.0～5.0 min, 60%B～100%B; 5.0～6.5 min, 100%B; 6.5～6.6 min, 100%B～10%B; 6.6～8.5 min, 10%B;進(jìn)樣量:5 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離(ESI)源;掃描方式:負(fù)離子掃描;離子源溫度(TEM): 450 ℃;霧化氣(Gas1)壓力:0.34 MPa;輔助氣(Gas2)壓力:0.34 MPa;離子噴霧電壓(IS): -4 500 V;氣簾氣(CUR)壓力:0.24 MPa;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。4種雙酚類環(huán)境激素在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表 1 4種雙酚類環(huán)境激素的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

考察了在甲醇-水、甲醇(含0.5 mmol/L乙酸銨)-水、甲醇(含1.0 mmol/L乙酸銨)-水、甲醇(含1.5 mmol/L乙酸銨)-水、甲醇(含2.5 mmol/L乙酸銨)-水、甲醇(含0.5 mmol/L乙酸銨)-水(含0.1%甲酸)流動(dòng)相條件下4種雙酚類環(huán)境激素的色譜分離效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,以純水為水相、純甲醇為有機(jī)相時(shí),BPB、BPF、BPS的響應(yīng)較低;以純水為水相,有機(jī)相甲醇中添加0.5 mmol/L的乙酸銨時(shí),BPB、BPF、BPS的響應(yīng)值顯著增加,隨著乙酸銨濃度的增加,響應(yīng)值無明顯改變;以水(含0.1%甲酸)為水相、甲醇(含0.5 mmol/L乙酸銨)為有機(jī)相時(shí),BPA、BPB、BPF、BPS的響應(yīng)均受到抑制。因此選用甲醇(含0.5 mmol/L乙酸銨)-水為流動(dòng)相,在MRM模式下BPA、BPB、BPF、BPS混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/L)的總離子流色譜圖見圖1,BPA、BPB、BPF、BPS峰形均尖銳對(duì)稱。

圖 1 4種雙酚類環(huán)境激素(10 μg/L)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the four bisphenol environmental hormones (10 μg/L) in mixed standard solution

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)是樣品中除分析物以外的組分,常對(duì)分析物的分析有顯著干擾,并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,這些影響和干擾被稱為基質(zhì)效應(yīng)(ME)[24]。LC-MS/MS中的基質(zhì)效應(yīng)由分析物的共流出組分影響電噴霧接口的離子化效率所致,表現(xiàn)為離子增強(qiáng)或抑制作用。本研究以空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物的峰面積(A)與純?nèi)芤簶?biāo)準(zhǔn)溶液中的峰面積(B)比值來計(jì)算ME值,即ME=A/B×100%;當(dāng)ME為85%～115%時(shí),基質(zhì)效應(yīng)不明顯;當(dāng)ME>115%時(shí),為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng);當(dāng)ME<85%時(shí),為基質(zhì)抑制效應(yīng)[25]。結(jié)果表明,BPA、BPB、BPF、BPS的基質(zhì)效應(yīng)值分別為95.80%、88.98%、108.06%和112.45%; 4種雙酚類化合物的ME值均在85%～115%之間,說明基質(zhì)效應(yīng)影響較小,因此樣品可直接采用純甲醇溶液配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行定量分析。

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1提取溶劑的選擇

雙酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)中均含兩個(gè)及兩個(gè)以上的苯環(huán),易溶于乙腈、丙酮、甲醇等有機(jī)溶劑[26]。為選擇合適的提取溶劑,本研究考察了甲醇、乙腈、丙酮、MTBE及乙醇5種溶劑對(duì)血清中4種雙酚類環(huán)境激素提取效率的影響(見圖2)。可以看出,在提取時(shí)間、提取溶劑體積相同的情況下,MTBE的提取效率最高,因此選取MTBE為最佳提取溶劑。

圖 2 提取溶劑對(duì)血清中4種雙酚類環(huán)境激素提取效率的影響Fig. 2 Effect of extraction solvents the extraction efficiencies of the four bisphenol environmental hormones in serum MTBE: methyl tert-butyl ether.

2.3.2提取溶劑體積的選擇

前處理過程中,提取溶劑的體積對(duì)提取效率有很大影響,因此本研究考察了不同提取溶劑體積(100、200、300、400、500 μL)對(duì)血清中4種雙酚類環(huán)境激素提取效率的影響(見圖3)。當(dāng)提取溶劑體積為100 μL時(shí),BPA、BPS的提取效率較低;隨著提取溶劑體積的增加,BPA、BPS的提取效率逐漸增加;但當(dāng)提取溶劑體積大于400 μL時(shí),提取效率變化較小。綜合考慮提取效率和成本,提取溶劑體積選擇400 μL。

圖 3 提取溶劑體積對(duì)血清中4種雙酚類環(huán)境激素提取效率的影響Fig. 3 Effect of extraction solvent volumes on the extraction efficiencies of the four bisphenol environmental hormones in serum

2.3.3提取時(shí)間的選擇

圖 4 提取時(shí)間對(duì)血清中4種雙酚類環(huán)境激素提取效率的影響Fig. 4 Effect of extraction time on the extraction efficiencies of the four bisphenol environmental hormones in serum

考察了不同提取時(shí)間(5、15、25、35、45 min)對(duì)血清中4種雙酚類環(huán)境激素提取效率的影響(見圖4)。由圖可知,提取時(shí)間為5 min時(shí),BPA的提取效率較低;隨著提取時(shí)間的增加,提取效率呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì);在15 min后,增加幅度較小,本著節(jié)約時(shí)間的原則,本研究選取15 min為最佳提取時(shí)間。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按1.2節(jié)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法,將BPA、BPB、BPS用甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.25、1、5、10、25、50、100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,BPS用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1、2.5、5、10、25、50、100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以目標(biāo)物峰面積(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x, μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,4種目標(biāo)化合物在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)為0.992 9～0.995 9(見表2)。定量限和檢出限分別指S/N=10、S/N=3時(shí)目標(biāo)化合物的濃度,4種目標(biāo)化合物的定量限分別為0.25、0.25、1.00、0.25 μg/L,檢出限分別為0.05、0.05、0.5、0.05 μg/L。

表 2 4種雙酚類環(huán)境激素的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

表 3 4種雙酚類環(huán)境激素的加標(biāo)回收率及精密度(n=3)

2.5 回收率和精密度

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性,在100 μL空白血清樣本中,加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行3個(gè)水平(5、20、100 μg/L)的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)水平進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn),連續(xù)3 d重復(fù)操作,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。4種雙酚類環(huán)境激素的平均加標(biāo)回收率為84.56%～104.43%,日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%,證明該方法有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

2.6 實(shí)際樣本分析

將血清樣本按年齡段分成5個(gè)組,每組30例,每個(gè)年齡段根據(jù)男女性別分成2組,每組15例。按照上述方法測(cè)定血清中BPA、BPB、BPF、BPS的含量。

由表4可知,BPA檢出含量為0.25～53.70 μg/L,在男童、女童血清中的檢出率分別為90.67%和89.33%,其中,0～6月組、6～12月組嬰幼兒血清中BPA含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于1～2歲組、3～4歲組、5歲及5歲以上組;BPF檢出含量為1.03～2.67 μg/L,在男童、女童血清中的檢出率分別為6.67%和1.33%; BPS檢出含量為0.28～1.71 μg/L,在男童、女童血清中的檢出率分別為5.33%和16.00%; BPB在該150例嬰幼兒血清中均未檢出。結(jié)果表明,嬰幼兒血清中BPA的檢出率和檢出含量遠(yuǎn)高于BPB、BPF、BPS,分析其原因可能是BPA較其他雙酚類環(huán)境激素更為普遍的存在于各種塑料制品中,兒童在日常生活中需頻繁使用塑料水杯[27]、奶瓶[28-30]、塑料玩具[31]等,增加了BPA進(jìn)入體內(nèi)的可能性;奶粉中含有少量BPA[32],嬰幼兒通過飲用奶粉[32]、牛奶[33]攝取了一定量的BPA;生活飲用水[34]、食品包裝材料[35]等含有少量雙酚A。

表 4 150例嬰幼兒血清中4種雙酚類環(huán)境激素的檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化,建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定4種雙酚類環(huán)境激素的方法,該方法前處理簡(jiǎn)單,檢測(cè)限低,線性范圍寬,靈敏度高,精密度好,適用于血清樣本中4種雙酚類環(huán)境激素的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,嬰幼兒在日常生活中易接觸到含BPA的食品、食品接觸材料和玩具等。通過本研究初步了解到雙酚類環(huán)境激素對(duì)人體產(chǎn)生的危害,加強(qiáng)了對(duì)嬰幼兒食品、日用品監(jiān)管的認(rèn)知,為預(yù)防雙酚類環(huán)境激素危害提供了科學(xué)依據(jù)。