周沛玲，嚴(yán)海超，游巧玲，延麗雅，周騰田

東莞市大朗醫(yī)院口腔科，廣東 東莞 523770

關(guān)健詞：人口腔鱗癌細(xì)胞；miR-30d-5p；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

口腔鱗癌是頭頸部常見惡性腫瘤，惡性度高、易早期發(fā)生轉(zhuǎn)移，且局部復(fù)發(fā)率高、預(yù)后較差，因而深入了解其發(fā)生發(fā)展機(jī)制具有重要臨床意義［1］。miRNA參與腫瘤細(xì)胞多種生物行為學(xué)，包括細(xì)胞分化、增殖、凋亡和代謝。在口 腔 鱗 癌 中， 包 括miR-655， miR-143， miR-1246，miR-221，miR-21，miR-135b，miR-29c 等 多 個(gè)miRNA參與腫瘤形成、侵襲和轉(zhuǎn)移［2-5］。我們既往發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因Beclin1 與口腔鱗癌分化、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［6］，采用Tarbase、miRDB、miRWalk 和TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示Beclin1 與miR-30d-5p 高度關(guān)聯(lián)、Beclin1 可能是他們下游靶基因。文獻(xiàn)顯示miR-30d-5p 參與了多種細(xì)胞生物學(xué)行為，如細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖侵襲［7-9］。然而尚不清楚miR-30d-5p 在調(diào)控人口腔鱗癌細(xì)胞（TSCC1）增殖和凋亡中發(fā)揮的作用，本研究旨在探尋上述作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

人口腔鱗癌組織，獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后收集中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院住院收治的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者，并收集術(shù)中切除的癌組織及癌旁組織標(biāo)本，標(biāo)本例數(shù)共收集20例。所有患者均簽署知情同意書。癌旁組織取自結(jié)口腔鱗癌組織＞5 cm 的組織標(biāo)本，取標(biāo)本后迅速放置在-80 ℃冰箱中保存待用。收集患者完整病例資料、臨床隨訪資料。

1.2 試劑耗材

TSCC1 購(gòu)于美國(guó)Cellosaurus 公司，Trizol 購(gòu)自Invitro?gen，MEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco，Real-Time PCR 試劑盒購(gòu)自Tiangen，MTT 試劑盒購(gòu)自碧云天公司，TUNNEL 試劑盒購(gòu)自Roche 公司， Beclin1 siRNA 購(gòu)自百恩維生物，miR-30d-5p mimic 和模擬物對(duì)照、miR-30d-5p 抑制劑和抑制劑購(gòu)自廣州銳博公司。

1.3 細(xì)胞處理

培養(yǎng)TSCC1 細(xì)胞，依據(jù)Lipo 3000 說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將miR-30d-5p 和miR-control、miR-30d-5p inhibitors 和anti-miR-control轉(zhuǎn)染至TSCC1，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后更換新鮮的培養(yǎng)基，MTT檢測(cè)細(xì)胞增值率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡。構(gòu)建Beclin1 siRNA。qPCR 測(cè)TSCC1 細(xì)胞中Be?clin1 表達(dá)情況以確保沉默效率；檢測(cè)Beclin1 沉默對(duì)TSCC1細(xì)胞的增殖凋亡的影響。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞鋪于96 孔板中，采用上述細(xì)胞處理，處理后24 h、48 h及72小時(shí)后每孔加入MTT 100 μL，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作，最后使用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度值。細(xì)胞存活率=測(cè)試組OD 平均值/對(duì)照組OD平均值×100%。

1.5 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

依據(jù)說(shuō)明書將細(xì)胞接種于6 孔板，采用上述不同分組刺激后，參照說(shuō)明書操作、加入Annexin V-FITC 5μL 和10 mg/L 碘化丙啶（PI）10 μL，最終流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率。增殖指數(shù)（PI）=（S+G2/M 細(xì)胞數(shù)）/（G0/G1+S+G2/M 細(xì)胞數(shù)）×100%；凋亡指數(shù)（AI）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。

1.6 RNA提取和qPCR

收集處理好的各組細(xì)胞、PBS 洗滌后提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。ABI PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40 次循環(huán)后，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，95 ℃再變性15 s，GAP?DH或U6作為內(nèi)參，見表1。

2 結(jié)果

2.1 miR-30d-5p在口腔鱗癌中表達(dá)模式

我們既往發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因Beclin1 與口腔鱗癌分化、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［6］，本研究采用Tarbase、miRDB、miRWalk 和TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示Beclin1 與miR-30d-5p 和miR-548b-3p 高度關(guān)聯(lián)、存在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，提示Beclin1 可能miR-30d-5p 和miR-548b-3p 下游靶基因。隨后我們?nèi)?0例患者的口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁正常組織，提取RNA、qPCR 顯示miR-30d-5p在口腔鱗癌組織中顯著高表達(dá)、Beclin1 在口腔鱗癌組織中顯著低表達(dá)，兩者呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而miR-548b-3p 在口腔鱗癌組織中表達(dá)稍高于正常組織。因此，我們選擇miR-30d-5p進(jìn)行后續(xù)研究，見圖1。

2.2 miR-30d-5p和Beclin1對(duì)TSCC1細(xì)胞增殖的影響

表1 引物序列

圖1 miR-30d-5p在口腔鱗癌中表達(dá)模式

為了檢測(cè)miR-30d-5p 質(zhì)粒的有效性，首先采用12.5、25 及50 nmol/L 濃度的質(zhì)粒（miR-30d-5p mimics 和miR-control、 miR-30d-5p inhibitors 和anti-miR-control）轉(zhuǎn)染TSCC1 細(xì)胞， qPCR 結(jié)果顯示與對(duì)照組比較miR-30d-5p mimics 和inhibitors 能夠分別顯著促進(jìn)和抑制TSCC1 細(xì)胞內(nèi)miR-30d-5p 的表達(dá)，效果呈濃度依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），隨后采用50 nmol/L 的miR-30d-5p mimics 或inhibitors 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)我們采用si-Beclin1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TSCC1 細(xì)胞，熒光顯微鏡顯示轉(zhuǎn)染效果良好，TSCC1細(xì)胞發(fā)紅色熒光（RFP）；qPCR檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染后24 h 人TSCC1 細(xì)胞Beclin1 mRNA 表達(dá)顯著下降，較對(duì)照組相比至少下降了80%以上，提示干擾效果良好，見圖2。

圖2 RT-PCR檢測(cè)miR-30d-5p和si-Beclin1轉(zhuǎn)染效果

為了驗(yàn)證對(duì)TSCC1 細(xì)胞增殖的影響，分別轉(zhuǎn)染miR-30d-5p mimics、 miR-control、 miR-30d-5p inhibi?tors、anti-miR-control 和si-Beclin1，處理0、2、3、5 和7天中斷反應(yīng)，MTT 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-30d-5p mimics 促進(jìn)TSCC1 細(xì)胞增殖，miR-30d-5p inhibitors 能夠抑制TSCC1細(xì)胞增殖；si-Beclin1 抑制Beclin1 表達(dá)后TSCC1 細(xì)胞增殖率升高，見圖3。

2.3 miR-30d-5p和Beclin1對(duì)TSCC1細(xì)胞凋亡的影響

圖3 miR-30d-5p和Beclin1對(duì)TSCC1細(xì)胞增殖的影響

為檢測(cè)miR-30d-5p 和Beclin1 對(duì)TSCC1 細(xì)胞凋亡的影響， 分 別 轉(zhuǎn) 染 miR-30d-5p mimics、 miR-control、miR-30d-5p inhibitors、anti-miR-control 和si-Beclin1，處理后24 小時(shí)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。結(jié)果顯示miR-30d-5p mimics 和si-Beclin1 能抑制TSCC1 細(xì)胞凋亡，miR-30d-5p inhibitors 能促進(jìn)TSCC1細(xì)胞凋亡，見圖4。

圖4 miR-30d-5p和Beclin1對(duì)TSCC1細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

口腔癌是指發(fā)生于口腔及其鄰近解剖結(jié)構(gòu)的惡性腫瘤，是頭頸部常見惡性腫瘤，位居全身惡性腫瘤第6位，且其發(fā)病率呈逐年遞增趨勢(shì)。90%以上口腔癌為鱗狀細(xì)胞癌（簡(jiǎn)稱鱗癌），主要發(fā)生于40～70歲的中年及老年人［10］?？谇话[狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）惡性度較高、容易早期發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并且口腔鱗癌局部復(fù)發(fā)率高、預(yù)后較差，盡管目前惡性腫瘤的治療進(jìn)展顯著，口腔鱗癌的5年生存率仍維持在41%～79.5%之間［11］。目前針對(duì)口腔鱗癌仍采取手術(shù)切除為主，放化療輔助的治療措施。多數(shù)患者即使存活下來(lái)，但手術(shù)造成的顏面部缺損會(huì)嚴(yán)重影響患者的心理和生活質(zhì)量。雖然目前研究已證實(shí)口腔鱗癌是一個(gè)多基因、多通路共同參與的疾患，但其具體調(diào)控機(jī)制尚未闡明。因此，口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制全面深入研究，對(duì)于口腔鱗癌的藥物研發(fā)和個(gè)體化治療均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

miRNA是最重要的一類非編碼RNA，廣泛分布于人體各器官和組織；大量功能各異的miRNAs 能調(diào)控人體多種基因的表達(dá)水平，參與多種細(xì)胞生物行為學(xué)活性，包括細(xì)胞分化、增殖、凋亡和代謝。在口腔鱗癌中，包括miR-655， miR-143， miR-1246， miR-221， miR-21，miR-135b，miR-29c 等多個(gè)miRNA 參與腫瘤形成、侵襲和轉(zhuǎn)移［2-5］。Zhao 等［7］發(fā)現(xiàn)miR-30d-5p 在缺氧缺血性損傷后的發(fā)育中大鼠腦中的自噬和細(xì)胞凋亡中起著重要作用，miR-30d-5p 能減少缺氧缺血性損傷后大鼠的腦梗體積、促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)恢復(fù)并改善行為學(xué)表現(xiàn)。He 等［8］發(fā)現(xiàn)miR-30d-5p 通過(guò)LDHA 調(diào)節(jié)膽囊癌的侵襲性，miR-30d-5p 在膽囊癌組織中低表達(dá)，表達(dá)低的患者預(yù)后不良。Song 等［9］發(fā)現(xiàn)miR-30d-5p 的過(guò)表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于G0/G1 期和細(xì)胞凋亡。Wu 等［10］發(fā)現(xiàn)miR-30d-5p 下調(diào)后解除對(duì)Runx2 的抑制，最終促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化。因此miR-30d-5p 的功能具有組織特異性，然而目前尚無(wú)有關(guān)miR-30d-5p 在口腔鱗癌中的作用機(jī)制研究。

我們既往研究發(fā)現(xiàn)Beclin1 在口腔鱗癌旁非腫瘤上皮組織中表達(dá)最高、癌組織中表達(dá)其次、“瘤芽”組織中表達(dá)最低；“瘤芽”中Beclin1 表達(dá)低者，患者口腔鱗癌的惡性程度更高、TNM分期更差；研究提示口腔鱗癌組織“瘤芽”中Beclin1 表達(dá)與口腔鱗癌侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［6］。本研究數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示miR-30d-5p和Beclin1呈強(qiáng)關(guān)聯(lián)，qPCR驗(yàn)證miR-30d-5p 在口腔鱗癌組織中高表達(dá)、Beclin1 在口腔鱗癌組織中低表達(dá)，兩者呈負(fù)相關(guān)）。轉(zhuǎn)染miR-30d-5p能夠促進(jìn)TSCC1 細(xì)胞增殖、抑制TSCC1 細(xì)胞凋亡；而miR-30d-5p inhibitors 抑制TSCC1 細(xì)胞增殖、促進(jìn)TSCC1細(xì)胞凋亡。采用Lenti-sh-Beclin1 的慢病毒轉(zhuǎn)染TSCC1 細(xì)胞后，TSCC1 細(xì)胞增殖下降、凋亡升高。研究提示miR-30d-5p可通過(guò)Beclin1調(diào)控TSCC1增殖和凋亡。

綜上所述，本研究通過(guò)siRNA 等試驗(yàn)手段發(fā)現(xiàn)miR-30d-5p 可通過(guò)Beclin1 調(diào)控TSCC1，促進(jìn)其增殖和抑制其凋亡，其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。