薛雅茹, 郭 睿, 張 博*

(1. 黎明職業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院, 福建 泉州 362000; 2. 廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 福建 廈門 361005)

馬鮫魚(Scomberomorusniphonius),又名鲅魚、魚,主要分布在黃海、渤海以及福建沿海等地[1]。該魚在加工過程中往往會廢棄大量內(nèi)臟、魚頭等加工副產(chǎn)物,重量約占原料魚的40%～55%[2]。而馬鮫魚內(nèi)臟中含有豐富的蛋白質(zhì),是制備肽類及相關(guān)生物分子產(chǎn)品的良好來源。大量研究表明,抗氧化肽能清除人體內(nèi)的多余自由基,但國內(nèi)外利用馬鮫魚內(nèi)臟制備活性肽的研究尚未見報道。

Ambigaipalan等[3]發(fā)現(xiàn)海洋生物源抗氧化肽與傳統(tǒng)的化學(xué)合成抗氧化劑相比更有益于人體健康。目前,由于可控酶解法制備海洋生物源抗氧化肽具有酶的專一性高、水解過程溫和、不引入有毒有害試劑等優(yōu)點,因此得到了廣泛的應(yīng)用[4]。但由于每種蛋白酶的專一性不同,不同酶的酶切位點各異,如胰蛋白酶只選擇性水解精氨酸或賴氨酸羧基形成的肽鍵。因此,酶解所獲得的活性肽結(jié)構(gòu)及功能活性各不相同。而工業(yè)上制備抗氧化肽時,蛋白酶的選擇盲目性較大,為了降低成本,往往使用價格低廉的酶(如木瓜蛋白酶),導(dǎo)致制備的肽活性普遍較差。為了提高馬鮫魚加工的附加值,拓寬馬鮫魚資源的精深加工范圍,得到高活性的海洋生物源抗氧化肽,亟須開發(fā)一種針對馬鮫魚內(nèi)臟抗氧化肽的制備及分離純化方法。

由Box等提出的響應(yīng)面分析法(response surface methodology, RSM)是通過一定量的試驗數(shù)據(jù)構(gòu)建多元二次回歸方程,用以擬合工藝參數(shù)與響應(yīng)值的函數(shù)關(guān)系,進(jìn)而得到最優(yōu)工藝參數(shù)的優(yōu)化設(shè)計方法[5,6]。響應(yīng)面分析法與目前常用的正交試驗設(shè)計法相比,具有試驗次數(shù)少、精度高、周期短的優(yōu)點,目前已得到廣泛應(yīng)用[7]。本研究采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了馬鮫魚內(nèi)臟抗氧化肽的制備工藝。

納流液相色譜是近年興起的高效生化分離分析技術(shù),其通常在100 μm內(nèi)徑的石英毛細(xì)管柱中,以nL/min的流速水平進(jìn)行樣品分離,具有樣品需求量低、溶劑消耗少、選擇性高、靈敏度高、分離快速等特點[8-12]。對于多肽/蛋白質(zhì)等樣品的液相色譜分離,最常見的是以表面鍵合C18為代表的反相色譜固定相和以強(qiáng)陽離子交換(strong cation exchange, SCX)為代表的離子交換色譜固定相[13]。C18固定相通過疏水作用力依據(jù)樣品中各組分極性強(qiáng)弱進(jìn)行分離,疏水性越強(qiáng)的組分在反相固定相中的保留越強(qiáng)[14]。SCX則是通過離子相互作用對樣品進(jìn)行分離,樣品各組分的離子價位越高、離子半徑越小,則SCX對其保留越強(qiáng)[15,16]。

本研究在海洋魚類抗氧化肽經(jīng)典制備工藝的基礎(chǔ)上[17,18],針對馬鮫魚體系,從5種食品加工常用水解酶中篩選出最佳水解酶,進(jìn)而基于響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到馬鮫魚內(nèi)臟抗氧化肽的最佳制備方法。為篩選出適合于馬鮫魚內(nèi)臟抗氧化肽分離分析的色譜固定相,基于納流高效液相色譜平臺進(jìn)行分離純化,分別考察了反相C18柱和SCX柱對馬鮫魚內(nèi)臟氧化肽酶解液分離后各組分的抗氧化能力,篩選出具有高抗氧化活性的組分。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-20AD液相色譜儀,日本島津有限公司;Economic ECD2000紫外檢測器,捷克ECOM公司;絞肉機(jī),北京利仁科技責(zé)任有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;AL104-IC型電子分析天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;TG16-WS型臺式高速離心機(jī),湖南湘儀實驗儀器制造有限公司;HYP-308型消化爐,上海纖檢儀器有限公司;KDN-103F型自動凱氏定氮儀,上海纖檢儀器有限公司;400Y型中草藥粉碎機(jī),永康市鉑歐五金制品有限公司;FE20型精密pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-2012PC型紫外分光光度計,尤尼克-上海儀器有限公司;CJJ78-1型磁力攪拌器,常州市金壇晨陽電子儀器廠。

馬鮫魚內(nèi)臟,由惠安瑞芳食品有限公司提供;牛胰蛋白酶(250 USP u/mg),上海源葉生物科技有限公司;風(fēng)味蛋白酶(1.5×104u/g),上海吉至生化科技有限公司;酸性蛋白酶(8.0×105u/g)、中性蛋白酶(2.0×105u/g)、堿性蛋白酶(2.0×105u/g),江蘇銳陽生物科技有限公司;二苯代苦味肼基自由基(DPPH·),美國Sigma公司;異丙醇、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、95%乙醇、甲醛、水楊酸等,均為分析純試劑;乙腈為色譜純。

1.2 樣品預(yù)處理及條件優(yōu)化

馬鮫魚內(nèi)臟→解凍→清洗(除去魚卵、魚膽)→攪成糜狀→異丙醇浸提5 h后脫脂(重復(fù)3次)→55 ℃烘干→粉碎→過篩→馬鮫魚內(nèi)臟粉末→加入蒸餾水100 mL→熱變性處理15 min→調(diào)pH→加酶→酶解→水浴95 ℃滅酶10 min→離心10 min→取上清液→馬鮫魚內(nèi)臟抗氧化肽溶液(antioxidative peptide fromScomberomorusniphoniusviscera, APS)。

1.2.1酶的篩選

分別將風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶5種蛋白酶置于50 g/L馬鮫魚內(nèi)臟溶液中發(fā)生酶解反應(yīng),水解條件見表1。以DPPH·清除率、·OH清除率和水解度(DH)為指標(biāo),篩選最佳水解酶。

表 1 蛋白酶的水解條件

1.2.2響應(yīng)面試驗設(shè)計

在預(yù)實驗單因素試驗的基礎(chǔ)上,以DPPH·清除率為響應(yīng)值Y,以A(加酶量)、B(酶解溫度)、C(酶解時間)為自變量,考察胰蛋白酶水解條件。采用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計,設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗。試驗共17個試驗點,其中12個為析因點,自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點,5個為零點,為區(qū)域中心點,以估計誤差。因素水平編碼值見表2。試驗以隨機(jī)次序進(jìn)行,重復(fù)3次,取平均值。

表 2 響應(yīng)面分析試驗的因素和水平

1.3.1脫脂后馬鮫魚內(nèi)臟基本成分的測定

水分的測定采用常壓直接干燥法,參考GB 5009.3-2010[19];蛋白質(zhì)的測定采用微量凱氏定氮法,參考GB 5009.5-2016[20];脂肪的測定采用索氏抽提法,參考GB 5009.6-2016[21];灰分的測定采用高溫灼燒法,參考GB 5009.4-2016[22]。

1.3.2水解度的測定[23]

采用甲醛滴定法測定氨基酸態(tài)氮的含量[24]。準(zhǔn)確取出10.0 mL APS,加水定容于50 mL容量瓶中,搖勻,備用。吸取20.0 mL的備用樣品稀釋液于250 mL燒杯中,加入60 mL蒸餾水,放入轉(zhuǎn)子,轉(zhuǎn)動磁力攪拌器。將待測溶液攪拌穩(wěn)定后把精密pH計帶有的復(fù)合電極小心插入燒杯里的溶液中,再用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH為8.2,用移液管量取10.0 mL甲醛溶液加入待測液中,用轉(zhuǎn)子攪拌均勻。最后滴定至pH為9.2,用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定,并記下NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液所消耗的體積。取250 mL燒杯,裝入80 mL蒸餾水,進(jìn)行空白試驗且試驗條件與上述一樣,同時記下所消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。根據(jù)式(1)計算游離氨基酸態(tài)氮的含量:

(1)

式中:x為氨基酸態(tài)氮的含量,g/100 mL;c為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,mol/L;V1為液體中加入10 mL甲醛后,滴定至pH為9.2時所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,mL;V0為空白試驗加入甲醛后滴定至pH為9.2時氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液所消耗的體積,mL;V為測定時吸取樣品稀釋液的體積,mL; 10為測定用樣品溶液體積,mL; 0.0140為氮的毫摩爾質(zhì)量,g/mmol。

由式(2)計算樣品的水解度(DH):

(2)

式中:DH為樣品的水解度;x1為APS中游離氨基態(tài)氮的含量;x0為酶解前樣液中氨基態(tài)氮的含量;x為未酶解原料的蛋白液中游離氨基態(tài)氮的含量。

1.3.3抗氧化活性指標(biāo)的測定

DPPH·清除率的測定參考Liu等[25]的方法并加以改進(jìn)。將2 mL的APS加入到2 mL的2.0×10-4mol/L的DPPH·溶液中,均勻混合,在黑暗處靜置30 min后,用紫外分光光度計測定混合溶液在517 nm條件下的吸光度值(A2)。以2 mL無水乙醇與2 mL DPPH·溶液的吸光度為空白管(A0),以2 mL APS+2 mL無水乙醇的吸光值為對照管(A1)。清除率用式(3)計算:

(3)

式中:A0為2 mL無水乙醇+2 mL DPPH·溶液的吸光值;A1為2 mL APS+2 mL無水乙醇的吸光值;A2為2 mL APS+2 mL DPPH·溶液的吸光值。

·OH清除率的測定參考Zhang等[26]的方法并加以改進(jìn)。在試管中依次加入2 mL 5 mmol/L FeSO4、3 mL 6 mmol/L水楊酸、4 mL APS,搖勻后加入0.1% H2O22 mL,加蒸餾水定容至10 mL,搖勻,靜置30 min。計算樣品對·OH的清除能力(SA),如式(4):

(4)

式中:Ei為加APS體系的吸光度;Ej為不加水楊酸體系的吸光度;E0為不加APS體系的吸光度。

1.4 儀器條件

色譜分析柱:C18柱(15 cm×100 μm, 5 μm, 30 nm),SCX柱(15 cm×100 μm, 5 μm, 100 nm);樣品閥進(jìn)樣量:4 nL;檢測波長:214 nm;流速:0.6 mL/min;流動相:60%乙腈;洗脫方法:1∶1 000分流比,60%乙腈等度洗脫。

樣品溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)樣;結(jié)束后將同一個吸收峰收集的樣液混合濃縮,凍干,分析各峰組分的DPPH·清除力。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫脂后馬鮫魚內(nèi)臟基本成分分析

動物內(nèi)臟中往往含有較高的脂肪成分及其衍生物,由于脂肪對酶解會造成一定的影響,因此,在酶解前需要進(jìn)行脫脂處理[17]。對脫脂馬鮫魚內(nèi)臟粉末進(jìn)行基本成分的測定,結(jié)果顯示,馬鮫魚內(nèi)臟經(jīng)攪碎、異丙醇反復(fù)浸提脫脂后蛋白含量為79.45%,說明可作為良好的肽類制備來源。

圖 1 不同蛋白酶對酶解液水解度、DPPH·清除率和·OH清除率的影響(n=3)Fig. 1 Effect of various proteases on degree of hydrolysis,DPPH· and ·OH scavenging ability (n=3)

2.2 酶的篩選結(jié)果

由圖1可知,5種蛋白酶水解度的大小依次為胰蛋白酶>堿性蛋白酶>中性蛋白酶>風(fēng)味蛋白酶>酸性蛋白酶,胰蛋白酶酶解液清除DPPH·和·OH能力最強(qiáng),清除率分別為88.93%±0.82%和53.09%±0.73%,這與各種蛋白酶的水解能力大小排序基本一致。這可能是因為不同蛋白酶的酶解物中含有不同氨基酸序列的肽,而酶解物的自由基清除能力又和組成肽的氨基酸序列和長度密切相關(guān)。由此可推斷,胰蛋白酶水解物中可能含有更多的能減少自由基堆積和氧化反應(yīng)產(chǎn)生的活性肽[8]。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.3.1響應(yīng)面試驗結(jié)果與方差分析

表 3 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

綜上分析可得,該模型可以用來分析、預(yù)測胰蛋白酶酶解馬鮫魚內(nèi)臟制備抗氧化肽的工藝條件。

經(jīng)回歸擬合后,試驗因子對響應(yīng)值的影響可用回歸方程表示為:

Y=94.25-1.07A+1.00B+0.51C-1.04AB-
0.51AC-1.88BC-3.76A2-4.49B2-2.15C2

從表4可以看出,方程一次項中,A、B、C均達(dá)到顯著水平(p<0.05),其中,A、B對DPPH·清除率影響較大,達(dá)到極顯著水平(p<0.01)。在二次項中,A2、B2、C2(p<0.01)為極顯著項,三者系數(shù)均為負(fù)值,說明方程具有極大值點可進(jìn)行優(yōu)化分析[17]。交互項中,AB、BC達(dá)到極顯著水平(p<0.01),AC影響不顯著,可以看出各因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系[28]。

圖 2 加酶量和酶解溫度對DPPH·清除率交互影響的響應(yīng)面和等高線Fig. 2 Surface and contour plots of influence for the addition of enzyme and hydrolysis temperature against DPPH· scavenging ability

圖 3 加酶量和酶解時間對DPPH·清除率交互影響的響應(yīng)面和等高線Fig. 3 Surface and contour plots of influence for the addition of enzyme and hydrolysis time against DPPH· scavenging ability

2.3.2單因素的交互作用分析

由圖2～4可知,在不同酶解條件下,APS的DPPH·清除率與單因素結(jié)果具有較好的一致性。各因素之間有交互作用。其中加酶量和酶解溫度(p=0.007 5)、酶解時間和酶解溫度(p=0.000 3)之間的交互作用達(dá)到極顯著水平。

圖2顯示了當(dāng)酶解時間位于中心點即2.5 h時,酶解溫度和加酶量對DPPH·清除率的交互影響效應(yīng)。由圖2可以看出,在同一酶解溫度下,DPPH·清除率隨著加酶量的增加呈先上升后下降的趨勢;在同一加酶量下,DPPH·清除率隨著酶解溫度的增加而先增加后減少。

圖3顯示了當(dāng)酶解溫度位于中心點即40 ℃時,酶解時間和加酶量對DPPH·清除率的交互影響效應(yīng)。由圖3可以看出,在同一酶解時間下,DPPH·清除率隨著加酶量的增加而先增大后減小;在同一加酶量下,DPPH·清除率隨著酶解時間的增加而先緩慢增加后緩慢減少。二者交互作用相對較弱(p>0.05),這可能是由于即使提高了加酶量也仍需要一定的酶解時間使酶與底物得以適當(dāng)反應(yīng),使水解程度達(dá)到最佳狀態(tài),充分反應(yīng)而又不過度降解,從而生成DPPH·清除率較高的抗氧化肽。

圖4顯示了當(dāng)加酶量位于中心點即0.4%時,酶解時間和酶解溫度對DPPH·清除率的交互影響效應(yīng)。由圖4可以看出,在同一酶解溫度下,DPPH·清除率隨著酶解時間的增加而先增加后趨于平穩(wěn);在同一酶解時間下,DPPH·清除率隨著酶解溫度的升高而先升高后降低。說明在一定的酶解溫度范圍內(nèi),要達(dá)到較高的DPPH·清除率,適當(dāng)?shù)厣呙附鉁囟瓤梢钥s短酶解所需的時間。

圖 4 酶解溫度和酶解時間對DPPH·清除率交互影響的響應(yīng)面和等高線Fig. 4 Surface and contour plots of influence for hydrolysis temperature and hydrolysis time against DPPH· scavenging ability

根據(jù)Design Expert v8.0.6對模型進(jìn)行優(yōu)化,得出結(jié)果:加酶量0.368%、酶解溫度40.55 ℃、酶解時間2.545 h。在此條件下,模型預(yù)測APS對DPPH·的清除率達(dá)到94.415%。考慮到實際試驗時操作的可行性,調(diào)整工藝條件為:加酶量0.37%,酶解溫度41 ℃,酶解時間2.5 h。重復(fù)3次試驗,得到DPPH·清除率為93.78%±0.35%,與預(yù)測值相比,相對誤差為0.67%,說明擬合模型優(yōu)化出的條件較為準(zhǔn)確。在此條件下,APS的水解度為23.66%, ·OH清除率為62.59%。

在前人報道的工作中,李娜等[29]以鱈魚魚鰾為原料,采用復(fù)合蛋白酶酶解制備抗氧化肽,制備所得的抗氧化肽DPPH·清除率為61.1%。李致瑜等[17,18]以大黃魚內(nèi)臟為原料,選用堿性蛋白酶酶解制備抗氧化肽,所得抗氧化肽的DPPH·清除率為85.97%。本工作中,以馬鮫魚內(nèi)臟作為抗氧化肽源,胰蛋白酶表現(xiàn)出最優(yōu)的酶解效率,且DPPH·清除率達(dá)到93.78%的優(yōu)良水平,表明胰蛋白酶是馬鮫魚內(nèi)臟來源抗氧化肽制備的最優(yōu)水解酶。

2.4 納流液相色譜分離純化APS結(jié)果分析

為檢測出APS溶液各組分的抗氧化能力,本研究選用具有樣品需求量低、高靈敏度、高選擇性等特點的納流液相色譜法進(jìn)行分離。為了篩選出更適合APS分離純化的固定相,將經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后的APS溶液分別用C18納流色譜柱和SCX納流色譜柱進(jìn)行色譜分離,收集分離后的不同組分分別進(jìn)行DPPH·清除力表征,以篩選出抗氧化能力最高的組分。

圖 5 C18柱分離APS的高效納流液相色譜圖Fig. 5 nano-HPLC chromatogram of APS using C18 column Mobile phase: 60% ACN; flow rate: 0.6 mL/min; split ratio: 1∶1000; chromatographic column: C18, 15 cm×100 μm, 5 μm, 30 nm.

圖5、圖6分別為以C18柱和SCX柱分離APS的色譜圖。根據(jù)色譜圖可知C18柱分離APS得到6個組分,SCX柱分離APS得到9個組分。其中,SCX-1至SCX-5、SCX-6和SCX-7、SCX-8和SCX-9這3組的洗脫時間更為接近,表明這3組的電荷基團(tuán)強(qiáng)度接近,且保留時間越長的組分含有的陰離子越多,堿性也就越強(qiáng)。游麗君等[30]的工作表明,疏水性適中、堿性強(qiáng)的抗氧化肽具有更優(yōu)的抗氧化活性。為進(jìn)一步探究分離純化后各組分的抗氧化能力,對分離得到的各組分進(jìn)行收集,并進(jìn)行抗氧化活性能力檢測,檢測結(jié)果見圖7和圖8。

圖 6 SCX固定相分離APS的高效納流液相色譜圖Fig. 6 Nano-HPLC chromatogram of APS using SCX stationary phase Mobile phase: 60% ACN; flow rate: 0.6 mL/min; split ratio: 1∶1000; chromatographic column: SCX, 15 cm×100 μm, 5 μm, 100 nm.

圖 7 C18固定相分離后各組分的DPPH·清除力Fig. 7 DPPH· scavenging activity of fractions obtained on C18 column The letters indicate significant difference at 0.05 level (data=mean±standard, n=3).

圖 8 SCX柱分離后各組分的DPPH·清除力Fig. 8 DPPH· scavenging activity of fractions obtained on SCX column The letters indicate significant difference at 0.05 level (data=mean±standard, n=3).

由圖7可知,ULT-4組分的DPPH·清除力最高,半抑制濃度(IC50)為0.816±0.017 mg/mL,表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗氧化活性(p<0.05),效果為未純化的APS的11.2倍。由圖8可知,SCX-5組分的DPPH·清除力最高,IC50值為0.672±0.051 mg/mL,表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗氧化活性(p<0.05),效果為APS的13.6倍。兩者相比,SCX-5的抗氧化活性強(qiáng)于ULT-4,且SCX組各組分的抗氧化能力總體強(qiáng)于C18組,因此說明SCX固定相更適合APS的分離純化。

3 結(jié)論

本文以脫脂馬鮫魚內(nèi)臟蛋白為原料進(jìn)行酶的篩選。以DPPH·清除率為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面法優(yōu)化了馬鮫魚內(nèi)臟來源抗氧化肽的制備方法,得到最佳酶解條件:加酶量0.37%,酶解溫度41 ℃,酶解時間2.5 h,底物質(zhì)量濃度50 g/L,酶解pH 7.0。此條件下,馬鮫魚內(nèi)臟抗氧化肽的水解度為23.66%, DPPH·清除率為93.78%,·OH清除率為62.59%。DPPH·清除率與理論預(yù)測值的相對誤差在±1%以內(nèi),擬合模型較為準(zhǔn)確。

利用高效納流液相色譜平臺對馬鮫魚內(nèi)臟抗氧化肽進(jìn)行分離與活性篩選。SCX固定相無論是從分離的組分?jǐn)?shù)量,各組分的抗氧化能力,以及抗氧化能力最強(qiáng)組分等方面都明顯優(yōu)于C18固定相。所篩選出活性組分的抗氧化活性最強(qiáng),其DPPH·清除力的IC50值可達(dá)到0.672±0.051 mg/mL,為未純化時的13.6倍。結(jié)果表明,SCX固定相更加適用于馬鮫魚內(nèi)臟抗氧化肽的分離純化,對馬鮫魚內(nèi)臟來源抗氧化肽的活性篩選與深加工研究具有實際指導(dǎo)意義。