高歡歡，牛先前，楊桂平，郭 傲，陳 旭，鄭國華

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝產(chǎn)品貯運保鮮研究所，福建 福州 350002；3.福建省熱帶作物科學(xué)研究所，福建 漳州 363001）

0 引言

【研究意義】枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）是薔薇科（Rosaceae Juss）枇杷屬（Eriobotrya Lindl.）常綠果樹，枇杷果實在春天至初夏成熟，比其他水果都早，因此稱之為“南方早春第一佳果”。但不同類型枇杷果實品質(zhì)參差不齊，白肉枇杷果肉質(zhì)地鮮嫩細膩，鮮食口感好；紅肉枇杷果肉質(zhì)地較為粗糙、化渣性略差，但較白肉品種耐貯藏。果肉質(zhì)地的變化與果膠物質(zhì)的合成與降解密不可分[1]，從果膠代謝角度探索不同品種枇杷果肉質(zhì)地差異機理，對枇杷果肉品質(zhì)改良、栽培選育等具有重要意義。【前人研究進展】果實的成熟軟化往往伴隨果膠降解酶的參與，使原果膠溶解為可溶性果膠，進而參與果實軟化過程[2-3]。酶的活性受到相關(guān)基因的調(diào)控，是基因活化表達的結(jié)果[4]，近年來，果膠代謝相關(guān)酶的基因已陸續(xù)被克隆和功能鑒定[5-7]。目前關(guān)于枇杷果實品質(zhì)多集中于風(fēng)味、色澤、營養(yǎng)成分的研究[8-10]，枇杷果實質(zhì)地軟化機制與果膠代謝方面的研究遠不及對其他果樹研究?！颈狙芯壳腥朦c】白肉枇杷與紅肉枇杷果肉質(zhì)地差異較大，是探索枇杷果實成熟軟化與果膠代謝關(guān)系的理想材料，且關(guān)于這兩類枇杷果肉質(zhì)地發(fā)育與果膠降解差異的研究較少，分子層面研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以東湖早、早鐘6 號兩個紅肉枇杷品種和貴妃、白梨兩個白肉枇杷品種不同發(fā)育時期的果實為試材，比較果實果膠含量、果膠降解酶活性變化以及相關(guān)基因表達的動態(tài)規(guī)律，為枇杷品質(zhì)改良、栽培選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試材為枇杷紅肉品種早鐘6 號、東湖早及白肉品種白梨、貴妃不同發(fā)育期的果實，采自福建莆田市枇杷栽培示范基地。每個品種選取立地條件、生長勢、管理水平一致的枇杷樹各3 株，按物候期自謝花后75 d 進行第一次采樣，每隔10 d 采樣一次，直至果實成熟，共采樣5 次。每品種摘取大小一致、無病蟲害的果實30 個，采樣當(dāng)天運回實驗室，進行硬度測定后，去皮去核，果肉切塊混勻，裝于錫箔紙中液氮速凍后于-80℃冰箱保存留樣做后續(xù)試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 果實硬度測定 每品種取10 個枇杷果實，去皮后選取赤道部3 個點，采用GY-4 數(shù)顯水果硬度計測定果肉硬度，取平均值，結(jié)果以kg·cm-2表示。

1.2.2 不同形態(tài)果膠含量的測定 參照Fishman 等[11]和Brummell 等[12]的方法，依次得到水溶性果膠（Water soluble pectin, WSP）、離子結(jié)合型果膠（Ionic soluble pectin, ISP）、共價結(jié)合型果膠（Covalent soluble pectin,CSP），咔唑比色法測定果膠含量，用D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 酶活性的測定 果膠甲酯酶（Pectin methylesterase, PME）活性參照Lin 等[13]的方法，以果膠為底物，37 ℃反應(yīng)1 h，期間用0.05 mol·L-1NaOH 滴定，維持pH7.2，以每小時每g 鮮樣消耗1 umol·L-1NaOH 的酶用量為1 個酶活力單位（U）。多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase, PG）活性參照葉玉平[14]、董黎梨[15]的方法，略加改動，用透析法提取粗酶液，以40 ℃下每克果實每小時催化釋放1 mg D-半乳糖醛酸定義為1 個酶活力單位（U）；β-半乳糖苷酶（Beta-galactosidase, β-Gal）活性參照Basanta[16]的方法，以對硝基苯-β-D-吡喃半乳糖為底物，37 ℃反應(yīng)2 h，于405 nm 波長下測定吸光值，以每克果實每小時催化釋放1 μmol 4-硝基苯酚定義為1 個酶活力單位（U）。

1.2.4 相關(guān)基因?qū)崟r熒光定量分析 從課題組所測枇杷果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（未公開）中選取所需基因序列，采用Beacon Designer 7 軟件對相關(guān)基因設(shè)計特異性引物（表1），測定果膠甲酯酶（Pectin methylesterase, PME）、多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase,PG）、果膠裂解酶（Pectate lyase, PL）、β-半乳糖苷酶（Beta-galactosidase, β-Gal）基因表達量。實時熒光定量反應(yīng)體系按照TaKaRa 公司的TBGreen TM Premix Ex Taq TM 試劑盒說明書操作。使用Jena qTOWER2.2熒光定量儀檢測，設(shè)置3 個生物重復(fù)，3 個技術(shù)重復(fù)。以Actin 作為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCT進行數(shù)據(jù)分析，對不同品種果膠代謝相關(guān)基因的表達量進行相對定量分析。

表1 枇杷果實細胞壁相關(guān)酶基因qPCR 引物擴增序列Table 1 Primers for qPCR amplification on genes related to enzymes associated with loquat cell wall

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2019 和SPSS 19.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同果肉質(zhì)地枇杷果實發(fā)育期硬度的變化

圖1 表明，4 個品種枇杷果實硬度隨生長發(fā)育均呈下降趨勢。謝花后75 d，東湖早與貴妃枇杷果實硬度均顯著高于早鐘6 號與白梨，而早鐘6 號與白梨枇杷果實硬度二者無顯著差異。謝花后95～115 d，枇杷果實硬度下降速率增大，且貴妃、白梨2 個白肉品種果實硬度均顯著低于另外2 個紅肉品種。隨著果實成熟越高，白肉枇杷與紅肉枇杷的果實硬度差異越為明顯，即白肉枇杷硬度顯著小于紅肉枇杷品種，且白梨的果實硬度最小，均低于其他3 個枇杷品種，其硬度為0.464 kg·cm-2。

圖1 枇杷果實發(fā)育期硬度的變化Fig.1 Changes in firmness of loquat during fruit development

2.2 不同果肉質(zhì)地枇杷果實發(fā)育期果膠含量的變化

從圖2-A 可以看出，東湖早和早鐘6 號2 個紅肉品種果實水溶性果膠（WSP）含量隨果實生長發(fā)育表現(xiàn)出逐漸增加的規(guī)律；貴妃與白梨的WSP 含量在果實發(fā)育前期均先減少后快速增加。自謝花后95 d起，白肉枇杷果實WSP 含量上升幅度明顯大于紅肉品種，至果實成熟后期（謝花后115 d），4 個枇杷品種果實WSP 含量存在顯著差異，且白肉品種的WSP 含量顯著高于紅肉品種，約為紅肉品種的1.4倍。果實成熟時WSP 含量的快速增加使果肉軟化，這可能是造成白肉枇杷果肉質(zhì)地細膩的因素。

圖2 枇杷果實發(fā)育期果膠含量的變化Fig.2 Changes in pectin content of loquat during fruit development

由圖2-B 可見，4 個枇杷品種間離子結(jié)合果膠（ISP）含量呈現(xiàn)無規(guī)律的變化趨勢。果實發(fā)育早期（謝花后75 d），東湖早和白梨果實ISP 含量顯著高于另外兩個品種，至果實成熟后期含量有所下降；謝花后115 d，東湖早果實ISP 含量顯著高于另外3 個品種，且另外3 個品種間含量差異不顯著。

圖2-C 表明，4 個品種果實共價結(jié)合果膠（CSP）含量在發(fā)育過程中大體上均表現(xiàn)出先增加后減少的動態(tài)規(guī)律。謝花后85～95 d，白梨果實CSP 含量快速下降，使CSP 轉(zhuǎn)化為WSP，加快果實軟化進程；謝花后95～105 d，貴妃果實CSP 含量也出現(xiàn)大幅減少的現(xiàn)象；謝花后115 d，紅肉枇杷果實CSP 含量高于白肉枇杷，但品種間無顯著差異。

果實質(zhì)地與水溶性果膠與共價結(jié)合果膠的比值（WSP/CSP）密切相關(guān)，比值增大反映出CSP 含量的降低且伴隨著WSP 含量的升高，果實質(zhì)地變軟。如圖3 所示，4 個品種果實WSP/CSP 的比值在果實發(fā)育前期較低，謝花后115 d，比值快速上升，貴妃、白梨果實WSP/CSP 的比值顯著高于東湖早與早鐘6 號，其中白梨果實WSP/CSP 的比值最高達2.45，分別是東湖早與早鐘6 號果實的1.6 及1.9 倍。表明不同類型枇杷果實質(zhì)地與果膠形態(tài)的轉(zhuǎn)化關(guān)系密切。

圖3 枇杷果實發(fā)育期WSP/CSP 的比值變化Fig.3 Changes in WSP/CSP ratio of loquat during fruit development

2.3 不同果肉質(zhì)地枇杷果實發(fā)育期果膠代謝相關(guān)酶活性的變化

2.3.1 不同果肉質(zhì)地枇杷果實發(fā)育期PME 活性的變化 圖4 表明，4 個品種果肉的PME 活性隨果實生長發(fā)育先升高后降低。謝花后85～95 d，白梨PME活性迅速上升，而東湖早、貴妃、早鐘6 號PME 活性則是在謝花后95～105 d 迅速上升；謝花后115 d，4 個品種枇杷果肉PME 活性均降低，且4 個品種無顯著差異。白梨PME 活性較其他3 個品種提前迅速升高，可能導(dǎo)致白梨果肉提前進入軟化期，使其質(zhì)地發(fā)生變化。

2.3.2 不同果肉質(zhì)地枇杷果實發(fā)育期PG 活性的變化 圖5 表明，隨著枇杷果實的發(fā)育，PG 活性大體上逐漸上升，增長速率呈現(xiàn)“慢-快-慢”的規(guī)律。謝花后75～85 d，PG 活性保持較低水平，東湖早、早鐘6 號和貴妃枇杷果肉PG 活性無顯著差異，而白梨果肉PG 活性顯著高于另外3 個品種；謝花后95～115 d，4 個品種枇杷果肉PG 活性差異顯著，其中白梨枇杷果肉PG 表現(xiàn)出最高活性為13.5 U，東湖早活性最低為9.0 U，且均表現(xiàn)出白肉品種PG 活性高于紅肉品種的趨勢。

圖4 枇杷果實發(fā)育期PME 活性的變化Fig.4 Changes in PME activity of loquat during fruit development

圖5 枇杷果實發(fā)育期多PG 活性的變化Fig.5 Changes in PG activity of loquat during fruit development

2.3.3 不同果肉質(zhì)地枇杷果實發(fā)育期β-Gal 活性的變化 圖6 表明，β-Gal 活性的動態(tài)變化因枇杷品種而異：東湖早和貴妃果肉β-Gal 活性隨生長發(fā)育呈現(xiàn)出“先緩慢上升——再迅速上升——后緩慢下降”的變化規(guī)律；早鐘6 號β-Gal 活性的動態(tài)變化為“緩慢下降-迅速上升-下降”；白梨β-Gal 活性的動態(tài)變化為“緩慢下降-迅速上升-上升”。4 個品種枇杷果肉β-Gal 活性在果實發(fā)育前期（謝花后75～85 d）保持較低水平；謝花后105～115 d，2 個白肉品種果肉β-Gal 活性均顯著高于另外2 個紅肉品種，且在謝花后115 d，白梨β-Gal 活性顯著高于其他3 個枇杷品種，分別為東湖早、早鐘6 號和貴妃枇杷活性的1.7、1.8 及1.3 倍。

2.4 枇杷果實硬度、不同形態(tài)果膠與相關(guān)酶活性的相關(guān)性分析

圖6 枇杷果實發(fā)育期β-Gal 活性的變化Fig.6 Changes in β-Gal activity of loquat during fruit development

為探索不同品種枇杷果肉質(zhì)地與果膠代謝生理指標(biāo)相關(guān)性的一般規(guī)律，將紅肉品種東湖早、早鐘6 號及白肉品種貴妃、白梨兩類果實發(fā)育過程中的硬度與不同形態(tài)果膠、果膠代謝相關(guān)酶活性進行相關(guān)性分析（見表2）。

枇杷果實硬度、不同形態(tài)果膠及相關(guān)酶活性三者之間存在一定的相關(guān)關(guān)系，但因品種不同其相關(guān)性存在差異。枇杷果實硬度與WSP、PME、PG、β-Gal 存在極顯著負相關(guān)關(guān)系，但果實硬度與CSP 在白肉品種中極顯著正相關(guān)（r=0.739**），在紅肉品種中相關(guān)性不顯著。果實WSP 與PME、PG、β-Gal均存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，ISP 與各生理指標(biāo)相關(guān)性均不顯著，果肉CSP 與PG、β-Gal 存在顯著或極顯著負相關(guān)關(guān)系，而CSP 與PME 在白肉品種中極顯著負相關(guān)（r=-0.841**），在紅肉品種中負相關(guān)性不顯著。

表2 枇杷果實硬度、不同形態(tài)果膠與相關(guān)酶活性的相關(guān)性分析Table 2 Correlation between firmness, forms of pectin and related enzyme activities of loquat fruit

2.5 不同果肉質(zhì)地枇杷果實發(fā)育期果膠代謝相關(guān)基因的表達

2.5.1 不同果肉質(zhì)地枇杷果實發(fā)育期PME、PL 基因的表達 如圖7-A 可知，貴妃和早鐘6 號PME 基因相對表達量的變化規(guī)律基本一致，先上升后下降，但二者不在同一時期達到最大表達量，分別在謝花后95 d 和謝花后85 d 達到最大表達水平；東湖早PME 基因相對表達量隨生長發(fā)育先升高再降低，后期又略微回升；白梨則呈現(xiàn)先降低后升高再降低的波動變化?？傮w而言，東湖早PME 基因總的相對表達量顯著高于其余3 個品種。

如圖7-B 可見，4 個品種枇杷果肉的PL 相對表達量在果實生長發(fā)育期的變化趨勢總體上一致，均是先上升后下降，但白梨的PL 相對表達量在果實成熟后期（謝花后115 d）又出現(xiàn)上升現(xiàn)象。謝花后85～105 d，貴妃PL 基因相對表達量均處于最高水平，使其在生長發(fā)育過程中提前進行果膠質(zhì)的降解，為后期果實軟化做鋪墊；謝花后115 d，白梨PL 基因相對表達量的升高，使果膠物質(zhì)降解加速，加速果肉質(zhì)地變軟。

2.5.2 不同果肉質(zhì)地枇杷果實發(fā)育期PG、β-Gal 基因的表達 由圖8-A 可知，4 個品種枇杷果肉PG 基因表達量均呈先上升后下降的動態(tài)變化，東湖早、貴妃、白梨果肉PG 基因相對表達量在花后105 d 達到最大值，早鐘6 號PG 基因相對表達量在花后95 d 達到最大值。花后85 d 至果實成熟，貴妃枇杷果肉的PG 活性均高于另外3 個品種，花后105～115 d，2 個白肉品種PG 基因表達量顯著高于2 個紅肉品種。

圖7 枇杷果實發(fā)育期PME 和PL 基因表達的變化Fig.7 Changes in PME and PL expressions of loquat during fruit development

圖8 枇杷果實發(fā)育期PG 和β-Gal 基因表達的變化Fig.8 Changes in PG and β-Gal expressions of loquat during fruit development

如圖8-B 所示，貴妃和早鐘6 號β-Gal 基因相對表達量的動態(tài)變化基本一致，先增多后減少至果實成熟后期又略有增加，貴妃果肉β-Gal 基因總表達量高于早鐘6 號；東湖早β-Gal 基因相對表達量先增加后減少，而白梨與之相反，呈現(xiàn)先減少后增加的變化。謝花后115 d，貴妃白梨果實β-Gal 基因相對表達量顯著高于另外2 個枇杷品種。

3 討論

果膠是植物細胞壁初生壁與中膠層的主要成分，是維持細胞壁機械強度與物理強度的關(guān)鍵因素之一[17]?；艉炅恋萚18]研究發(fā)現(xiàn)，秋子梨WSP 隨果實成熟軟化進程逐漸增加，且與果實硬度負相關(guān)性達極顯著，本試驗研究也得到了基本一致結(jié)果。本試驗與許多研究均表明[19-21]，果實WSP 含量的升高，CSP 含量的下降是促使果肉質(zhì)地變軟的重要條件。本研究結(jié)果表明，隨著枇杷果實發(fā)育成熟，白肉枇杷與紅肉枇杷的WSP 逐漸增加均與果實硬度存在極顯著負相關(guān)關(guān)系，白肉品種貴妃、白梨果實WSP 上升幅度大且在成熟后期顯著高于紅肉品種，這可能是造成白肉枇杷果肉細膩、質(zhì)地較軟的因素之一。4 個品種果實CSP 含量在整個發(fā)育階段中整體表現(xiàn)出先增加后減少的動態(tài)變化，果實成熟后期，紅肉品種CSP 含量高于白肉品種，但差異不顯著，這就是東湖早、早鐘6 號比白肉品種耐貯運的原因。本試驗相關(guān)性顯示，白肉枇杷果實硬度與WSP 含量之間負相關(guān)性達極顯著水平，與CSP 含量之間的正相關(guān)性也是極顯著，但與ISP 含量的相關(guān)性較小，由此可見，WSP 的增加及CSP 含量的降低與枇杷果實質(zhì)地的形成密不可分，而ISP 含量對枇杷果實質(zhì)地影響較小、甚至沒有影響。本研究用WSP/CSP 的比值來表述枇杷果實質(zhì)地相關(guān)性指標(biāo)，比上述3 個單一指標(biāo)更能說明果實質(zhì)地關(guān)鍵因子，在本研究中，謝花后110～115 d，貴妃、白梨果實WSP/CSP 的比值顯著高于東湖早與早鐘6 號，比值升高通常伴隨著果肉質(zhì)地的軟化，這也驗證了枇杷果肉質(zhì)地的差異與細胞壁中果膠存在的形式及比值有很大關(guān)系。

迄今為止已在果實中發(fā)現(xiàn)多種果膠降解酶，其中最為關(guān)鍵的是果膠酯酶（PME）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）[22]。研究發(fā)現(xiàn)[23-25]，不同樹種或品種的果膠降解相關(guān)酶的活性差異很大，這表明果膠降解酶在果實軟化方面發(fā)揮的作用具有樹種或品種的特異性。高利平等[26]研究發(fā)現(xiàn)在蘋果果實發(fā)育進程中，綿肉品種蘋果的PME 活性一直高于脆肉品種，PME 可能是導(dǎo)致蘋果質(zhì)地發(fā)綿的關(guān)鍵酶。本研究結(jié)果中，4 個品種枇杷果實PME 活性均逐漸上升，至謝花后115 d 表現(xiàn)出略微降低的變化，白梨果實PME 活性較另外3 個品種提前快速上升可能會導(dǎo)致其提前進入軟化期，果肉質(zhì)地發(fā)生改變。齊秀東等[27]的研究表明PG 導(dǎo)致的果膠多糖解聚的可能是造成不同品種梨果實質(zhì)地差異的關(guān)鍵因素。本研究枇杷果實PG 活性隨生長發(fā)育逐漸上升，與果實發(fā)育進程中質(zhì)地變化相吻合，β-Gal 活性動態(tài)變化趨勢因枇杷品種而異，但整體上果實成熟后期β-Gal 活性上升，且在謝花后105～115 d，均表現(xiàn)出白肉品種果實的PG 與β-Gal 活性顯著高于紅肉品種的現(xiàn)象，這與楊國慧與莊軍平等[28-29]在樹莓和香蕉上的相關(guān)研究結(jié)果相似，同時表明這2 種酶均參與了果實細胞壁果膠物質(zhì)的降解過程，但發(fā)揮的作用不盡相同。果實成熟后期，白肉枇杷果實PG 活性、β-Gal 活性顯著高于紅肉枇杷，但PME 活性在4 個品種間無顯著差異，表明果實成熟后期PG 活性、β-Gal活性差異是造成紅肉枇杷與白肉枇杷的關(guān)鍵因素之一。

鄧佳等[30]研究發(fā)現(xiàn)隨著葡萄柚果實后熟軟化，與果膠物質(zhì)降解有關(guān)的PG 和PME 基因表達量均隨果實軟化呈不同程度增加。周敏等[31]認為，PL 基因是調(diào)控果實軟化的重要靶點。本研究中PME、PL、PG 基因相對表達量的變化趨勢因枇杷品種而異，但總體上，PME 與PG 基因相對表達量在果實發(fā)育前期維持較高水平，PL 基因相對表達量則在果實發(fā)育后期較高，這也說明了這3 個基因作用于果膠物質(zhì)存在時間上的差異。雖然本研究中在果實發(fā)育后期，東湖早枇杷果肉PME 基因表達量顯著高于另外3 個品種，但是在謝花后105～115 d，東湖早及早鐘6 號果肉WSP 含量顯著低于貴妃及白梨這2 個白肉品種枇杷，可以推斷PME 基因并不是導(dǎo)致紅肉枇杷與白肉枇杷果肉質(zhì)地差異的關(guān)鍵基因。隨果實生長發(fā)育PL 基因表達量變化與枇杷果肉質(zhì)地變化進程一致，且在謝花后115 d，白梨PL 基因在謝花后115 d的上調(diào)表達，對果膠的降解起調(diào)控作用，使果肉迅速軟化，而早鐘6 號PL 基因下調(diào)表達，這可能是造成二者果肉質(zhì)地差異的關(guān)鍵。枇杷果實成熟后期，白肉枇杷PG 與PL 基因表達量顯著高于紅肉枇杷，加快果膠降解，與白肉枇杷果實成熟后期果肉快速軟化有關(guān)。周厚成等[32]從草莓果實中分離出的新基因FaT β-gal，在果實軟化中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果中，謝花后105～115 d，貴妃和白梨果實β-Gal 基因均上調(diào)表達，東湖早與早鐘6 號β-Gal 基因表達量出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象，且白肉枇杷果實β-Gal 基因相對表達量顯著高于紅肉枇杷，是白肉品種果肉質(zhì)地較紅肉品種更加細膩、化渣性好的關(guān)鍵作用基因。

4 結(jié)論

果實成熟后期，白肉品種與紅肉品種果實硬度、WSP、WSP/CSP 存在差異，較高的WSP 含量以及WSP/CSP 比值的升高是白肉品種枇杷細膩化渣的因素之一。謝花后115 d，白肉品種果實PG、β-Gal 活性顯著高于紅肉品種，但PME 活性在4 個品種間無顯著差異，表明果實成熟后期PG、β-Gal 活性的不同將造成紅肉枇杷與白肉枇杷果肉質(zhì)地差異的形成。紅肉枇杷和白肉枇杷果實成熟后期質(zhì)地品質(zhì)的差異是果膠降解相關(guān)基因相互協(xié)調(diào)作用的結(jié)果，其中PL、PG、β-Gal 是關(guān)鍵基因。