薛雅茹, 郭 睿, 張 博*

(1. 黎明職業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院, 福建 泉州 362000; 2. 廈門(mén)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 福建 廈門(mén) 361005)

馬鮫魚(yú)(Scomberomorusniphonius),又名鲅魚(yú)、魚(yú),主要分布在黃海、渤海以及福建沿海等地[1]。該魚(yú)在加工過(guò)程中往往會(huì)廢棄大量?jī)?nèi)臟、魚(yú)頭等加工副產(chǎn)物,重量約占原料魚(yú)的40%～55%[2]。而馬鮫魚(yú)內(nèi)臟中含有豐富的蛋白質(zhì),是制備肽類(lèi)及相關(guān)生物分子產(chǎn)品的良好來(lái)源。大量研究表明,抗氧化肽能清除人體內(nèi)的多余自由基,但國(guó)內(nèi)外利用馬鮫魚(yú)內(nèi)臟制備活性肽的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

Ambigaipalan等[3]發(fā)現(xiàn)海洋生物源抗氧化肽與傳統(tǒng)的化學(xué)合成抗氧化劑相比更有益于人體健康。目前,由于可控酶解法制備海洋生物源抗氧化肽具有酶的專(zhuān)一性高、水解過(guò)程溫和、不引入有毒有害試劑等優(yōu)點(diǎn),因此得到了廣泛的應(yīng)用[4]。但由于每種蛋白酶的專(zhuān)一性不同,不同酶的酶切位點(diǎn)各異,如胰蛋白酶只選擇性水解精氨酸或賴(lài)氨酸羧基形成的肽鍵。因此,酶解所獲得的活性肽結(jié)構(gòu)及功能活性各不相同。而工業(yè)上制備抗氧化肽時(shí),蛋白酶的選擇盲目性較大,為了降低成本,往往使用價(jià)格低廉的酶(如木瓜蛋白酶),導(dǎo)致制備的肽活性普遍較差。為了提高馬鮫魚(yú)加工的附加值,拓寬?cǎi)R鮫魚(yú)資源的精深加工范圍,得到高活性的海洋生物源抗氧化肽,亟須開(kāi)發(fā)一種針對(duì)馬鮫魚(yú)內(nèi)臟抗氧化肽的制備及分離純化方法。

由Box等提出的響應(yīng)面分析法(response surface methodology, RSM)是通過(guò)一定量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)構(gòu)建多元二次回歸方程,用以擬合工藝參數(shù)與響應(yīng)值的函數(shù)關(guān)系,進(jìn)而得到最優(yōu)工藝參數(shù)的優(yōu)化設(shè)計(jì)方法[5,6]。響應(yīng)面分析法與目前常用的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法相比,具有試驗(yàn)次數(shù)少、精度高、周期短的優(yōu)點(diǎn),目前已得到廣泛應(yīng)用[7]。本研究采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了馬鮫魚(yú)內(nèi)臟抗氧化肽的制備工藝。

納流液相色譜是近年興起的高效生化分離分析技術(shù),其通常在100 μm內(nèi)徑的石英毛細(xì)管柱中,以nL/min的流速水平進(jìn)行樣品分離,具有樣品需求量低、溶劑消耗少、選擇性高、靈敏度高、分離快速等特點(diǎn)[8-12]。對(duì)于多肽/蛋白質(zhì)等樣品的液相色譜分離,最常見(jiàn)的是以表面鍵合C18為代表的反相色譜固定相和以強(qiáng)陽(yáng)離子交換(strong cation exchange, SCX)為代表的離子交換色譜固定相[13]。C18固定相通過(guò)疏水作用力依據(jù)樣品中各組分極性強(qiáng)弱進(jìn)行分離,疏水性越強(qiáng)的組分在反相固定相中的保留越強(qiáng)[14]。SCX則是通過(guò)離子相互作用對(duì)樣品進(jìn)行分離,樣品各組分的離子價(jià)位越高、離子半徑越小,則SCX對(duì)其保留越強(qiáng)[15,16]。

本研究在海洋魚(yú)類(lèi)抗氧化肽經(jīng)典制備工藝的基礎(chǔ)上[17,18],針對(duì)馬鮫魚(yú)體系,從5種食品加工常用水解酶中篩選出最佳水解酶,進(jìn)而基于響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到馬鮫魚(yú)內(nèi)臟抗氧化肽的最佳制備方法。為篩選出適合于馬鮫魚(yú)內(nèi)臟抗氧化肽分離分析的色譜固定相,基于納流高效液相色譜平臺(tái)進(jìn)行分離純化,分別考察了反相C18柱和SCX柱對(duì)馬鮫魚(yú)內(nèi)臟氧化肽酶解液分離后各組分的抗氧化能力,篩選出具有高抗氧化活性的組分。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-20AD液相色譜儀,日本島津有限公司;Economic ECD2000紫外檢測(cè)器,捷克ECOM公司;絞肉機(jī),北京利仁科技責(zé)任有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;AL104-IC型電子分析天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司;HYP-308型消化爐,上海纖檢儀器有限公司;KDN-103F型自動(dòng)凱氏定氮儀,上海纖檢儀器有限公司;400Y型中草藥粉碎機(jī),永康市鉑歐五金制品有限公司;FE20型精密pH計(jì),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-2012PC型紫外分光光度計(jì),尤尼克-上海儀器有限公司;CJJ78-1型磁力攪拌器,常州市金壇晨陽(yáng)電子儀器廠。

馬鮫魚(yú)內(nèi)臟,由惠安瑞芳食品有限公司提供;牛胰蛋白酶(250 USP u/mg),上海源葉生物科技有限公司;風(fēng)味蛋白酶(1.5×104u/g),上海吉至生化科技有限公司;酸性蛋白酶(8.0×105u/g)、中性蛋白酶(2.0×105u/g)、堿性蛋白酶(2.0×105u/g),江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司;二苯代苦味肼基自由基(DPPH·),美國(guó)Sigma公司;異丙醇、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、95%乙醇、甲醛、水楊酸等,均為分析純?cè)噭?乙腈為色譜純。

1.2 樣品預(yù)處理及條件優(yōu)化

馬鮫魚(yú)內(nèi)臟→解凍→清洗(除去魚(yú)卵、魚(yú)膽)→攪成糜狀→異丙醇浸提5 h后脫脂(重復(fù)3次)→55 ℃烘干→粉碎→過(guò)篩→馬鮫魚(yú)內(nèi)臟粉末→加入蒸餾水100 mL→熱變性處理15 min→調(diào)pH→加酶→酶解→水浴95 ℃滅酶10 min→離心10 min→取上清液→馬鮫魚(yú)內(nèi)臟抗氧化肽溶液(antioxidative peptide fromScomberomorusniphoniusviscera, APS)。

1.2.1酶的篩選

分別將風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶5種蛋白酶置于50 g/L馬鮫魚(yú)內(nèi)臟溶液中發(fā)生酶解反應(yīng),水解條件見(jiàn)表1。以DPPH·清除率、·OH清除率和水解度(DH)為指標(biāo),篩選最佳水解酶。

表 1 蛋白酶的水解條件

1.2.2響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在預(yù)實(shí)驗(yàn)單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以DPPH·清除率為響應(yīng)值Y,以A(加酶量)、B(酶解溫度)、C(酶解時(shí)間)為自變量,考察胰蛋白酶水解條件。采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn),其中12個(gè)為析因點(diǎn),自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點(diǎn),5個(gè)為零點(diǎn),為區(qū)域中心點(diǎn),以估計(jì)誤差。因素水平編碼值見(jiàn)表2。試驗(yàn)以隨機(jī)次序進(jìn)行,重復(fù)3次,取平均值。

表 2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)的因素和水平

1.3.1脫脂后馬鮫魚(yú)內(nèi)臟基本成分的測(cè)定

水分的測(cè)定采用常壓直接干燥法,參考GB 5009.3-2010[19];蛋白質(zhì)的測(cè)定采用微量凱氏定氮法,參考GB 5009.5-2016[20];脂肪的測(cè)定采用索氏抽提法,參考GB 5009.6-2016[21];灰分的測(cè)定采用高溫灼燒法,參考GB 5009.4-2016[22]。

1.3.2水解度的測(cè)定[23]

采用甲醛滴定法測(cè)定氨基酸態(tài)氮的含量[24]。準(zhǔn)確取出10.0 mL APS,加水定容于50 mL容量瓶中,搖勻,備用。吸取20.0 mL的備用樣品稀釋液于250 mL燒杯中,加入60 mL蒸餾水,放入轉(zhuǎn)子,轉(zhuǎn)動(dòng)磁力攪拌器。將待測(cè)溶液攪拌穩(wěn)定后把精密pH計(jì)帶有的復(fù)合電極小心插入燒杯里的溶液中,再用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH為8.2,用移液管量取10.0 mL甲醛溶液加入待測(cè)液中,用轉(zhuǎn)子攪拌均勻。最后滴定至pH為9.2,用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定,并記下NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液所消耗的體積。取250 mL燒杯,裝入80 mL蒸餾水,進(jìn)行空白試驗(yàn)且試驗(yàn)條件與上述一樣,同時(shí)記下所消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。根據(jù)式(1)計(jì)算游離氨基酸態(tài)氮的含量:

(1)

式中:x為氨基酸態(tài)氮的含量,g/100 mL;c為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,mol/L;V1為液體中加入10 mL甲醛后,滴定至pH為9.2時(shí)所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,mL;V0為空白試驗(yàn)加入甲醛后滴定至pH為9.2時(shí)氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液所消耗的體積,mL;V為測(cè)定時(shí)吸取樣品稀釋液的體積,mL; 10為測(cè)定用樣品溶液體積,mL; 0.0140為氮的毫摩爾質(zhì)量,g/mmol。

由式(2)計(jì)算樣品的水解度(DH):

(2)

式中:DH為樣品的水解度;x1為APS中游離氨基態(tài)氮的含量;x0為酶解前樣液中氨基態(tài)氮的含量;x為未酶解原料的蛋白液中游離氨基態(tài)氮的含量。

1.3.3抗氧化活性指標(biāo)的測(cè)定

DPPH·清除率的測(cè)定參考Liu等[25]的方法并加以改進(jìn)。將2 mL的APS加入到2 mL的2.0×10-4mol/L的DPPH·溶液中,均勻混合,在黑暗處?kù)o置30 min后,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定混合溶液在517 nm條件下的吸光度值(A2)。以2 mL無(wú)水乙醇與2 mL DPPH·溶液的吸光度為空白管(A0),以2 mL APS+2 mL無(wú)水乙醇的吸光值為對(duì)照管(A1)。清除率用式(3)計(jì)算:

(3)

式中:A0為2 mL無(wú)水乙醇+2 mL DPPH·溶液的吸光值;A1為2 mL APS+2 mL無(wú)水乙醇的吸光值;A2為2 mL APS+2 mL DPPH·溶液的吸光值。

·OH清除率的測(cè)定參考Zhang等[26]的方法并加以改進(jìn)。在試管中依次加入2 mL 5 mmol/L FeSO4、3 mL 6 mmol/L水楊酸、4 mL APS,搖勻后加入0.1% H2O22 mL,加蒸餾水定容至10 mL,搖勻,靜置30 min。計(jì)算樣品對(duì)·OH的清除能力(SA),如式(4):

(4)

式中:Ei為加APS體系的吸光度;Ej為不加水楊酸體系的吸光度;E0為不加APS體系的吸光度。

1.4 儀器條件

色譜分析柱:C18柱(15 cm×100 μm, 5 μm, 30 nm),SCX柱(15 cm×100 μm, 5 μm, 100 nm);樣品閥進(jìn)樣量:4 nL;檢測(cè)波長(zhǎng):214 nm;流速:0.6 mL/min;流動(dòng)相:60%乙腈;洗脫方法:1∶1 000分流比,60%乙腈等度洗脫。

樣品溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣;結(jié)束后將同一個(gè)吸收峰收集的樣液混合濃縮,凍干,分析各峰組分的DPPH·清除力。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫脂后馬鮫魚(yú)內(nèi)臟基本成分分析

動(dòng)物內(nèi)臟中往往含有較高的脂肪成分及其衍生物,由于脂肪對(duì)酶解會(huì)造成一定的影響,因此,在酶解前需要進(jìn)行脫脂處理[17]。對(duì)脫脂馬鮫魚(yú)內(nèi)臟粉末進(jìn)行基本成分的測(cè)定,結(jié)果顯示,馬鮫魚(yú)內(nèi)臟經(jīng)攪碎、異丙醇反復(fù)浸提脫脂后蛋白含量為79.45%,說(shuō)明可作為良好的肽類(lèi)制備來(lái)源。

圖 1 不同蛋白酶對(duì)酶解液水解度、DPPH·清除率和·OH清除率的影響(n=3)Fig. 1 Effect of various proteases on degree of hydrolysis,DPPH· and ·OH scavenging ability (n=3)

2.2 酶的篩選結(jié)果

由圖1可知,5種蛋白酶水解度的大小依次為胰蛋白酶>堿性蛋白酶>中性蛋白酶>風(fēng)味蛋白酶>酸性蛋白酶,胰蛋白酶酶解液清除DPPH·和·OH能力最強(qiáng),清除率分別為88.93%±0.82%和53.09%±0.73%,這與各種蛋白酶的水解能力大小排序基本一致。這可能是因?yàn)椴煌鞍酌傅拿附馕镏泻胁煌被嵝蛄械碾?而酶解物的自由基清除能力又和組成肽的氨基酸序列和長(zhǎng)度密切相關(guān)。由此可推斷,胰蛋白酶水解物中可能含有更多的能減少自由基堆積和氧化反應(yīng)產(chǎn)生的活性肽[8]。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

表 3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

綜上分析可得,該模型可以用來(lái)分析、預(yù)測(cè)胰蛋白酶酶解馬鮫魚(yú)內(nèi)臟制備抗氧化肽的工藝條件。

經(jīng)回歸擬合后,試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響可用回歸方程表示為:

Y=94.25-1.07A+1.00B+0.51C-1.04AB-
0.51AC-1.88BC-3.76A2-4.49B2-2.15C2

從表4可以看出,方程一次項(xiàng)中,A、B、C均達(dá)到顯著水平(p<0.05),其中,A、B對(duì)DPPH·清除率影響較大,達(dá)到極顯著水平(p<0.01)。在二次項(xiàng)中,A2、B2、C2(p<0.01)為極顯著項(xiàng),三者系數(shù)均為負(fù)值,說(shuō)明方程具有極大值點(diǎn)可進(jìn)行優(yōu)化分析[17]。交互項(xiàng)中,AB、BC達(dá)到極顯著水平(p<0.01),AC影響不顯著,可以看出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系[28]。

圖 2 加酶量和酶解溫度對(duì)DPPH·清除率交互影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)Fig. 2 Surface and contour plots of influence for the addition of enzyme and hydrolysis temperature against DPPH· scavenging ability

圖 3 加酶量和酶解時(shí)間對(duì)DPPH·清除率交互影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)Fig. 3 Surface and contour plots of influence for the addition of enzyme and hydrolysis time against DPPH· scavenging ability

2.3.2單因素的交互作用分析

由圖2～4可知,在不同酶解條件下,APS的DPPH·清除率與單因素結(jié)果具有較好的一致性。各因素之間有交互作用。其中加酶量和酶解溫度(p=0.007 5)、酶解時(shí)間和酶解溫度(p=0.000 3)之間的交互作用達(dá)到極顯著水平。

圖2顯示了當(dāng)酶解時(shí)間位于中心點(diǎn)即2.5 h時(shí),酶解溫度和加酶量對(duì)DPPH·清除率的交互影響效應(yīng)。由圖2可以看出,在同一酶解溫度下,DPPH·清除率隨著加酶量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì);在同一加酶量下,DPPH·清除率隨著酶解溫度的增加而先增加后減少。

圖3顯示了當(dāng)酶解溫度位于中心點(diǎn)即40 ℃時(shí),酶解時(shí)間和加酶量對(duì)DPPH·清除率的交互影響效應(yīng)。由圖3可以看出,在同一酶解時(shí)間下,DPPH·清除率隨著加酶量的增加而先增大后減小;在同一加酶量下,DPPH·清除率隨著酶解時(shí)間的增加而先緩慢增加后緩慢減少。二者交互作用相對(duì)較弱(p>0.05),這可能是由于即使提高了加酶量也仍需要一定的酶解時(shí)間使酶與底物得以適當(dāng)反應(yīng),使水解程度達(dá)到最佳狀態(tài),充分反應(yīng)而又不過(guò)度降解,從而生成DPPH·清除率較高的抗氧化肽。

圖4顯示了當(dāng)加酶量位于中心點(diǎn)即0.4%時(shí),酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)DPPH·清除率的交互影響效應(yīng)。由圖4可以看出,在同一酶解溫度下,DPPH·清除率隨著酶解時(shí)間的增加而先增加后趨于平穩(wěn);在同一酶解時(shí)間下,DPPH·清除率隨著酶解溫度的升高而先升高后降低。說(shuō)明在一定的酶解溫度范圍內(nèi),要達(dá)到較高的DPPH·清除率,適當(dāng)?shù)厣呙附鉁囟瓤梢钥s短酶解所需的時(shí)間。

圖 4 酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)DPPH·清除率交互影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)Fig. 4 Surface and contour plots of influence for hydrolysis temperature and hydrolysis time against DPPH· scavenging ability

根據(jù)Design Expert v8.0.6對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化,得出結(jié)果:加酶量0.368%、酶解溫度40.55 ℃、酶解時(shí)間2.545 h。在此條件下,模型預(yù)測(cè)APS對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到94.415%。考慮到實(shí)際試驗(yàn)時(shí)操作的可行性,調(diào)整工藝條件為:加酶量0.37%,酶解溫度41 ℃,酶解時(shí)間2.5 h。重復(fù)3次試驗(yàn),得到DPPH·清除率為93.78%±0.35%,與預(yù)測(cè)值相比,相對(duì)誤差為0.67%,說(shuō)明擬合模型優(yōu)化出的條件較為準(zhǔn)確。在此條件下,APS的水解度為23.66%, ·OH清除率為62.59%。

在前人報(bào)道的工作中,李娜等[29]以鱈魚(yú)魚(yú)鰾為原料,采用復(fù)合蛋白酶酶解制備抗氧化肽,制備所得的抗氧化肽DPPH·清除率為61.1%。李致瑜等[17,18]以大黃魚(yú)內(nèi)臟為原料,選用堿性蛋白酶酶解制備抗氧化肽,所得抗氧化肽的DPPH·清除率為85.97%。本工作中,以馬鮫魚(yú)內(nèi)臟作為抗氧化肽源,胰蛋白酶表現(xiàn)出最優(yōu)的酶解效率,且DPPH·清除率達(dá)到93.78%的優(yōu)良水平,表明胰蛋白酶是馬鮫魚(yú)內(nèi)臟來(lái)源抗氧化肽制備的最優(yōu)水解酶。

2.4 納流液相色譜分離純化APS結(jié)果分析

為檢測(cè)出APS溶液各組分的抗氧化能力,本研究選用具有樣品需求量低、高靈敏度、高選擇性等特點(diǎn)的納流液相色譜法進(jìn)行分離。為了篩選出更適合APS分離純化的固定相,將經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后的APS溶液分別用C18納流色譜柱和SCX納流色譜柱進(jìn)行色譜分離,收集分離后的不同組分分別進(jìn)行DPPH·清除力表征,以篩選出抗氧化能力最高的組分。

圖 5 C18柱分離APS的高效納流液相色譜圖Fig. 5 nano-HPLC chromatogram of APS using C18 column Mobile phase: 60% ACN; flow rate: 0.6 mL/min; split ratio: 1∶1000; chromatographic column: C18, 15 cm×100 μm, 5 μm, 30 nm.

圖5、圖6分別為以C18柱和SCX柱分離APS的色譜圖。根據(jù)色譜圖可知C18柱分離APS得到6個(gè)組分,SCX柱分離APS得到9個(gè)組分。其中,SCX-1至SCX-5、SCX-6和SCX-7、SCX-8和SCX-9這3組的洗脫時(shí)間更為接近,表明這3組的電荷基團(tuán)強(qiáng)度接近,且保留時(shí)間越長(zhǎng)的組分含有的陰離子越多,堿性也就越強(qiáng)。游麗君等[30]的工作表明,疏水性適中、堿性強(qiáng)的抗氧化肽具有更優(yōu)的抗氧化活性。為進(jìn)一步探究分離純化后各組分的抗氧化能力,對(duì)分離得到的各組分進(jìn)行收集,并進(jìn)行抗氧化活性能力檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7和圖8。

圖 6 SCX固定相分離APS的高效納流液相色譜圖Fig. 6 Nano-HPLC chromatogram of APS using SCX stationary phase Mobile phase: 60% ACN; flow rate: 0.6 mL/min; split ratio: 1∶1000; chromatographic column: SCX, 15 cm×100 μm, 5 μm, 100 nm.

圖 7 C18固定相分離后各組分的DPPH·清除力Fig. 7 DPPH· scavenging activity of fractions obtained on C18 column The letters indicate significant difference at 0.05 level (data=mean±standard, n=3).

圖 8 SCX柱分離后各組分的DPPH·清除力Fig. 8 DPPH· scavenging activity of fractions obtained on SCX column The letters indicate significant difference at 0.05 level (data=mean±standard, n=3).

由圖7可知,ULT-4組分的DPPH·清除力最高,半抑制濃度(IC50)為0.816±0.017 mg/mL,表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗氧化活性(p<0.05),效果為未純化的APS的11.2倍。由圖8可知,SCX-5組分的DPPH·清除力最高,IC50值為0.672±0.051 mg/mL,表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗氧化活性(p<0.05),效果為APS的13.6倍。兩者相比,SCX-5的抗氧化活性強(qiáng)于ULT-4,且SCX組各組分的抗氧化能力總體強(qiáng)于C18組,因此說(shuō)明SCX固定相更適合APS的分離純化。

3 結(jié)論

本文以脫脂馬鮫魚(yú)內(nèi)臟蛋白為原料進(jìn)行酶的篩選。以DPPH·清除率為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面法優(yōu)化了馬鮫魚(yú)內(nèi)臟來(lái)源抗氧化肽的制備方法,得到最佳酶解條件:加酶量0.37%,酶解溫度41 ℃,酶解時(shí)間2.5 h,底物質(zhì)量濃度50 g/L,酶解pH 7.0。此條件下,馬鮫魚(yú)內(nèi)臟抗氧化肽的水解度為23.66%, DPPH·清除率為93.78%,·OH清除率為62.59%。DPPH·清除率與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差在±1%以?xún)?nèi),擬合模型較為準(zhǔn)確。

利用高效納流液相色譜平臺(tái)對(duì)馬鮫魚(yú)內(nèi)臟抗氧化肽進(jìn)行分離與活性篩選。SCX固定相無(wú)論是從分離的組分?jǐn)?shù)量,各組分的抗氧化能力,以及抗氧化能力最強(qiáng)組分等方面都明顯優(yōu)于C18固定相。所篩選出活性組分的抗氧化活性最強(qiáng),其DPPH·清除力的IC50值可達(dá)到0.672±0.051 mg/mL,為未純化時(shí)的13.6倍。結(jié)果表明,SCX固定相更加適用于馬鮫魚(yú)內(nèi)臟抗氧化肽的分離純化,對(duì)馬鮫魚(yú)內(nèi)臟來(lái)源抗氧化肽的活性篩選與深加工研究具有實(shí)際指導(dǎo)意義。