李建功，麥喆钘，李雪山△，羅川晉，李俊哲

(1. 中山市中醫(yī)院內(nèi)一科，廣東 中山 528400； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405)

心肌缺血再灌注損傷是指心肌組織在較長(zhǎng)時(shí)間心肌缺血后恢復(fù)血流灌注，反而出現(xiàn)比灌注前更明顯、更嚴(yán)重的功能損傷和組織障礙[1-2]。目前，該病的防治策略主要包括淺低溫治療、補(bǔ)充抗氧化劑等[3]。中醫(yī)藥防治心肌缺血再灌注損傷是當(dāng)今的研究重點(diǎn)[4-6]。

黃蛭口服液的功效為活血逐瘀、行氣化濁，在臨床常被用于高血壓、高血脂癥、冠心病等治療[7-8]。黃蛭口服液由大黃、水蛭、牛蒡子組成[9-10]。研究顯示，黃蛭口服液能顯著上調(diào)單核巨噬細(xì)胞ABCA1的水平[11]，明顯減少心律失常的發(fā)生率，減少血清丙二醇的產(chǎn)生，增加超氧化物歧化酶的含量[12]，在降低患者超敏C反應(yīng)蛋白、低密度脂蛋白、腦鈉肽水平方面有一定的輔助作用[13-14]。黃蛭口服液作為中成藥制劑，具有“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”的特點(diǎn)。但目前大多研究?jī)H停留于藥物對(duì)個(gè)體和個(gè)別分子的影響，其治療心肌缺血再灌注損傷的有效活性成分及作用機(jī)制尚不明確。而對(duì)于黃蛭口服液，仍未有任何相關(guān)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析黃蛭口服液的化學(xué)成分、作用靶標(biāo)、信號(hào)通路，揭示黃蛭口服液的多靶標(biāo)、多通路協(xié)同作用，從而發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和通路，為臨床治療心肌缺血性再灌注損傷提供新思路。

1 資料與方法

1.1 藥物化學(xué)成分和活性成分的獲取

通過(guò)檢索中國(guó)系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)(http://lsp.nwu.edu.cn/，TCMSP)獲取大黃和牛蒡子的化學(xué)成分，通過(guò)檢索文獻(xiàn)資料獲取水蛭的化學(xué)成分，再于TCMSP平臺(tái)檢索所有化學(xué)成分的信息，包括分子名(Molecule Name)、分子量(MW)、口服生物利用度(OB)、血腦屏障(BBB)、類(lèi)藥性(DL)等。結(jié)合毒藥物動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)置OB值≥40%和DL值≥0.18為篩選條件[15]，從所有化學(xué)成分中篩選出活性成分。

1.2 黃蛭口服液活性成分預(yù)測(cè)靶標(biāo)的獲取

將所有活性成分的3D結(jié)構(gòu)圖通過(guò)軟件Chembiodraw Ultra 12.0繪制出來(lái)，并上傳至DRAR-CPI服務(wù)器(http://cpi.bio-x.cn/drar/)?；诜聪蚍肿訉?duì)接原理，得到各活性成分與所有蛋白的結(jié)合親和力分?jǐn)?shù)(Z-score)。本團(tuán)隊(duì)選取分?jǐn)?shù)小于-0.5的蛋白作為黃蛭口服液的預(yù)測(cè)靶標(biāo)。并通過(guò)UniprotKB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)中獲取各預(yù)測(cè)靶標(biāo)的基因符號(hào)及其Uniprot ID。

1.3 心肌缺血再灌注損傷相關(guān)靶標(biāo)基因獲取

以“myocardial reperfusion injury”和“myocardial ischemia reperfusion injury”為關(guān)鍵詞分別從Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.disgenet.org/)中檢索出與心肌缺血再灌注損傷相關(guān)的蛋白，結(jié)合2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索結(jié)果作為本次研究的疾病靶標(biāo)。

1.4 活性成分-療效靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

取活性成分預(yù)測(cè)靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)兩者的交集，作為黃蛭口服液治療心肌缺血再灌注的療效靶標(biāo)。將療效靶標(biāo)及其對(duì)應(yīng)的活性成分導(dǎo)入軟件Cytoscape 3.5.1，構(gòu)建出活性成分-療效靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 療效靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將所有療效靶標(biāo)的Uniprot ID導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種條件為“Homo sapiens”，獲取療效靶標(biāo)之間的蛋白相互作用關(guān)系(Protein-protein interactions，PPI)，并利用軟件Cytoscape 3.5.1繪制出PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并使用NetworkAnalyzer工具對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得出各療效靶標(biāo)的degree值(連接度)，即各靶標(biāo)可相互作用的靶標(biāo)數(shù)。挑選出degree值最大的5個(gè)療效靶標(biāo)作為核心靶標(biāo)。

1.6 分子對(duì)接與分析

將上述5個(gè)核心靶標(biāo)導(dǎo)入System Dock Web Site 服務(wù)器(http://systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index)，按照服務(wù)器原始參數(shù)的設(shè)定，進(jìn)行核心靶標(biāo)與活性成分之間的分子對(duì)接，得出對(duì)接評(píng)分(Docking score)，并通過(guò)柱狀圖的方式展示結(jié)果。通過(guò)該評(píng)分評(píng)價(jià)成分與和核心靶標(biāo)之間的結(jié)合潛力。

1.7 分子功能與通路分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)療效靶標(biāo)進(jìn)行基因本體(Gene ontology，GO)富集分析和基于京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)的通路富集分析，再選取GO分析結(jié)果中的分子功能(Molecular Function)部分和KEGG分析結(jié)果中通路(KEGG PATHWAY)部分進(jìn)行討論。篩選出P值小于0.05和富集基因數(shù)較大的前20條通路與分子功能。篩選結(jié)果通過(guò)OmicShare網(wǎng)站(http://www.omicshare.com/)繪制的高級(jí)氣泡圖展示。

1.8 藥物-活性成分-潛在靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)文獻(xiàn)資料，從20條通路中再篩選出與心肌缺血再灌注相關(guān)的通路作為重要通路。再將與重要通路對(duì)應(yīng)的療效靶標(biāo)以及作用于療效靶標(biāo)的活性成分，導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1繪制“藥物-活性成分-療效靶標(biāo)-重要通路”網(wǎng)絡(luò)圖，閱圖分析黃蛭口服液的治療機(jī)制及特點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 黃蛭口服液的活性成分

按照步驟1.1本團(tuán)隊(duì)篩選到13個(gè)活性成分，其中大黃有5個(gè)，水蛭有5個(gè)，牛蒡子有3個(gè)，包括大黃酸(rhein)、決明內(nèi)酯(Toralactone)、水蛭素(hirudin)、森林山蛭素(haemadin)、牛蒡子苷(arctiin)。

2.2 心肌缺血再灌注損傷潛在作用靶標(biāo)預(yù)測(cè)

表1示，按照步驟1.2及1.3本研究共獲得活性成分預(yù)測(cè)靶標(biāo)126個(gè)和疾病靶標(biāo)1156個(gè)，最后得到療效靶標(biāo)76個(gè)。

2.3 成分-靶標(biāo)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

圖1示，按照步驟1.4繪制出活性成分-療效靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖。圖1共含有節(jié)點(diǎn)86個(gè)，包括13個(gè)八邊形的活性成分節(jié)點(diǎn)(內(nèi)圈)以及73個(gè)橢圓形的療效靶標(biāo)節(jié)點(diǎn)(外圈)；邊線120條，代表13個(gè)活性成分與73個(gè)療效靶標(biāo)之間共有120種作用關(guān)系。由此可見(jiàn)，黃蛭口服液治療心肌缺血再灌注損傷是通過(guò)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系而非簡(jiǎn)單的單一成分作用單一靶標(biāo)來(lái)發(fā)揮作用的。

圖1 活性成分-療效靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

表1 黃蛭口服液活性成分表

2.4 潛在靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

圖2示，按照步驟1.5得到73 個(gè)療效靶標(biāo)之間的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。由此可見(jiàn)，73個(gè)療效靶標(biāo)之間有著復(fù)雜的關(guān)聯(lián)，這提示黃蛭口服液不僅是因?yàn)樽饔糜诙鄠€(gè)靶標(biāo)發(fā)揮治療作用，還可因?yàn)槎鄠€(gè)療效靶標(biāo)之間的相互調(diào)節(jié)影響。同時(shí)本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在黃蛭口服液治療心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮較大作用的5個(gè)核心靶標(biāo)分別是ALB、AKT1、TNF、CASP3、JUN。

圖2 療效靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 分子對(duì)接

圖3示，按照步驟1.5對(duì)活性成分和核心靶標(biāo)進(jìn)行分子對(duì)接，得到對(duì)接評(píng)分結(jié)果。Docking score值大于7.0的成分有15個(gè)(23.1%)，Docking score值在5.0到7.0之間的有24個(gè)(36.9%)，在4.25到5.0之間的成分有17個(gè)(26.2%)，而Docking score值小于4.25 的成分僅有9個(gè)(13.8%)。綜上，黃蛭口服液的活性成分與核心靶標(biāo)具有良好的結(jié)合活性。

圖3 分子對(duì)接結(jié)果

2.6 GO分類(lèi)富集分析和KEGG通路富集分析

圖4、5示，按照步驟1.7得到GO分析和KEGG分析結(jié)果，其中P<0.05且富集靶標(biāo)較多的分子功能有protein binding、enzyme binding等；P<0.05且富集靶標(biāo)較多的生物通路有PI3K/AKT、TNF、p38MAPK、HIF-1等信號(hào)通路。

圖4 潛在作用靶標(biāo)的MF分析

2.7 藥物-活性成分-潛在靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

圖6示，按照步驟1.8本研究篩選到5條重要通路，分別是HIF-1 pathway、p38MAPK pathway、TNF pathway、PI3K/AKT pathway和Apoptosis。據(jù)此繪制出藥物-活性成分-療效靶標(biāo)-重要通路網(wǎng)絡(luò)圖，其中六邊形節(jié)點(diǎn)代表重要通路，圓形節(jié)點(diǎn)代表療效靶標(biāo)，三角形節(jié)點(diǎn)代表活性成分，矩形節(jié)點(diǎn)則為藥物。由圖可知，黃蛭口服液治療心肌缺血再灌注損傷是利用多成分作用于多靶點(diǎn)，影響多通路來(lái)發(fā)揮作用的。

圖6 “藥物-活性成分-療效靶標(biāo)-重要通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是常見(jiàn)的心血管疾病，需要引起臨床醫(yī)生的重視。研究發(fā)現(xiàn)，黃蛭口服液可降低腦鈉肽前體，同時(shí)還可提高PCI術(shù)后左室射血分?jǐn)?shù)，是治療再灌注損傷的首選藥物之一[16-17]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)原理，通過(guò)對(duì)各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的挖掘和檢索，構(gòu)建出“藥物-活性成分-療效靶標(biāo)-重要通路”網(wǎng)絡(luò)，對(duì)黃蛭口服液治療心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

研究發(fā)現(xiàn)，黃蛭口服液主要通過(guò)13個(gè)活性成分發(fā)揮治療作用，包括大黃酸(rhein)、水蛭素(hirudin)、牛蒡子苷(arctiin)等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸具有清除活性氧且明顯減少心肌缺血后產(chǎn)生毒物對(duì)心肌細(xì)胞的損害[18]。林冠宇[19]等研究發(fā)現(xiàn)，中低劑量的水蛭素可以通過(guò)增加VEGF蛋白合成以激活Notch通路，促進(jìn)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和微血管再生，加快缺血損害組織的恢復(fù)。Zhang[20]等發(fā)現(xiàn)，牛蒡子苷可抑制脂多糖誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和白蛋白等分泌過(guò)程，減少炎癥發(fā)生，降低炎癥對(duì)缺血心肌細(xì)胞的損害。

通過(guò)檢索這73個(gè)療效靶標(biāo)的相互作用關(guān)系，結(jié)合文獻(xiàn)閱讀，本研究認(rèn)為AKT1、TNF、JUN等靶標(biāo)在治療心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮最廣泛的作用。李東野[21]等研究發(fā)現(xiàn)，AKT1基因可以通過(guò)促進(jìn)抑凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)抑制促凋亡基因Bax的表達(dá)，通過(guò)兩方面的作用抑制心肌細(xì)胞凋亡。還有研究認(rèn)為，抑制JUN基因的轉(zhuǎn)錄也可以阻斷細(xì)胞凋亡反應(yīng)的發(fā)生[22]。再者減少TNF-α的釋放也可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡有效減輕心肌缺血再灌注損傷[23]。因此我們認(rèn)為，黃蛭口服液主要是通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生療效，具體可能是減少PCI術(shù)后活性氧等對(duì)有毒害作用物質(zhì)的產(chǎn)生。核心靶標(biāo)與13個(gè)活性成分分子對(duì)接結(jié)果顯示兩者結(jié)合活性良好，充分說(shuō)明本研究采用的方法學(xué)具有較好的科學(xué)性，結(jié)果與客觀事實(shí)比較接近，故此基礎(chǔ)上進(jìn)行構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)并分析，能為臨床使用或進(jìn)一步科學(xué)研究提供有價(jià)值的指導(dǎo)。

GO分析結(jié)果提示，黃蛭口服液可能通過(guò)影響蛋白結(jié)合功能起到治療心肌缺血再灌注損傷的作用。脂聯(lián)素受體結(jié)合蛋白是脂聯(lián)素受體1 的一個(gè)關(guān)鍵結(jié)合蛋白[24]，兩者的結(jié)合可以介導(dǎo)脂聯(lián)素在多種細(xì)胞中產(chǎn)生信號(hào)傳導(dǎo)作用，促進(jìn)脂聯(lián)素對(duì)缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)[25-26]，所以黃蛭口服液很有可能通過(guò)促進(jìn)不同蛋白的相互結(jié)合，從而發(fā)揮治療心肌缺血再灌注損傷的作用。

根據(jù)KEGG分析結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)查閱，本研究認(rèn)為HIF-1通路、p38MAPK通路、PI3K/AKT通路和細(xì)胞凋亡在治療心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮著較重要的作用。低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)能在低氧下激活多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，HIF-1通路是機(jī)體在缺氧狀態(tài)下調(diào)節(jié)各器官生化反應(yīng)的重要通路[27]。其中HIF-1α可以通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，減少大鼠心肌缺血再灌注損傷后炎癥的發(fā)生[28]，而且可以上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體的分泌與合成，有助于缺血組織血供的恢復(fù)[29]。p38MAPK通路參與心肌缺血再灌注、心室重構(gòu)等的發(fā)生[30-31]。而且研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK信號(hào)通路抑制劑可以改善心肌缺血再灌注損傷[32]。PI3K/AKT通路主要起到激活細(xì)胞和調(diào)控蛋白質(zhì)代謝的生物作用。AKT可以在PI3K/AKT通路中發(fā)揮中間環(huán)節(jié)的作用，調(diào)節(jié)眾多的下游通路，不僅可直接作用于Bcl-2家族，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)還可以激活eNOS通路，減少氧化損傷，對(duì)心肌缺血再灌注后誘發(fā)的心肌損傷有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[33]。

綜上所述，本研究從黃蛭口服液的活性成分、療效靶標(biāo)和重要通路入手，初步探討黃蛭口服液的治療機(jī)理，主要包括減少缺血后有細(xì)胞毒作用產(chǎn)物的生成，減輕炎癥對(duì)細(xì)胞的損害作用以及抑制心肌細(xì)胞的凋亡，同時(shí)促進(jìn)缺血組織的血供恢復(fù)。但其結(jié)果還顯示，黃蛭口服液可能通過(guò)乙肝病毒感染通路、結(jié)腸癌的發(fā)展來(lái)治療心肌缺血再灌注損傷，與現(xiàn)代研究大流方向不盡相同，但也說(shuō)明黃蛭口服液治療疾病在體內(nèi)起到多方面的調(diào)節(jié)作用。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的局限性，本研究存在一點(diǎn)片面性，仍需后續(xù)的具體研究進(jìn)一步驗(yàn)證。