柴 玲，劉布鳴**，徐遠(yuǎn)金，李青倩，韋寶偉，黃 艷

(1.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530022；2.廣西大學(xué)，廣西南寧 530004)

0 引言

蒽貝素(Embelin)又稱酸藤子酚，為苯醌類化合物2, 5-二羥基-3-十一烴-2, 5-環(huán)己二烯-1, 4二酮(2, 5-dihydroxy-3-undecyl-2, 5-cyclohexadiene-1,4-dione)[1]，是酸藤子屬植物的主要有效成分之一。從酸藤子Embelialaeta果實(shí)中分離得到蒽貝素并純化制成中藥化學(xué)對(duì)照品[1-2]，目前對(duì)蒽貝素活性研究表明其具有驅(qū)蟲(chóng)[3]、抗氧化自由基[4]、降血糖[5]、保護(hù)胰島細(xì)胞[6]、治療心臟病[7]和精神障礙[8]等作用，還能抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡[9-10]。但是蒽貝素在體內(nèi)血藥濃度及其藥動(dòng)學(xué)未見(jiàn)研究報(bào)道。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)具有靈敏度高、檢出限低、樣品用量少的優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于化學(xué)成分[11]、藥物代謝[12]、雜質(zhì)鑒定[13]等藥物分析中。本研究建立測(cè)定大鼠血漿中蒽貝素濃度的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，并研究蒽貝素血藥濃度及藥動(dòng)學(xué)規(guī)律，為其臨床藥學(xué)基礎(chǔ)研究提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國(guó)，Agilent公司)，Agilent 6460 Triple Quad質(zhì)譜檢測(cè)器(美國(guó)，Agilent公司)，Synthesis A10TM超純水系統(tǒng)(美國(guó)，Millipore公司)，ME235S電子天平(德國(guó)，Sartorius公司)，KQ2200DV型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，5810R真空濃縮儀(德國(guó)，Eppendorf公司)。

1.2 藥品與試劑

蒽貝素對(duì)照品(純度≥98%)由本課題組制備[1-2](EBS-20140728)。內(nèi)標(biāo)物大黃素(純度≥98%)購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司(wkq-00148)。色譜甲醇、乙腈購(gòu)自美國(guó)Fisher公司。分析純乙醇、氨水、乙酸乙酯購(gòu)自廣東光華科技股份有限公司。色譜純甲酸購(gòu)自美國(guó)Merck KGaA公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 動(dòng)物

Sprague-Dawley (SD)大鼠12只(隨機(jī)分組，不分雌雄)，體質(zhì)量為(280±20) g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(廣西)2009-0002。

1.4 測(cè)定條件

色譜條件：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×50 mm, 1.8 μm)；流動(dòng)相：0.1%氨水(A)-甲醇(B)；梯度洗脫：0.0—4.0 min，10%→100% B；4.0—8.0 min，100% B；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量:1 μL；柱溫25℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式檢測(cè)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。

毛細(xì)管正(ESI+)、負(fù)(ESI-)離子電壓分別為4 000 V和3 000 V。干燥氣和鞘氣均為N2，溫度分別為300℃和360℃，流速分別為10 L/min和12 L/min。霧化氣為N2，壓力為2.8×105Pa。蒽貝素和內(nèi)標(biāo)物大黃素的質(zhì)譜分析參數(shù)：蒽貝素母離子293.1，二級(jí)碎片子離子96.6，源內(nèi)碎裂電壓190 V，碰撞能量25 eV；大黃素母離子269.0，二級(jí)碎片子離子225.1，源內(nèi)碎裂電壓135 V，碰撞能量32 eV。

1.5 溶液的配制

1.5.1 蒽貝素標(biāo)準(zhǔn)溶液

精密稱取蒽貝素對(duì)照品10 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的對(duì)照品貯備液。取上述對(duì)照品貯備液適量，用甲醇進(jìn)一步稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為制備10，50，150，300，500，750，1 000，1 200 ng/mL的蒽貝素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4℃下密封保存，備用。

1.5.2 內(nèi)標(biāo)溶液

精密稱取大黃素對(duì)照品10 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液，置于4℃下保存，使用前用甲醇稀釋至所需濃度。

1.5.3 蒽貝素藥液

精密稱取羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) 0.50 g，加超純水100 mL，加熱攪拌使其溶解，超聲振蕩3 h，靜置過(guò)夜制成0.5% CMC-Na水溶液。精密稱取蒽貝素4.2 mg，加入5 mL 0.5% CMC-Na水溶液中，搖勻形成均勻懸濁液。

1.6 血漿樣品處理

取血漿樣品100 μL，加入500 μg/mL大黃素20 μL、丙酮200 μL和乙酸乙酯200 μL，將混合物渦旋混合1 min，在4℃、轉(zhuǎn)速1.2×104r/min條件下離心20 min，取上清液通過(guò)濃縮儀蒸發(fā)溶劑至干燥，殘?jiān)尤爰状?00 μL復(fù)溶，超聲振蕩10 min后再次離心20 min，取上清液用0.22 μm濾膜濾過(guò)，取濾液1 μL，進(jìn)樣分析。

1.7 方法學(xué)考察

1.7.1 專屬性

取空白血漿、加入蒽貝素和內(nèi)標(biāo)物的空白血漿及大鼠灌胃給藥蒽貝素1.5 h后的血漿，按1.6節(jié)的方法處理后，再按1.4節(jié)的色譜條件進(jìn)樣分析。

1.7.2 線性關(guān)系和檢出限

取空白血漿 200 μL，依次加入蒽貝素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備10，50，150，300，500，750，1 000，1 200 ng/mL蒽貝素血漿樣品。按1.6節(jié)的方法處理后，再按1.4節(jié)的色譜條件進(jìn)樣分析。以待測(cè)物質(zhì)量濃度(x，ng/mL)為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，使用加權(quán)因子(w=1/x2)最小二乘法計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.7.3 精密度和準(zhǔn)確度

1.7.4 回收率和基質(zhì)效應(yīng)

按1.7.2節(jié)的方法分別配制低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各6份，按1.6節(jié)的方法處理后，再按1.4節(jié)的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄蒽貝素與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(R1)；精密量取空白血漿適量，共6份，按1.6節(jié)的方法處理后，加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的蒽貝素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使最終質(zhì)量濃度與上述質(zhì)控樣品對(duì)應(yīng)，以氮?dú)饬鞔蹈桑瑲堅(jiān)眉状?00 μL復(fù)溶，渦旋1 min后，1.2×104r/min離心20 min，取上清液濾過(guò)后，進(jìn)樣分析，記錄蒽貝素與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(R2)。提取回收率=(R1/R2)×100%。

1.7.5 穩(wěn)定性

按1.7.2節(jié)的方法配制低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各6份，分別于4℃儲(chǔ)存24 h，-20℃儲(chǔ)存20 d和凍融循環(huán)3次后，按1.6節(jié)的方法處理，再按1.4節(jié)的色譜條件進(jìn)樣分析，考察上述樣品的穩(wěn)定性。

1.8 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

隨著我國(guó)油氣產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，剩余資源中“邊、低、難”資源的占比越來(lái)越大，因此油氣田開(kāi)發(fā)的難度將進(jìn)一步加大，一些深井、超深井已納入必將實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)。套管作為連接地面和油氣生產(chǎn)層的重要通道，其質(zhì)量好壞直接影響著鉆井安全和油氣井的使用壽命[1]。在超深井下套管過(guò)程中，由于套管尺寸比較大，固封段長(zhǎng)，所以井口的載荷大，給下套管作業(yè)帶來(lái)了許多難題。因此必須采取相應(yīng)的技術(shù)措施來(lái)保障下套管的順利進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

蒽貝素與內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間分別為3.6 min和2.9 min，能夠完全分離，峰形好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾蒽貝素和內(nèi)標(biāo)物的測(cè)定(圖1)。蒽貝素血藥濃度的線性范圍為10—1 200 ng/mL，定量下限為10 ng/mL(信噪比為10∶1)，以信噪比3∶1測(cè)得最低檢測(cè)限為3 ng/mL。蒽貝素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=3.5816×10-4x+0.4869(r=0.999 0)。精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1,提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2,穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

A.空白血漿; B.空白血漿+蒽貝素+大黃素; C.大鼠灌胃給藥后1.5 h 的血漿樣品；Ⅰ.蒽貝素,Ⅱ.大黃素

2.2 藥動(dòng)學(xué)研究

由圖2可知，大鼠灌胃給藥蒽貝素后的藥-時(shí)曲線符合二室模型。通過(guò)計(jì)算得到蒽貝素在大鼠體內(nèi)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，分別是分布半衰期(t1/2α)為(12.60±1.19) h、消除半衰期(t1/2β)為(15.95±0.73) h、表關(guān)分布容積(V)為(0.001±0.00) L/g、清除率(CL)為(0.001±0.00)、AUC0-∞為(3 717.48±269.82) ng·h/mL、AUC0-t為(3 596.31±271.93) ng·h/mL、藥物從中央室消除的一級(jí)速率常數(shù)(K10)為(0.05±0.00) h、藥物從中央室向周邊室運(yùn)轉(zhuǎn)的一級(jí)速率常數(shù)(K12)為(0.01±0.00) h、藥物從周邊室向中央室轉(zhuǎn)運(yùn)的一級(jí)速率常數(shù)(K21)為(0.05±0.01) h。蒽貝素灌胃給藥后在體內(nèi)吸收較快，血藥濃度在0.15 h達(dá)到最大值，蒽貝素的t1/2β值較大，說(shuō)明其在體內(nèi)消除速度緩慢。蒽貝素的藥時(shí)曲線不規(guī)則，存在3個(gè)峰，可能是肝腸吸收、胃腸吸收、雙部位吸收等原因?qū)е碌摹?/p>

表1 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

圖2 蒽貝素在大鼠體內(nèi)的平均藥-時(shí)曲線

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3 測(cè)定方法優(yōu)化

2.3.1 內(nèi)標(biāo)物的選擇

分別以大黃酸、大黃酚、大黃素和大豆苷元作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大黃素與蒽貝素結(jié)構(gòu)相似，保留時(shí)間相近，無(wú)內(nèi)源性干擾(圖3)。因此采用大黃素作為內(nèi)標(biāo)物。

圖3 血漿中不同內(nèi)標(biāo)物的提取回收率

2.3.2 色譜條件的優(yōu)化

分別以甲醇-水和乙腈-水作為流動(dòng)相進(jìn)行分離效果試驗(yàn)，結(jié)果甲醇-水體系作流動(dòng)相時(shí)蒽貝素與內(nèi)標(biāo)物的分離效果較好。為提高蒽貝素離子化強(qiáng)度，對(duì)不同體積分?jǐn)?shù)的氨水溶液0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果采用0.10%氨水-甲醇作流動(dòng)相時(shí)，蒽貝素靈敏度最高(圖4)。因此采用0.10%氨水-甲醇為流動(dòng)相。

圖4 流動(dòng)相中氨水濃度對(duì)蒽貝素峰面積的影響

2.3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.3.4 血漿樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化

分別對(duì)不同蛋白沉淀劑(乙腈、乙醇和甲醇)和液液萃取劑(氯仿、丙酮和乙酸乙酯)的提取效率進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果采用丙酮和乙酸乙酯處理樣品的提取效率較高(圖5)。對(duì)不同比例的丙酮和乙酸乙酯(1∶0，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，0∶1，V∶V)的提取效率進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果體積比為1∶1的丙酮和乙酸乙酯作萃取劑效果最好(圖6)。此外，還對(duì)不同體積的丙酮-乙酸乙酯(300，400，500，600，700，800 μL)對(duì)提取效率的影響進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，采用400 μL丙酮-乙酸乙酯對(duì)血漿進(jìn)行萃取的提取效率最高(圖7)。因此采用200 μL丙酮和200 μL乙酸乙酯作萃取劑。

圖5 不同沉淀試劑對(duì)血漿中分析物的提取回收率

圖6 不同比例丙酮-乙酸乙酯對(duì)血漿中分析物的提取回收率

圖7 不同體積丙酮-乙酸乙酯對(duì)血漿中分析物的提取回收率

3 結(jié)論

本文建立了一種以大黃素為內(nèi)標(biāo)物，測(cè)定大鼠血漿中蒽貝素的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析方法，該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、選擇性強(qiáng)。并對(duì)大鼠口服蒽貝素給藥血藥濃度和藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行試驗(yàn)。研究表明，大鼠灌胃給藥蒽貝素后的藥-時(shí)曲線符合二室模型，蒽貝素口服灌胃給藥后在體內(nèi)吸收較快，血藥濃度在0.15 h達(dá)到最大，t1/2β值較大，說(shuō)明蒽貝素在體內(nèi)消除速度緩慢。該研究結(jié)果為蒽貝素在生物體內(nèi)的有效性及安全性評(píng)價(jià)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為今后測(cè)定蒽貝素的生物功效及臨床藥學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。