文科雄

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分析儀器研究中心，四川成都 610065）

常壓低溫等離子體作為一種新興的殺菌手段，近年來(lái)經(jīng)過(guò)不斷的研究和應(yīng)用嘗試，已被認(rèn)為是消毒殺菌發(fā)展的新方向，并受到了學(xué)者與相關(guān)人士的廣泛關(guān)注[1-2]。本研究對(duì)新型多電極刷狀等離子體裝置的放電特性進(jìn)行了診斷與分析，通過(guò)細(xì)菌滅活實(shí)驗(yàn)將放電參數(shù)對(duì)殺菌效果的影響進(jìn)行了研究，討論了等離子體滅菌的原因及規(guī)律，為新型等離子體源開(kāi)發(fā)以及殺菌技術(shù)的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 低溫等離子體發(fā)生裝置

低溫等離子體反應(yīng)裝置如圖1所示[3]。放電腔體（1 mm×15 mm）由陶瓷片粘合而成。距離兩直流電極3 mm處的腔體外（腔壁厚1 mm）設(shè)置兩塊平行的銅電極（1 mm×3 mm×28 mm），使其緊貼放電腔外壁且完全對(duì)稱。外接高壓交流電路，構(gòu)成介質(zhì)阻擋放電結(jié)構(gòu)。兩根金屬棒電極（直徑1 mm）置于腔體出口前1 mm處的狹縫兩端，貫穿兩側(cè)陶瓷片，但不深入腔體之中，并外接高壓直流電路，構(gòu)成直流輝光放電結(jié)構(gòu)。氬氣作為氣體介質(zhì)，依次通過(guò)介質(zhì)阻擋放電區(qū)、輝光放電區(qū)，最終在腔體狹縫出口處形成均勻的刷狀等離子體射流。

正常放電時(shí)，裝置頻率固定為9 kHz，交流電壓（AC）可調(diào)范圍8～20 kV；直流電壓（DC）可調(diào)范圍在1 000～2 200 V；氣體流速（GF）可調(diào)范圍5～11 L/min。

圖1 多電極低溫等離子體刷裝置結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 主要儀器和試劑

CTP-2OOO低溫等離子體電源，南京蘇曼；WWL-LDG高壓直流電源，Skekonic；HR 2000微型光譜儀，海洋光學(xué)；SR-G熒光光纖溫度傳感器，華光天銳光電科技有限公司；LS45/55熒光/磷光/發(fā)光分光光度計(jì)，成都銳教實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司；HPX-9162MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱，成都彼岸生物科技公司。標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌ATCC25923，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 等離子體射流區(qū)域的中心點(diǎn)光譜表征

為獲取等離子體射流溫度、光譜的信息，將整個(gè)等離子體射流區(qū)域抽象為（x，y）坐標(biāo)系下的平面（x∈[0,18]，y∈[0,8]），利用固定探針的方法，選取坐標(biāo)為（9，4）的等離子體中心點(diǎn)作為代表，測(cè)量了特定參數(shù)下該點(diǎn)的光譜數(shù)據(jù)以及實(shí)時(shí)溫度，測(cè)定3次并取平均值。參數(shù)設(shè)置：交流電壓10 kV、直流電壓1 600 V、氣體流速8 L/min。

1.3.2 放電參數(shù)對(duì)中心點(diǎn)溫度和活性物質(zhì)光譜強(qiáng)度的影響

為進(jìn)一步考察等離子體溫度與活性物質(zhì)O、OH、N2光譜強(qiáng)度隨參數(shù)變化的規(guī)律，同樣選取射流中心點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量，再根據(jù)多因素多變量實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，將正常放電狀態(tài)下的3種參數(shù)區(qū)間均等分為4個(gè)不同的水平，再將不同參數(shù)的每種水平進(jìn)行組合。每種參數(shù)組合測(cè)量3次，采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.3 放電參數(shù)對(duì)等離子體殺菌效果的影響

實(shí)驗(yàn)采用3因素5水平的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，共25個(gè)組合，對(duì)照組作為26號(hào)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，每種組合3次重復(fù)。滅菌則在載體表面進(jìn)行[4]：取10 μL新制的金黃色葡萄球菌菌液（107CFU/mL）滴于無(wú)菌帶凹槽的載玻片中央，在室溫下干燥形成菌斑后，將其放置于搭載了等離子體射流裝置的電動(dòng)位移臺(tái)上，且裝置距離載玻片表面固定為8 mm。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，樣品在等離子體刷狀射流的處理下，以0.3 mm/s的速度勻速移動(dòng)，時(shí)間為1 min。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行相同操作，但不啟動(dòng)等離子體裝置。處理完成后，取100 μL無(wú)菌水滴于載玻片中心，吹打數(shù)次洗脫細(xì)菌。再取其中50 μL進(jìn)行連續(xù)稀釋，取其中20 μL合適稀釋倍數(shù)的菌液均勻涂布于瓊脂培養(yǎng)皿上，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行樣并取平均值，殺菌效果（KL）由滅菌對(duì)數(shù)值來(lái)評(píng)估，計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[5]，統(tǒng)計(jì)采用方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 射流中心點(diǎn)光譜分析

等離子體中心點(diǎn)在特定參數(shù)下的光譜信號(hào)圖見(jiàn)圖2。如圖2所示，650～850 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有明顯的Ar（4p—4s）躍遷形成的發(fā)射譜線，309 nm為OH譜線，337 nm為N2第二正帶譜線，778 nm為OI譜線。此時(shí)，該點(diǎn)溫度僅36.2 ℃，證明等離子體射流離開(kāi)放電區(qū)域后，依舊保持了高度的活潑性，與空氣中O2、N2和H2O分子碰撞并發(fā)生了有效電離，形成了活性氮氧基團(tuán)，溫度方面也十分契合生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的需求。

2.2 放電參數(shù)對(duì)射流溫度與氮氧基光譜強(qiáng)度的影響

圖2 等離子體中心點(diǎn)在特定參數(shù)下的光譜信號(hào)圖

3種放電參數(shù)效應(yīng)的顯著性見(jiàn)表1。如表1所示，除了3種活性氮氧基峰強(qiáng)與交流電壓不顯著相關(guān)外，其余效應(yīng)均達(dá)到極顯著的相關(guān)性。其中，交流電壓與溫度極顯著正相關(guān)，直流電壓與所有因變量均極顯著正相關(guān)，而氣體流速則與之均極顯著負(fù)相關(guān)，且直流電壓無(wú)論對(duì)溫度還是活性物質(zhì)的光譜強(qiáng)度，影響程度（F值）都是參數(shù)中最大的。直流電壓對(duì)溫度和活性氮氧基峰強(qiáng)的影響符合一般規(guī)律[6]。但交流電壓增大，活性氮氧基峰強(qiáng)卻沒(méi)有顯著變化，證明該裝置中介質(zhì)阻擋部分對(duì)正常直流輝光放電電離程度影響較小，實(shí)際放電過(guò)程依舊是直流電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)的微觀粒子碰撞。而增加電壓所增大的電能消耗，基本轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿觿?dòng)能，并導(dǎo)致了溫度的提高。氣體流速由于熱量與產(chǎn)生的活性物質(zhì)分散程度，因此與兩者均顯著負(fù)相關(guān)。

表1 3種放電參數(shù)效應(yīng)的顯著性

2.3 放電參數(shù)對(duì)等離子體殺菌效果的影響

圖3為等離子體對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行各個(gè)參數(shù)組合下的正交處理后，方差分析的直觀統(tǒng)計(jì)結(jié)果（誤差棒代表95%置信區(qū)間）。僅有直流電壓表現(xiàn)出了明顯的極顯著正相關(guān)規(guī)律，而交流電壓與氣體流速與滅菌效果間呈現(xiàn)出整體的負(fù)相關(guān)性。結(jié)合前述表征結(jié)果可知，在沒(méi)有紫外線（200～300 nm）參與的情況下，溫度與活性氮氧基可能是產(chǎn)生滅菌效果的原因。從交流電壓對(duì)溫度顯著正相關(guān)，對(duì)滅菌效果卻負(fù)相關(guān)，可推斷引起滅菌效果改變的主要因素不是溫度。而除了氣體流速在5.0～6.5 L/min滅菌效果的顯著提升外（在較低的氣體流速下，等離子體射流長(zhǎng)度不到8 mm，大量活性基團(tuán)遷移不到樣品表面所致），放電參數(shù)對(duì)光譜強(qiáng)度的影響與對(duì)滅菌效果的影響基本相同，表明這些等離子體射流中的活性基團(tuán)由于具有極高的氧化性，會(huì)改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，甚至破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、酶和DNA等物質(zhì)也易帶來(lái)氧化損傷[7]，是滅活細(xì)菌的主要原因。

圖3 三種放電參數(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌滅菌效果的影響

3 結(jié)論

本文利用新型多電極低溫等離子體裝置，通過(guò)光譜分析與參數(shù)變化表征，對(duì)等離子體放電特性進(jìn)行了研究，并應(yīng)用載體表面滅菌法，研究三種放電參數(shù)對(duì)殺菌效果的影響。結(jié)果表明，氬等離子體溫度較低，光譜中也存在活性氮氧基團(tuán)的特征譜線，通過(guò)全面設(shè)計(jì)研究三種放電參數(shù)，發(fā)現(xiàn)交流電壓對(duì)活性氮氧基的光譜強(qiáng)度影響不顯著，證明正常放電后，交流電壓大小對(duì)輝光放電影響不大。而在滅菌實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)交流電壓同樣不顯著影響殺菌效果，且其余規(guī)律也與活性氮氧基表征結(jié)果吻合，推測(cè)滅活作用主要由活性氮氧基團(tuán)與細(xì)菌發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生。

本研究將多電極刷狀等離子體射流裝置作為一種新型滅菌手段，從理論和實(shí)踐兩方面證明了其卓越的殺菌效果以及巨大的應(yīng)用潛力，也為更好地理解等離子體的滅菌的過(guò)程與原理，從而實(shí)現(xiàn)等離子體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中實(shí)際應(yīng)用提供了基礎(chǔ)的研究數(shù)據(jù)。