郭永斌，雷賽芬

（1.云南三正技術(shù)檢測有限公司，云南 昆明 650000；2.云南天博環(huán)境檢測有限公司，云南 昆明 650217）

葉綠素a是浮游植物光合作用的重要載體，占細(xì)胞干重的1%～2%，因此浮游植物葉綠素a含量成為浮游植物生物量的重要指標(biāo)而被廣泛應(yīng)用[1]。目前葉綠素的檢測主要有 《水和廢水分析方法》（第四版）[2]， 《水質(zhì) 葉綠素的測定 分光光度法》HJ 897-2017[3]標(biāo)準(zhǔn)方法用低溫干燥，經(jīng)過研磨、浸提法來提取葉綠素；《水質(zhì)葉綠素的測定分光光度法》SL 88-2012[4]標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)反復(fù)凍融使細(xì)胞破裂后提取葉綠素。標(biāo)準(zhǔn)方法選用的溶劑都是丙酮，標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測步驟用時比較長，因此葉綠素分解等造成提取過程中損失較大，重復(fù)測定的精密度較差，提取不夠完全。有研究對熱乙醇法的誤差進行了探討及比較了丙酮法的差異[5，6]，有研究對超聲波輔助熱乙醇法提取對方法進行了優(yōu)化[7]，本文綜合了浮游藻類植物細(xì)胞破碎的方法，對葉綠素a的測定方法進行了優(yōu)化探討，得到一個快速高效的提取方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

723G可見光分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司），SYU-7-200型超聲波清洗儀（鄭州生元儀器有限公司），F(xiàn)SH-2A可調(diào)高速勻漿機（方科儀器（常州）有限公司），離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。碳酸鎂（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），乙醇（天津市光復(fù)化學(xué)試劑有限公司），丙酮（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 樣品采集與保存

按照水質(zhì)浮游植物的采樣方法，在棕色玻璃瓶瓶中收集樣品1L，如樣品不能及時處理，每升水中需加1%碳酸鎂1mL，并冷藏避光保存。樣品采集后宜盡快分析完畢。本文中實驗樣品分別是樣品1（河水）、樣品2（湖水）、樣品3（池塘水）。

1.3 葉綠素a的提取

將0.2mL碳酸鎂懸浮液加入到一定量的樣品中，混勻后用直徑為60mm醋酸纖維濾膜抽濾，至過濾器內(nèi)無水后再抽吸幾分鐘。把載有濃縮樣品的濾膜放入離心管中（離心管外表用錫箔紙或黑色塑料袋包裹，避免葉綠素見光分解），置于-25℃的冰箱中30min，取出后加入5mL 70℃熱乙醇，用高速勻漿器勻漿5min，在置于70℃超聲波中破碎30min，以 4000r／min離心 5min，吸取上清液于10mL比色管中，再在離心管中加入熱乙醇3mL和2mL，同樣的操作步驟進行提取，吸取上清液合并至比色管中，定容至刻度線，過0.45μm有機系濾膜，待測。

1.4 葉綠素a的測定

將過濾后的上述溶液置于10mm比色皿中，以90%乙醇溶液作參比，多波長模式下測定750nm、664nm、647nm、630nm處吸光度，并將測試結(jié)果代入下式中進行計算。

ρ1為測定試液葉綠素a的質(zhì)量濃度，mg／L；V1為試樣定容體積，mL；V為取樣體積，L。

2 結(jié)果與討論

2.1 濾膜冷凍對檢測結(jié)果的影響

濾膜在-25℃冰箱中冷凍30min與不經(jīng)過冷凍處理直接提取，對三個不同樣品測定結(jié)果，測定的結(jié)果明顯高于直接測定的結(jié)果，如表1所示。在顯微鏡下進行觀察，冷凍過的樣品細(xì)胞破裂更充分，對葉綠素a的提取更完全。

表1 濾膜冷凍對檢測結(jié)果的影響

2.2 溶劑的選擇和溫度對葉綠素a的影響

有學(xué)者對葉綠素的提取溶劑選擇進行研究，提出丙酮作為葉綠素a的提取劑，造成樣品中目標(biāo)物提取不完全，且提取時間過長。該方法提取過程溶劑揮發(fā)較快，受人為因素影響也很大，如研磨是否充分，時間是否充足，溶劑較少，洗滌轉(zhuǎn)移效率難以保證等。引進的熱乙醇法[6]，90%熱乙醇（70℃）與90%丙酮（室溫）做萃取劑，取樣量為100mL，其余操作同1.3。兩種溶劑測定結(jié)果及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）熱乙醇法在2.4%～3.8%，丙酮法在5.3%～6.7%，葉綠素a在熱乙醇中的溶解度更大，因此提取效率明顯較高，精密度更好，見表2。

表2 3個樣品兩種不同提取溶劑6次重復(fù)結(jié)果

2.3 勻漿時間、超聲波提取時間、提取次數(shù)做正交試驗進行優(yōu)化

采用不同的勻漿時間，勻漿時間分別選擇2、5、10min，超聲波時間分別選擇10、20、30min，提取次數(shù)分別選擇1次，2次，3次（3因素3水平進行正交試驗）

表3 乙醇提取正交試驗表

從表3中得出：在這3個因素中，超聲萃取時間和提取次數(shù)顯著影響葉綠素a的提取，為主要影響因素，而勻漿時間為次要因素。同等條件下，在超聲時間為30 min萃取效果較好；重復(fù)提取3次效果較好；綜合考慮，這3個因素的最佳組合為勻漿時間為5min，超聲時間30 min，提取次數(shù)為3次。

3 結(jié)論

環(huán)保系統(tǒng)普遍采用的葉綠素a的標(biāo)準(zhǔn)方法提取時間長，步驟繁瑣，實驗人員長時間接觸丙酮試劑對身體也有害，而熱乙醇法易于操作、毒性低，不僅萃取完全而且重復(fù)性好。本文采用濾膜在-25℃低溫冰箱中冷凍30min，借助勻漿器和超聲波結(jié)合破碎藻類植物細(xì)胞，使用90%熱乙醇（70℃）作為提取溶劑，反復(fù)提取3次，大大地提高了葉綠素a的提取效率。本次試驗表明，濾膜在-25℃冰箱中冷凍30min冷凍處理，測定的結(jié)果明顯高于直接測定的結(jié)果，在顯微鏡下進行觀察，冷凍過的樣品細(xì)胞破裂更充分，對葉綠素a的提取更完全；使用熱乙醇提取葉綠素a，對比標(biāo)準(zhǔn)方法使用丙酮作為溶劑，葉綠素a在熱乙醇中的溶解度更大，提取效率更高，精密度更好；使用熱乙醇作溶劑時，正交試驗分析了勻漿時間、超聲萃取時間、提取次數(shù)三因素三水平下的萃取結(jié)果，發(fā)現(xiàn)勻漿時間為5min，超聲時間30 min，提取次數(shù)為3次取得的效果最好。