林 瀟, 邱 天, 張 續(xù), 胡小鍵, 楊艷偉, 朱 英

(中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與人群健康重點實驗室, 中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所, 北京 100021)

雙酚類(bisphenols)和三氯生(triclosan)是兩類重要的環(huán)境酚類(environmental phenols)化合物,被廣泛用于塑料、食品接觸涂層、個人護理品、藥物等各類工業(yè)和消費產(chǎn)品中[1-3]。隨著這些產(chǎn)品的大量使用,近年來在世界范圍內(nèi)的土壤、空氣、室內(nèi)灰塵、飲用水、食品及生物樣本中均可檢出這些物質(zhì)[4-8]。研究顯示,雙酚類、三氯生等物質(zhì)在一定程度上具有與持久性有機污染物相類似的“持久性、生物富集性和生物毒性”,是潛在的內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)[9,10]。人群流行病學(xué)研究顯示這些物質(zhì)的暴露與多種人類疾病顯著相關(guān),如肝損傷[11]、甲狀腺功能障礙[12]、卵巢功能障礙[13,14]、肥胖促進作用[15]等。因此,目前已有多個國家對這些物質(zhì)的使用進行限制[2,16]。

日常生活中,人們可通過呼吸、飲水、皮膚吸收等多途徑攝入環(huán)境酚。為更準確地評估這些化合物的人群暴露水平,人體生物監(jiān)測被認為是最為理想的暴露監(jiān)測及評估手段。目前,美國、德國、加拿大等國家亦均對本國居民開展了大范圍的生物監(jiān)測工作,以評估環(huán)境酚類化合物暴露的健康風(fēng)險。建立靈敏、準確、快速的分析方法對于開展環(huán)境酚類物質(zhì)的內(nèi)暴露監(jiān)測及評估十分重要。

環(huán)境酚進入人體后,在體內(nèi)的半衰期較短(4～24 h)[17,18],經(jīng)葡萄糖苷酸化代謝后,由腎臟排出體外[19]。因此,通常將尿中環(huán)境酚的濃度作為評估人體內(nèi)暴露的依據(jù)[20]。目前,國外主要采用美國疾控中心建立的在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Online SPE-HPLC-MS/MS)法對尿中的環(huán)境酚類化合物進行測定[21]。該方法的局限性在于在線固相萃取裝置在我國普及率不高,無法在我國推廣應(yīng)用。國內(nèi)多采用離線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法測定尿樣中的環(huán)境酚類化合物[22,23],該方法存在的問題主要包括前處理的效率低、溶劑用量大、樣品需求量較大、實驗過程中空白較高,影響測定結(jié)果的準確性。此外,還有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[24],該方法需要對酚類化合物進行衍生化,過程比較繁瑣。

基于此背景,本研究建立了8種環(huán)境酚類化合物的96孔板離線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(96-well SPE LC-MS/MS)測定方法。該方法操作簡便,定量準確,重現(xiàn)性好,樣品處理效率高,空白干擾小,少量樣品即可滿足分析要求,適用于大批量尿樣中常見的8種環(huán)境酚類化合物的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(TQ-XS,美國沃特世公司),配有I-Class Plus超高效液相色譜儀;Cascada超純水機(美國波爾公司); 96孔板固相萃取裝置(美國沃特世公司)。Oasis HLB 96孔板(60 mg)購于美國沃特世公司。96孔板離心機(MPC2000,北京鼎昊源科技有限公司)。

雙酚A(BPA)、雙酚F(BPF)、四溴雙酚A(TBBPA),純度均大于98.5%,購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;四氯雙酚A(TCBPA),純度大于97%,購自美國Accustandard公司;雙酚S(BPS)、雙酚AF(BPAF)、雙酚B(BPB)和三氯生(TCS)的質(zhì)量濃度均為100 μg/mL,購于美國劍橋同位素實驗室。雙酚A內(nèi)標(BPA-d16, 1 mg/mL)、四氯雙酚A內(nèi)標(TCBPA-13C12, 50 μg/mL)、四溴雙酚A內(nèi)標(TBBPA-13C12, 50 μg/mL)、雙酚S內(nèi)標(BPS-13C12, 100 μg/mL)、雙酚B內(nèi)標(BPB-13C12, 100 μg/mL)、雙酚AF內(nèi)標(BPAF-13C12, 100 μg/mL)和三氯生內(nèi)標(TCS-13C12, 100 μg/mL)純度均為98%,購于美國劍橋同位素實驗室。雙酚F內(nèi)標(BPF-d10, 1 mg/mL),純度98%,購自Toronto Research Chemicals。

乙酸銨、乙酸(MS級,美國賽默飛公司);水、甲醇和乙腈(MS級,德國默克公司)。2 mL玻璃進樣小瓶(美國沃特世公司)。β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶購于美國西格瑪公司。Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)購于美國沃特世公司,標準參考物質(zhì)SRM 3672(美國NIST標準物質(zhì))。人工尿樣購于湖州英創(chuàng)生物科技有限公司。

1.2 溶液配制

用甲醇將固體標準品配制成質(zhì)量濃度約為100 mg/L的單標儲備液。各取一定體積的單標儲備液,用甲醇定容至10 mL,其中,TCS質(zhì)量濃度為40 mg/L,其余7種物質(zhì)均為10 mg/L。用甲醇逐級稀釋得到混合標準序列溶液。

分別取適量各內(nèi)標溶液,用甲醇稀釋,配制質(zhì)量濃度分別為2.5 mg/L (BPA-d16)、5 mg/L(BPF-d10)、1 mg/L(TCS-13C12)以及0.5 mg/L(其余內(nèi)標)的內(nèi)標混合溶液。

表 2 8種目標化合物及同位素內(nèi)標的質(zhì)譜檢測參數(shù)

標準曲線溶液:臨用時,分別取50 μL各濃度的標準序列溶液,加入50 μL內(nèi)標混合溶液和400 μL 50%(v/v)甲醇水溶液,配制得到質(zhì)量濃度為0、0.1、0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg/L的標準曲線溶液(TCS的質(zhì)量濃度為0、0.4、2、4、10、20、40、100、200 μg/L)。

工作曲線溶液:向9支5 mL離心管中分別加入1 mL人工尿樣,加入50 μL各濃度的標準序列溶液,50 μL內(nèi)標混合溶液,30 μLβ-葡萄糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶和700 μL乙酸銨緩沖溶液(1 mol/L, pH=5.0),與樣品一起前處理后,用0.5 mL 50%(v/v)甲醇水溶液復(fù)溶,工作曲線標準溶液的質(zhì)量濃度與標準曲線溶液的質(zhì)量濃度一致。

1.3 樣品前處理

從-80 ℃冰箱中取出冷凍尿樣,在4 ℃冰箱中解凍12 h再放置至室溫,充分渦旋振蕩后取1 mL,加入50 μL內(nèi)標混合液、800 μL乙酸銨緩沖溶液和30 μLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶,37 ℃水浴過夜酶解。酶解后的尿樣離心(3 000 r/min)后取上清液上樣。依次用2 mL甲醇、2 mL水和1 mL乙酸銨緩沖溶液活化平衡固相萃取小柱,然后取樣品上清液上樣,用1 mL 25%(v/v)乙腈進行淋洗,用2 mL甲醇洗脫。洗脫液經(jīng)氮氣吹干,用0.5 mL甲醇-水(1∶1, v/v)溶液復(fù)溶,混勻后在4 400 r/min下離心10 min后進樣。

為降低空白干擾,實驗所用器具均為玻璃材質(zhì),每一批樣品做1個工作曲線、2個過程空白和2個質(zhì)控樣(NIST SRM 3672)(吸煙者尿樣)。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

超高效液相色譜柱:Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)。流動相:A相為水;B相為乙腈。進樣量5 μL。柱溫40 ℃。流動相梯度見表1。

表 1 UPLC流動相梯度

表 2 (續(xù))

表 3 3種固相萃取柱對BPF和TCS的加標回收率

以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標、定量離子峰面積與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標繪制標準曲線,以內(nèi)標法計算8種目標化合物的含量。

1.5 質(zhì)量控制

實驗中應(yīng)盡可能使用玻璃材質(zhì)的器皿,以降低背景干擾。每批樣品檢測時,每10～15個樣品附帶1個質(zhì)控樣品和1個空白樣品,用以保證方法的準確性和監(jiān)控實驗中產(chǎn)生的空白污染,同時隨機抽取未知樣品(10%數(shù)量)進行重復(fù)測定,用以確保方法的精密度。重復(fù)測定樣品的RSD不應(yīng)高于30%。

1.6 樣品的采集和儲存

采集的尿樣應(yīng)儲存在硼硅酸鹽玻璃或聚丙烯材質(zhì)的采樣瓶中,使用特氟龍材質(zhì)的蓋子。采樣前對采樣材料進行空白實驗篩查,確認不含測定的目標物。在樣品采集的過程中,同時制備3套樣品空白。樣本采集后,于-20 ℃冷凍,并儲存在干冰中運輸。在實驗室中,樣本在-80 ℃冰箱中保存。在樣品分析的同時分析采樣空白(采樣地水樣)、過程空白(50 μL內(nèi)標混合液、800 μL乙酸銨緩沖溶液和30 μL葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶),以了解和控制樣品采集、存儲和分析過程中的污染。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1固相萃取柱的選擇

分別考察Oasis HLB 96孔板(60 mg)、Oasis HLB 96孔板(30 mg)和Prime HLB 96孔板(30 mg)的目標物回收率。其中,Prime HLB 96孔板不需要活化即可直接上樣,但填料中有BPA殘留,需要清洗填料以免產(chǎn)生空白。Prime HLB 96孔板(30 mg)和Oasis HLB 96孔板(30 mg)對BPF和TCS的回收率均不如Oasis HLB 96孔板(60 mg)(如表3所示),其他化合物的回收率沒有顯著差別。因此,最終選擇Oasis HLB 96孔板(60 mg)作為本實驗的固相萃取柱。

2.1.2淋洗條件的選擇

本研究考察了甲醇、乙腈等常用有機溶劑對淋洗效果的影響。結(jié)果表明,當(dāng)使用30%(v/v)甲醇水溶液時,BPS、BPF和BPA損失比較嚴重,而使用30%(v/v)乙腈水溶液時,各目標物的損失最小且洗脫液的基質(zhì)干擾效應(yīng)也最小。這可能是因為甲醇的極性強于乙腈,目標物在甲醇中的溶解性更好,洗脫過程中更易損失。在此基礎(chǔ)上比較了不同體積分數(shù)的乙腈水溶液對淋洗效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在使用30%乙腈作為淋洗液的時候,總體的回收率好,基質(zhì)干擾效應(yīng)最小。因此,選擇30%乙腈作為本實驗的淋洗液。

2.1.3過程空白的考察

BPA廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生活的各個領(lǐng)域,在各種環(huán)境介質(zhì)中均普遍存在,因此,實驗過程中采用的各種試劑、耗材,甚至是超純水和MS級的水中都有可能檢出,很難完全避免BPA檢測過程中的過程空白,只能盡量降低。本實驗對容器、試劑、耗材、儀器和實驗殘留等方面進行空白測定。結(jié)果顯示,空白主要來源于試劑、耗材及實驗殘留。其中,實驗過程中使用的乙酸銨緩沖溶液經(jīng)常能夠檢出BPA并不可避免,通過使用MS級試劑能夠有效降低空白值。每批次使用的離心管和移液槍頭需進行空白值評估,無目標物檢出方可進行使用。在長期測定的環(huán)境中,容易產(chǎn)生目標物殘留,因此在實驗后對裝置和環(huán)境進行及時清洗非常重要。每次實驗應(yīng)控制實驗過程空白,實驗過程空白應(yīng)低于方法檢出限方可使用實驗測定數(shù)據(jù)。

實驗比較了相同條件下,使用96孔板和固相萃取小柱進行固相萃取時產(chǎn)生的空白值大小。由于96孔板使用的溶劑量更少,BPA的空白值低于0.05 μg/L, BPS的空白值低于0.004 μg/L,均低于使用固相萃取小柱所引入的過程空白(BPA: 0.2 μg/L; BPS: 0.006 μg/L),說明96孔板不僅能夠高通量處理樣品,還可以有效降低過程空白的引入。

圖 1 實際尿樣中BPA m/z 227/212離子對的色譜圖Fig. 1 Chromatogram of m/z 227/212 channel of BPA in a real urine sample

圖 2 8種環(huán)境酚類化合物的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the eight environmental phenols

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1分析柱的選擇

對比了Acquity UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)和Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)對樣品中目標物的分離效果。結(jié)果表明,使用T3色譜柱時,不僅目標物的峰形不好,而且在實際樣品分析時,在BPA的227/212離子對色譜目標峰位置存在干擾峰,使用C18色譜柱時,目標峰和干擾峰的分離效果則更好(見圖1)。因此,最終選擇C18色譜柱作為本研究的分析柱。

2.2.2色譜條件的選擇

本研究比較了甲醇和乙腈作為有機流動相時各目標物的分離效果和峰形。結(jié)果顯示,二者的分離效果相當(dāng),但當(dāng)使用水和乙腈作為流動相時,各目標物的峰形好,拖尾現(xiàn)象更少,因此采用水和乙腈作為流動相。

比較了以50%水相、60%水相、70%水相和80%水相作為初始流動相時,各目標物的分離效果,并以質(zhì)控樣NIST SRM 3672評價BPA和TCS的定量準確性。研究發(fā)現(xiàn),使用80%水相為初始流動相時能更好地分離雙酚A的目標峰和干擾峰,測定結(jié)果更準確。使用高比例的水相還能夠清洗樣品中鹽類的干擾,減少質(zhì)譜污染,降低基質(zhì)效應(yīng)。另外,TCBPA、TBBPA和TCS的出峰時間比較接近,水相比例高也有助于提高這3個目標物的分離度,增加各目標物的掃描時間,提高響應(yīng)強度。在80%水相作為初始流動相時8種環(huán)境酚類目標物的色譜圖見圖2。

2.3 樣品基質(zhì)效應(yīng)

由于無法獲得不含此8種環(huán)境酚類化合物的實際尿樣基質(zhì),本方法用人工尿樣代替實際尿樣,用于評估計算絕對基質(zhì)效應(yīng)。分別用人工尿樣和甲醇溶液配制兩條標準曲線(不含內(nèi)標),人工尿樣配制的標準曲線進行前處理,與甲醇標準曲線共同上機測定,根據(jù)文獻[25,26]方法對絕對基質(zhì)效應(yīng)進行計算評估。結(jié)果顯示,BPA、BPF、BPS、BPB和BPAF的|ME|范圍為3.47%～15.32%,為弱基質(zhì)效應(yīng),不需要采取補償措施;TCBPA的|ME|為49.58%,為中等程度基質(zhì)效應(yīng);TBBPA和TCS的|ME|分別為71.99%和86.93%,為強基質(zhì)效應(yīng),中等基質(zhì)效應(yīng)和強基質(zhì)效應(yīng)均需采取措施補償。因此,本方法采用同位素內(nèi)標法抵消基質(zhì)效應(yīng)。通過考察用人工尿樣和甲醇溶液配制的兩條標準曲線(含內(nèi)標),再次評估絕對基質(zhì)效應(yīng),8種環(huán)境酚類化合物的|ME|范圍為1.51%～17.27%,說明TCBPA、TBBPA和TCS的基質(zhì)效應(yīng)得到了有效補償。

選取6份不同來源的實際尿樣,經(jīng)上述方法前處理后,得到6份實際尿樣基質(zhì)。分別取490 μL實際尿樣基質(zhì),加入10 μL 100 μg/L的混合內(nèi)標。計算這8種內(nèi)標的峰面積的RSD,用于評估相對基質(zhì)效應(yīng)[25,27]。這8種化合物在不同來源的尿樣基質(zhì)中的質(zhì)譜響應(yīng)穩(wěn)定,內(nèi)標峰面積的RSD分別為4.35%(BPA)、7.83%(BPF)、8.07%(TCBPA)、9.06%(TBBPA)、3.63%(BPS)、5.50%(BPAF)、4.12%(BPB)和5.32%(TCS),說明相對基質(zhì)效應(yīng)穩(wěn)定?；|(zhì)效應(yīng)評估的結(jié)果說明,在進行定量檢測時,可以用標準曲線代替基質(zhì)匹配工作曲線。

2.4 線性范圍和檢出限

以目標物峰面積與相應(yīng)內(nèi)標峰面積的比值Y對相應(yīng)濃度X(μg/L)進行線性回歸,8種目標化合物在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999。參照文獻[28],根據(jù)美國環(huán)保署(US EPA)檢出限測定程序第2版[29],采用兩種方法考察檢出限:①對有空白干擾的目標物(BPA、BPS、TCS、TCBPA和BPAF),利用7次過程空白的平均值加3倍標準偏差計算檢出限;②對沒有空白干擾的目標物,用不含本底的尿樣預(yù)估方法定量限加標(7次),以3倍標準偏差計算檢出限。再以3.3倍檢出限計算所有目標物的定量限?？紤]到樣品中目標物的濃度在前處理時濃縮了2倍,本方法的檢出限為0.002～1.09 μg/L,定量限為0.007～3.63 ng/L。線性方程與檢出限的結(jié)果見表4。

表 4 8種環(huán)境酚類化合物的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

表 5 8種目標化合物在3個水平下的加標回收率及RSD(n=5)

2.5 方法的回收率和精密度

選用接近空白的實際尿樣進行加標回收和精密度試驗,加標水平分別為2.5、5和25 μg/L,每個水平進行5次平行實驗,計算加標回收率和日內(nèi)精密度。在不同天對實際尿樣進行分析測定,以計算日間精密度。結(jié)果見表5。

2.6 準確性驗證

采用NIST SRM 3672進一步評價該方法的準確性。用該方法對SRM 3672進行檢測,與其認證的2種物質(zhì)的濃度進行比較。認證含量通過將分析證書中的含量(μg/kg)通過尿密度(1.019 g/mL)轉(zhuǎn)換成質(zhì)量濃度(μg/L)。

如表6所示,該方法對BPA和TCS的檢測結(jié)果與認證的濃度一致,進一步驗證了該方法的準確性。

表 6 SRM 3672平均測定含量與認證含量(n=6)Table 6 Average measured contents and certified contents of SRM 3672 (n=6)CompoundContents/(μg/L)This methodNIST certifiedBPA2.753.11TCS17.818.0 NIST: National Institute of Standard and Technology.

2.7 實際樣品的檢測

采用本方法對北京市2019-2020年采集的64份尿樣進行檢測分析,結(jié)果(見表7)表明,本批尿樣除BPB和BPAF未檢出外,其余均有檢出,BPA的檢出率最高,為100%。在幾何平均數(shù)(GM)的計算中,低于LOD的值均用LOD/2值代替。測定結(jié)果顯示,人尿中BPA和TCS的含量相對較高,中位值分別為0.69和1.44 μg/L。BPS的檢出率為96.9%,中位數(shù)為0.086 μg/L。其他酚類化合物的存在水平均較低。以上結(jié)果表明,北京市居民存在普遍的環(huán)境酚類化合物暴露,值得關(guān)注。

表 7 8種環(huán)境酚類化合物在人尿中的測定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了尿中8種環(huán)境酚類化合物高通量固相萃取-UPLC-MS/MS分析方法。相比傳統(tǒng)固相萃取方法,該方法操作更加簡單,能有效提高樣品處理效率,可降低實驗中引入的空白并減少人員與有害試劑的接觸,適合尿中多種環(huán)境酚類物質(zhì)的大批量檢測。