淦岷，王永武，王麗，陸偉，段青云

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院 口腔科，浙江 杭州 310006；2.杭州市丁橋醫(yī)院 口腔科，浙江 杭州 310022）

頸部淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移是頭頸外科惡性腫瘤研究的重點，尤其是對臨床檢查陰性（cN0）者進行頸淋巴結(jié)清掃一直存有爭議[1]。黃建瑤等[2]學(xué)者報道cN0期口腔鱗狀細胞癌（oral squamous carcinoma,OSCC）患者側(cè)頸部淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移率約為28.1%。目前臨床頸部隱匿性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)多為有創(chuàng)性，包括超聲引導(dǎo)下針吸細胞學(xué)檢查、正電子發(fā)射體層攝影術(shù)、前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)等，由于其對臨床經(jīng)驗和檢測技術(shù)要求較高，而且費用昂貴，因此難以在全國范圍內(nèi)開展[3]。目前與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的分子生物學(xué)有望為臨床無創(chuàng)檢測提供新的方法和思路。Naa10p 屬于N-乙酰轉(zhuǎn)移酶家族成員之一，其作用靶點眾多、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，在多種惡性腫瘤組織中呈高表達[4]。microRNA-342（miR-342）位于14 號染色體編碼Enah/Vasp 樣蛋白的內(nèi)含子上，對舌癌、肝癌等的轉(zhuǎn)移都有一定影響，關(guān)于miR-342 在OSCC 中的研究尚少。本研究旨在探討OSCC 患者唾液中miR-342 表達和Naa10p 水平與臨床病理特征和頸部淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的關(guān)系，旨在為OSCC 的臨床診斷和個體化治療提供依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年5月—2019年12月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院接受原發(fā)灶擴大切除術(shù)及頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)的OSCC 患者85 例作為OSCC 組。OSCC 組男性57 例，女性28 例；年齡28 ～76 歲，平均（56.01±11.78）歲；舌癌37 例，牙齦癌23 例，頰黏膜癌12 例，口底癌8 例，硬腭癌5 例；經(jīng)術(shù)中或術(shù)后病理檢查確診為頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移者35 例。同期于本院就診的30 例癌前病變患者作為癌前病變組，其中男性18 例，女性12 例；年齡18 ～79 歲，平均（57.37±14.56）歲；口腔扁平苔癬患者14 例，口腔白斑患者11 例，口腔紅斑者3 例，慢性潰瘍長期不愈者2 例。隨機選擇同期于本院體檢的健康志愿者30例作為對照組，經(jīng)口腔檢查確診無口腔黏膜或牙周黏膜疾病，全身檢查無系統(tǒng)性疾病。其中男性15 例，女性15 例；年齡22 ～80 歲，平均（59.23±16.71）歲。納入標準：①原發(fā)性鱗狀細胞癌；②首次確診；③術(shù)前未經(jīng)放、化療及其他抗腫瘤治療；④術(shù)前臨床資料完整，經(jīng)捫診、影像學(xué)（CT、MRI）檢查未發(fā)現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，確診為cN0。排除標準：合并其他惡性腫瘤、急慢性感染、嚴重肝和腎功能障礙、心腦血管疾病或其他有可能干擾miR-342 表達、Naa10p 水平表達者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，且與所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 唾液標本采集采集OSCC 組術(shù)前，癌前病變組確診時及對照組入組時和晨起唾液標本，采集前需用清水漱口5 min。收集2 份未經(jīng)刺激的唾液標本各2 ml，室溫下離心，將清亮唾液保存至無菌樣本管中，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 qRT-PCR采用Trizol 法抽提唾液上清液總RNA。采用試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，miR-342 莖環(huán)引物序列為：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCC GAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGCC-3'，長度45 bp；內(nèi)參小分子U6 snRNA 引物序列為：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，長度47 bp。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，冰浴中配制20μl PCR 反應(yīng)體系，包括2×SsoAdvanced SYBR Green Supermix 10μl，cDNA 模板2μl，正反向引物各1μl，加入dd H2O 水適量。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，共40 個循環(huán)，60℃繼續(xù)延伸5 min。將閾值設(shè)定在熒光值對數(shù)圖的線性部分，計算循環(huán)閾值。以2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.2.3 唾液Naa10p 檢測嚴格按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，先配制標準品溶液，治療濃度分 別 為2 000.00 pg/ml、1 000.00 pg/ml、500.00 pg/ml、250.00 pg/ml、125.00 pg/ml、62.50 pg/ml、31.25 pg/ml及0.00 pg/ml，檢測酶標儀450 nm 處的光密度值，根據(jù)標準品的光密度值繪制標準曲線。另采用同樣步驟檢測樣本的光密度值，計算其對應(yīng)的質(zhì)量濃度。

1.3 試劑和儀器

Naa10p 酶聯(lián)試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司（檢測范圍31.25 ～2 000 pg/ml，檢測限：9.64 pg/ml，重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)＜10%，板間變異系數(shù)＜15%）。Trizol LS 試劑盒購自美國Invitrogen 公司，mirVana PARIS Kit 購自美國Ambion 公司，One Step PrimeScript cDNA Synthesis Kit 和SYBR Green PCR master Mix 購自日本TaKaRa 公司，酶標儀、iQ5 Realtime PCR System 購自美國Bio-Rad 公司。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗。繪制ROC 曲線，影響因素的分析采用多因素Logistic 回歸模型，相關(guān)性分析用Pearson 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組臨床資料比較

各組唾液中miR-342 表達及Naa10p 水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；癌前病變組和OSCC 組miR-342 表達較對照組降低，Naa10p 水平較對照組升高（P＜0.05）。另外，OSCC組miR-342 表達較癌前病變組降低，Naa10p 水平較癌前病變組升高（P＜0.05）。各組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組臨床資料比較

2.2 OSCC 患者唾液miR-342 與Naa10p 蛋白的相關(guān)性

經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析，OSCC 患者唾液miR-342與Naa10p 蛋白呈負相關(guān)（r=-0.693，P=0.000）。見圖1。

2.3 OSCC 患者唾液miR-342 表達及Naa10p水平與臨床病理特征的關(guān)系

不同腫瘤生長方式、腫瘤直徑及是否發(fā)生頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的OSCC 患者唾液miR-342 表達及Naa10p 水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

圖1 OSCC 患者唾液miR-342 與Naa10p 蛋白的相關(guān)性散點圖

表2 OSCC 患者臨床病理特征與唾液miR-342、Naa10p 相對表達量的關(guān)系 （±s）

表2 OSCC 患者臨床病理特征與唾液miR-342、Naa10p 相對表達量的關(guān)系 （±s）

臨床特征 n miR-342 t/F 值 P 值 Naa10p 蛋白/（pg/ml） t/F 值 P 值性別男57 0.73±0.26 1.037 0.303 307.49±159.64 0.654 0.515女28 0.79±0.23 283.74±152.53年齡≤50 歲 26 0.81±0.24 1.376 0.173 313.62±168.31 0.542 0.589＞50 歲 59 0.73±0.25 293.52±152.59原發(fā)灶部位舌癌 37 0.73±0.25 0.323 0.862 307.63±171.16 0.063 0.993牙齦癌 23 0.76±0.26 297.37±153.32頰黏膜癌 12 0.72±0.27 295.18±148.74口底癌 8 0.83±0.24 278.19±152.02硬腭癌 5 0.78±0.24 296.44±143.61分化程度高-中分化 54 0.76±0.25 0.525 0.601 297.70±158.11 0.152 0.880低-未分化 31 0.73±0.26 303.10±157.09生長方式外生型 45 0.78±0.24 3.923 0.024 266.83±145.80 4.784 0.011潰瘍型 28 0.78±0.27 301.86±175.06浸潤型 12 0.57±0.15 417.71±89.06腫瘤直徑T1（＜2 cm） 24 0.94±0.17 42.008 0.000 200.69±118.73 19.276 0.000 T2（2～4 cm） 43 0.77±0.20 290.84±121.53 T3/4（＞4 cm） 18 0.44±0.11 452.72±164.41頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移否50 0.83±0.24 3.778 0.000 259.85±135.27 2.921 0.005是35 0.64±0.21 356.56±169.49

2.4 OSCC 患者唾液miR-342 和Naa10p 對頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的診斷價值

經(jīng)ROC 曲線分析，唾液miR-342 和Naa10p 蛋白診斷OSCC 患者頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的截斷值分別為0.595、386.10 pg/ml，敏感性分別為80.00%（95% CI：0.670，0.888）和78.00%（95% CI：0.648，0.872），特異性分別為54.29%（95% CI：0.382，0.695）和42.86%（95% CI：0.280，0.571），AUC 分別為0.720（95% CI：0.614，0.827）和0.662（95% CI：0.546，0.778），唾液miR-342對頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的診斷效能高于唾液Naa10p 蛋白，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=7.145，P=0.000）。見圖2。

2.5 頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的多因素Logistic 回歸分析

以頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移作為因變量，將性別、年齡、原發(fā)灶部位、腫瘤分化程度、生長方式、腫瘤直徑、miR-342 及Naa10p 納入回歸方程進行多因素Logistic 回歸分析（α入=0.05），結(jié)果顯示：腫瘤浸潤型生長方式、腫瘤直徑＞4 cm（T3/4期）和唾液Naa10p蛋白＞386.10 pg/ml 為OSCC 頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的危險因素（P＜0.05），而唾液miR-342 ≥0.595 為OSCC頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的保護因素（P＜0.05）。見表3。

圖2 唾液miR-342、Naa10p 蛋白診斷OSCC 患者頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的ROC 曲線

表3 頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的多因素Logistic 回歸分析參數(shù)

3 討論

手術(shù)是OSCC 最主要的治療方式之一，由于頭頸部的淋巴引流十分復(fù)雜，因此精確評估頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對于選擇合理的手術(shù)方式，以及療效判斷、預(yù)后評估都具有重要的臨床價值[5]。但是目前尚缺乏有效的無創(chuàng)檢測方法可準確判斷頸部淋巴結(jié)的隱匿性轉(zhuǎn)移灶，是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和患者預(yù)后較差的主要原因[6]。韓尚志等[7]通過回顧性分析111 例cN0OSCC 患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移率為27.03%。胡馨元等[8]也證實，OSCC 頸部淋巴結(jié)的隱匿性轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的獨立危險因素。本研究共納入了85 例接受原發(fā)灶擴大切除術(shù)及頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)的cN0原發(fā)性O(shè)SCC 患者，其中35 例（41.18%）患者發(fā)生隱匿性轉(zhuǎn)移，與其他文獻中的流行病學(xué)數(shù)據(jù)大致一致[7-8]。

近些年，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于RNA的生物標志物包括編碼和非編碼RNAs 逐漸被證實可用于惡性腫瘤的篩查和診斷[9]。Naa10p 屬于N-乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白NatA 唯一具有催化活性的亞基之一，通過催化腫瘤相關(guān)基因發(fā)生乙?；虿灰蕾囉谝阴；膮f(xié)同轉(zhuǎn)錄抑制活性，從而參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為[10]。鄭軍等[11]通過Envision TM 免疫組織化學(xué)法檢測，證實OSCC 黏膜組織中Naa10p 蛋白的表達水平較白斑組織及正常黏膜組織均顯著升高，并且與原發(fā)灶TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分化程度密切相關(guān)。目前血清、組織、糞便等都屬于常用的用于腫瘤標志物檢測的重要介質(zhì)，但是筆者考慮到OSCC 位置特殊，與唾液密切接觸，唾液中含有大量唾液腺腺體細胞分泌的酶類、激素、抗體等，以及腫瘤組織中滲出的細胞因子，而且樣本采集方便、便于運輸和保存等，因此在本研究中，筆者選擇檢測唾液中miR-342 和Naa10p。結(jié)果顯示，Naa10p 在OSCC 患者唾液中的含量高于癌前病變患者和健康對照人群，這與鄭軍等[11]在OSCC 黏膜組織中的檢測結(jié)果基本一致。另外，WANG 等[12]通過細胞實驗證實，上調(diào)miR-342 表達可靶向調(diào)控急性粒細胞白血病細胞Kg1a 和HL60 中Naa10p基因的表達和轉(zhuǎn)錄，進而抑制腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。SONG 等[13]也發(fā)現(xiàn)miR-342 在OSCC 發(fā)生、發(fā)展過程具有類似抑癌基因的活性，可作為OSCC 診斷和治療的潛在靶點。在本研究中，OSCC 患者唾液中miR-342 相對表達量較癌前病變患者和健康對照人群顯著降低，而且與唾液中Naa10p 蛋白呈負相關(guān)。

除此以外，唾液中miR-342 表達、Naa10p 蛋白水平均與原發(fā)灶生長方式、腫瘤直徑和頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)。惡性腫瘤具有呈三維方向侵襲周圍組織的形態(tài)學(xué)特征，韓尚志等[14]認為浸潤型OSCC 患者發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的的風(fēng)險較外生型和潰瘍型更高。MELCHERS 等[15]則證實原發(fā)灶浸潤深度＞4.00 mm 可作為判斷早期口腔癌（pT1cN0）頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨界閾值。Naa10p 與DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1具有協(xié)同作用，以不依賴乙?；钚缘姆绞酱龠M下游E-cadherin等抑癌基因CpG 島甲基化，進而抑制其轉(zhuǎn)錄，促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。而miR-342 也可以靶向DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1，抑制結(jié)腸癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移。另外，唾液中miR-342 和Naa10p 蛋白可作為頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的重要診斷指標。唾液Naa10p 蛋白＞386.10 pg/ml 可視為評估OSCC 頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的獨立危險因素，而唾液miR-342 ≥0.595 可視為評估OSCC 頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的獨立保護因素。唾液miR-342 對頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的診斷效能較Naa10p 蛋白更敏感，AUC＞0.7?？紤]到本研究納入的樣本量偏少，不可避免會出現(xiàn)一定的假陽性結(jié)果，這也是本研究的主要缺陷。但是無論如何，唾液miR-342 和Naa10p 蛋白表達差異對OSCC 患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移確實有一定的預(yù)警價值，而且與患者腫瘤直徑和腫瘤生長方式也有關(guān)聯(lián)。

綜上所述，OSCC 患者唾液miR-342 表達降低，Naa10p 蛋白水平升高，且兩者具有靶向調(diào)控關(guān)系，唾液中miR-342 和Naa10p 表達與頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有望成為早期診斷的潛在指標。對于唾液Naa10p 蛋白＞386.10 pg/ml 且唾液miR-342＜0.595 的OSCC 患者，建議進行淋巴結(jié)清掃術(shù)，以免二次手術(shù)或頸部腫瘤復(fù)發(fā)。