仇志坤,馬建春,吳紅衛(wèi),陳永,楊澤民,陳吉生,劉志挺

(1.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床藥學(xué)科，廣東 廣州 510080; 2.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006)

創(chuàng)傷后應(yīng)激性障礙(post-traumatic stress disorder,PTSD)是一種當(dāng)個(gè)體經(jīng)歷嚴(yán)重創(chuàng)傷或者威脅情況后所產(chǎn)生的具有持續(xù)存在的精神性障礙[1-2]。隨著近年來出現(xiàn)的自然災(zāi)害爆發(fā)、戰(zhàn)爭、暴力沖突等突發(fā)事件的增多，PTSD的發(fā)病有增多的趨勢[3-4]。PTSD患者的癥狀主要有對創(chuàng)傷相關(guān)線索和事件的病理性重現(xiàn)和回避，并可能伴有選擇性的遺忘和持續(xù)性的高喚醒。該精神障礙對社會(huì)和個(gè)人均造成沉重的負(fù)擔(dān)，其具有慢性化、病程長、群體發(fā)病率高和臨床療效不足等特點(diǎn)[5-6]。因此，PTSD患者的生活質(zhì)量和防治備受關(guān)注。研究顯示神經(jīng)遞質(zhì)水平、炎癥因子調(diào)節(jié)的紊亂或神經(jīng)類固醇水平等內(nèi)分泌信號通路的紊亂可能是PTSD的發(fā)病起因[7-8]。這些生物功能的變化可能導(dǎo)致患者大腦出現(xiàn)功能的異常，比如闖入性再體現(xiàn)或過度警覺等，往往與臨床上PTSD的癥狀密切關(guān)聯(lián)。

鑒于PTSD發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性和多變性，臨床上尚缺乏其特異性藥物。部分抗精神病藥物，如抗抑郁藥中的5羥色胺再攝取抑制劑 (selective serotonin reuptake inhibitor,SSRIs) 是臨床上用于防治PTSD的常用藥物，代表藥物有帕羅西汀和舍曲林[9-10]。其作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)PTSD患者中腦區(qū)中5羥色胺水平產(chǎn)生抗PTSD的藥理效應(yīng)。然而，該類藥物的抗PTSD藥效僅屬于擴(kuò)大適應(yīng)癥治療，且臨床應(yīng)用價(jià)值尚未確切。同時(shí)，SSRIs在臨床上防治PTSD須慎重考慮，其原因是該類藥物起效慢，有效率不高，且可導(dǎo)致使用者患有自殺等毒副作用[11-12]。據(jù)此，繼續(xù)深挖PTSD的發(fā)病機(jī)制，對尋找高效和低毒的抗PTSD藥物具有研究意義。

由于臨床上應(yīng)用抗PTSD藥物所存在的不足，中藥在該防治領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越受到關(guān)注。淫羊藿 (epimedium) 又稱三枝九葉草或仙靈脾，是一種多年生草本植物。中醫(yī)記載其味甘、辛、溫、歸腎、肝經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕、強(qiáng)筋骨和補(bǔ)腎壯陽的功效[13-14]。藥理學(xué)研究顯示淫羊藿具有抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)等作用[15-16]。近年來，淫羊藿在防治神經(jīng)精神障礙中的研究備受關(guān)注。研究顯示淫羊藿具有抗抑郁、抗應(yīng)激、改善腦供血等藥理效應(yīng)[15,17-18]。然而，尚未有報(bào)道關(guān)于淫羊藿防治PTSD的作用。

PTSD與機(jī)體受到應(yīng)激后產(chǎn)生情緒變化密切相關(guān)[18]。從中醫(yī)辯證的角度進(jìn)行分析，PTSD的致病與內(nèi)因密切相關(guān)。內(nèi)因方面主要是素體稟賦不足而致臟腑功能失調(diào)，病機(jī)與腎陽不足和肝氣郁結(jié)相關(guān)。機(jī)體長期處于驚恐失調(diào)狀態(tài)，驚則氣亂、遍生諸癥；恐則氣下，腎精腎氣受損，不得主生殖發(fā)育和封藏。《神農(nóng)本草經(jīng)》提及淫羊藿具有“強(qiáng)志”的功效，可治“中年健忘，老人昏?！?。《醫(yī)學(xué)入門》則敘述淫羊藿可補(bǔ)腎虛和助陽，同時(shí)，淫羊藿的功效如同太陽，可補(bǔ)命門之火[19-21]。結(jié)合上述淫羊藿在防治神經(jīng)精神障礙中的作用，推測淫羊藿可能具有抗PTSD效應(yīng)。

目前，中藥的研究已逐步從單一成分或靶點(diǎn)的研究模式逐步轉(zhuǎn)向?yàn)槎喾N活性成分和網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)映射的研究新模式。其代表的研究方法網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為中醫(yī)藥從經(jīng)驗(yàn)醫(yī)學(xué)逐步轉(zhuǎn)變?yōu)檠C藥學(xué)或精準(zhǔn)藥學(xué)的新途徑[22-23]。本研究嘗試采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，通過藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，并結(jié)合相關(guān)靶點(diǎn)基因本體 (gene ontology,GO) 生物學(xué)分子功能分析和京都基因與基因組百科全書 (kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG) 基因作用信號通路富集分析探討淫羊藿有效成分的潛在作用靶點(diǎn)、作用信號通路及生物分子功能等信息，多角度推測其防治PTSD的機(jī)制和可行性。

1 方法

1.1 淫羊藿活性成分和作用靶點(diǎn)篩選

淫羊藿活性成分和作用靶點(diǎn)的篩選主要是通過文獻(xiàn)[24-26]和的經(jīng)典數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)收集得到。研究采用中藥數(shù)據(jù)庫為Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP,http:∥tcmspw.com/) 和A Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechanism of Traditional Chinese Medicine(BATMAN-TCM,http:∥bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)。以“淫羊藿”為搜索關(guān)鍵詞，得到淫羊藿的候選成分。進(jìn)一步以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和類藥性(drug-like,DL)為篩選參數(shù)，得到淫羊藿較高活性的成分。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，2個(gè)參數(shù)的篩選條件為：OB≥30%和DL≥0.18[27]。

篩選活性成分后，在數(shù)據(jù)庫中獲取活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，并在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProt (http:∥www.uniprot.org/uploadlists/) 標(biāo)準(zhǔn)化基因名稱。Cytoscape3.7.2構(gòu)建淫羊藿活性成分-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。在輸出結(jié)果中，以不同顏色的節(jié)點(diǎn)分別表示淫羊藿活性成分和靶點(diǎn)基因。兩者通過連線相連表示其相關(guān)性，并展開拓?fù)鋵W(xué)屬性分析。

1.2 PTSD致病相關(guān)基因信息收集

PTSD致病相關(guān)基因信息收集也是主要通過常用數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)收集。研究通過經(jīng)典數(shù)據(jù)庫為Genecards (https:∥www.genecards.org) 和 Thera-peutic Target Database (TTD,https: ∥db.Idrblab.org/ttd/) 。以"post traumatic stress disorder”或"PTSD”為搜索關(guān)鍵詞，得到PTSD發(fā)病相關(guān)蛋白信息。在數(shù)據(jù)庫中獲取對應(yīng)蛋白信息后，通過UniProt數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化基因名稱。Cytoscape3.7.2構(gòu)建PTSD-靶點(diǎn)基因的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，在輸出結(jié)果中，以不同顏色的節(jié)點(diǎn)分別表示疾病和相關(guān)基因。兩者通過連線相連表示其相關(guān)性，并進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)屬性分析。

1.3 淫羊藿活性成分作用靶點(diǎn)與PTSD致病相關(guān)基因交集分析

在完成淫羊藿活性成分作用靶點(diǎn)和PTSD致病相關(guān)基因信息收集和篩選的基礎(chǔ)上，研究嘗試把淫羊藿活性成分作用靶點(diǎn)和PTSD致病相關(guān)基因取交集，得出淫羊藿抗PTSD藥理效應(yīng)可能的作用靶點(diǎn)基因。研究采用網(wǎng)絡(luò)分析軟件Venny2.1.0 (https:∥bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/) 交集映射。通過輸入相關(guān)基因，最終得到交集映射基因和韋恩圖。

1.4 淫羊藿-活性成分-靶點(diǎn)基因-PTSD的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在完成淫羊藿活性成分作用靶點(diǎn)和PTSD致病相關(guān)基因交集映射基礎(chǔ)上，嘗試把淫羊藿-活性成分-交集靶點(diǎn)基因-PTSD等元素歸集并構(gòu)建關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，以探討淫羊藿抗PTSD的作用機(jī)制。通過交集的基因，進(jìn)一步篩選得到與PTSD致病相關(guān)的淫羊藿活性成分。繼續(xù)采用Cytoscape3.7.2中繪制淫羊藿-活性成分-靶點(diǎn)基因-PTSD關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。在完成可視化關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建后，繼續(xù)采用軟件中“Network Analyzer”功能分析關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋵W(xué)屬性。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在構(gòu)建淫羊藿-活性成分-靶點(diǎn)基因-PTSD的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，研究進(jìn)一步探討這些靶點(diǎn)之間的相互作用和關(guān)系。實(shí)驗(yàn)將篩選的靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING網(wǎng)絡(luò)平臺 (https:∥string-db.org/) 中構(gòu)建靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖 (protein-protein interaction,PPI)。把蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”(即分析物種為人類)，根據(jù)STRING網(wǎng)絡(luò)平臺設(shè)定的參數(shù)，將評分條件 (置信度) 設(shè)定>0.4，采用R3.6.3軟件和Cytoscape3.7.2對蛋白的自由度進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)，探討淫羊藿防治PTSD的核心靶點(diǎn)的相互關(guān)系。

1.6 GO生物學(xué)分子功能富集分析

研究嘗試探討核心靶點(diǎn)基因富集的生物學(xué)分析功能，采用R語言3.6.3軟件中的“clusterProfiler”、“DOSE”、“org.Hs.eg.db”、“stringi”等數(shù)據(jù)包在GO生物學(xué)分子功能方面進(jìn)行富集分析和可視化處理，以P<0.05進(jìn)行人類生物分子功能富集分析，并統(tǒng)計(jì)富集的結(jié)果。

1.7 KEGG基因作用信號通路富集分析

研究嘗試通過KEGG分析探討核心靶點(diǎn)基因富集的作用信號通路。根據(jù)文獻(xiàn)的方法學(xué)提示，本研究采用R語言3.6.3軟件中的“clusterProfiler”、“org.Hs.eg.db”、“DOSE”、“stringi”等數(shù)據(jù)包在KEGG作用信號通路富集分析和可視化處理，以P<0.05進(jìn)行人類作用信號通路富集分析，并統(tǒng)計(jì)富集的結(jié)果。

1.8 作用靶點(diǎn)富集信號通路圖分析

選取KEGG分析中核心的富集信號通路進(jìn)行分析，以探討淫羊藿抗PTSD潛在的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)采用R語言3.6.3軟件中的“org.Hs.eg.db”、“pathview”、 “stringi”等數(shù)據(jù)包檢索靶點(diǎn)基因作用在KEGG富集信號通路上的通路圖，并將主要靶點(diǎn)基因在主要富集信號通路上標(biāo)記，以圖視化淫羊藿的藥理效應(yīng)是通過多靶點(diǎn)、多途徑產(chǎn)生的。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿活性成分和作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果

根據(jù)文獻(xiàn)的檢索，并結(jié)合TCMSP和BATMAN-TCM兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)共收集到淫羊藿的成分144個(gè)。根據(jù)OB (≥30%) 和DL (≥0.18) 2個(gè)參數(shù)篩選，得到淫羊藿活性成分24個(gè)，結(jié)果如表1所示。這些活性成分中，主要有甾體類、苷類、黃酮醇類、黃酮類等化合物。在以上24個(gè)活性成分中，作用人類靶點(diǎn)蛋白的活性成分共21個(gè)，對應(yīng)靶點(diǎn)基因188個(gè)，結(jié)果如圖1所示。

表1 淫羊藿活性成分基本信息

Cytoscape3.7.2拓?fù)浞治鼍W(wǎng)絡(luò)關(guān)系相關(guān)指標(biāo)如下：節(jié)點(diǎn)209個(gè)，其中活性成分節(jié)點(diǎn)21個(gè)，相關(guān)靶點(diǎn)基因節(jié)點(diǎn)188個(gè)。網(wǎng)絡(luò)密度0.018，網(wǎng)絡(luò)集中度0.637，網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為2.925，最短路徑為43 472。最大自由度和介數(shù)中心度存在于活性成分quercetin，分別為136和0.709 107 06。

紅色長方形：淫羊藿活性成分； 綠色八邊形：靶點(diǎn)基因。

2.2 PTSD致病相關(guān)基因收集結(jié)果

根據(jù)數(shù)據(jù)庫的檢索，結(jié)合Genecards和TTD兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)共收集人類PTSD致病相關(guān)基因210個(gè)，結(jié)果如圖2所示。Cytoscape3.7.2拓?fù)浞治鲲@示網(wǎng)絡(luò)相關(guān)指標(biāo)如下：節(jié)點(diǎn)有211個(gè)，其中疾病節(jié)點(diǎn)1個(gè)，致病相關(guān)基因節(jié)點(diǎn)210個(gè)。網(wǎng)絡(luò)集中度為1，網(wǎng)絡(luò)密度為0.009，網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為7.211，最短路徑為44 310。最大自由度和介數(shù)中心度存在于疾病PTSD，分別為210和1。

2.3 淫羊藿活性成分作用靶點(diǎn)與PTSD致病相關(guān)基因交集結(jié)果

如圖3顯示，根據(jù)Venny2.1分析和統(tǒng)計(jì)結(jié)果，在淫羊藿活性成分作用靶點(diǎn)(188個(gè))和PTSD致病相關(guān)基因(210)個(gè)中，交集映射的基因有30個(gè)。這些基因分別為：NOS2、ESR1、NR3C2、ACHE、SLC6A2、HMOX1、ADRB2、HTR3A、ADRA2B、SLC6A3、SLC6A4、DRD2、OPRM1、IL10、IL6、APP、IL2、IFNG、IL4、MAOB、FOS、SOD1、PRKCA、IL1B、CCL2、CXCL8、SERPINE1、IL1A、CRP、CXCL10。交集基因數(shù)目占總基因數(shù)目的8.2%。

綠色橢圓形： PTSD；藍(lán)色六邊形：致病相關(guān)基因。

圖3 淫羊藿活性成分作用靶點(diǎn)與PTSD致病相關(guān)基因交集映射

2.4 淫羊藿-活性成分-靶點(diǎn)基因-PTSD的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系構(gòu)建結(jié)果

淫羊藿-活性成分-靶點(diǎn)基因-PTSD的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系構(gòu)建結(jié)果如圖4所示。Cytoscape3.7.2拓?fù)浞治鼍W(wǎng)絡(luò)中共有46個(gè)節(jié)點(diǎn)。其中藥物節(jié)點(diǎn)1個(gè)，活性成分節(jié)點(diǎn)14個(gè)，靶點(diǎn)基因節(jié)點(diǎn)30個(gè)，疾病節(jié)點(diǎn)1個(gè)。其中關(guān)聯(lián)邊103條，節(jié)點(diǎn)平均自由度為4.478。網(wǎng)絡(luò)集中度為0.593，網(wǎng)絡(luò)密度為0.1，網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為1.126，最短路徑為2 070。關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的度值和介值中心度是體現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)重要性的指標(biāo)。圖4顯示節(jié)點(diǎn)的平均度值為4.478，大于該平均度值的節(jié)點(diǎn)有12個(gè)；節(jié)點(diǎn)平均介值中心度為0.028，大于該平均介值中心度的節(jié)點(diǎn)有12個(gè)。共有12個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值和介值中心度均高于均值(見表2)，其中包括藥物1個(gè)，疾病1個(gè)，活性成分6個(gè)，相關(guān)靶點(diǎn)基因11個(gè)。化合物分別為quercetin、C-Homoerythrinan,1,6-didehydro-3,15,16-trimethoxy-,(3.beta.)-、luteolin、8-(3-methylbut-2-enyl)-2-phenyl-chromone、kaempferol、Anhydroicaritin。在這些化合物中，主要分類為黃酮類和苷類。靶點(diǎn)基因分別是ESR1、ACHE、NOS2、ADRB2。

綠色八邊形：淫羊藿；藍(lán)色六邊形：活性成分；紅色四邊形：PTSD；黃色橢圓形：作用靶點(diǎn)。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果

為探討淫羊藿抗PTSD的潛在作用機(jī)制，研究將淫羊藿活性成分作用靶點(diǎn)基因和PTSD致病相關(guān)基因交集映射的30個(gè)靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。如圖5A所示，該網(wǎng)絡(luò)共有30個(gè)節(jié)點(diǎn)，相互作用關(guān)系194條，平均度值為12.9。將PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入R語言3.6.3軟件中，蛋白的度數(shù)由高到低排序。篩選出大于平均度值的核心靶點(diǎn)蛋白18個(gè)，分別是IL-6、FOS、IL-1B、CXCL8、IL-10、CXCL10、CCL2、APP、SERPINE1、OPRM1、IL-4、HMOX1、IFNG、CRP、NOS2、IL-2、IL-1A、ACHE (圖5B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示這18個(gè)靶點(diǎn)蛋白是PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，淫羊藿抗PTSD的潛在藥理作用可能是通過作用于這些靶點(diǎn)得以發(fā)揮。

表2 淫羊藿-活性成分-作用靶點(diǎn)-PTSD網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及拓?fù)鋵W(xué)特征

2.6 相關(guān)靶點(diǎn)基因GO生物學(xué)分子功能分析

根據(jù)前期分析，將淫羊藿活性成分靶點(diǎn)基因和PTSD致病相關(guān)基因中30個(gè)交集映射基因進(jìn)行GO生物學(xué)分子功能分析。圖6和圖7顯示篩選得與交集映射基因顯著相關(guān)的生物學(xué)分子功能共42種(P<0.05)。其中，受到細(xì)胞因子的活性和受體的結(jié)合程度分子功能影響的基因數(shù)目各為33.33%。其次，生長因子受體的結(jié)合和銨離子的結(jié)合也是影響基因分子功能的重要因素，參與以上2種分子功能的基因數(shù)目分別為20%和16.67%。此外，也有部分基因參與到兒茶酚胺 (13.33%)、神經(jīng)遞質(zhì)(13.33%)、生長因素 (13.33%) 的活性等生物分子功能的調(diào)節(jié)中。結(jié)果提示淫羊藿抗PTSD的潛在作用機(jī)制與多種生物分子功能有關(guān)，其中主要影響因素有細(xì)胞因子、受體結(jié)合活性、銨離子的結(jié)合，兒茶酚胺、神經(jīng)遞質(zhì)、生長因素等。

2.7 KEGG作用信號通路富集分析結(jié)果

根據(jù)前期分析，將淫羊藿活性成分靶點(diǎn)基因和PTSD致病相關(guān)基因中30個(gè)交集映射基因進(jìn)行KEGG作用信號通路富集分析。圖8和圖9顯示篩選得與交集映射基因顯著相關(guān)的作用信號通路共57條 (P<0.05)。從作用信號通路富集上分析主要與細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用的信號通路 (34.48%) 和美國錐蟲病相關(guān)信號通路 (34.48%) 相關(guān)。其次，白介素17和A型流感疾病相關(guān)信號通路也是重要的影響因素，在以上2種作用信號通路的相關(guān)基因的均為27.59%。此外，也有部分基因富集在炎癥性腸病相關(guān)信號通路、百日咳相關(guān)信號通路、黑熱病相關(guān)信號通路、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)信號通路、阿米巴病相關(guān)信號通路、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路。富集在以上6種作用信號通路的相關(guān)基因的均為24.14%。結(jié)果提示相關(guān)基因共同參與調(diào)節(jié)信號通路較多，發(fā)揮抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用，可能是淫羊藿抗PTSD的潛在機(jī)制。

A. PPI網(wǎng)絡(luò)圖； B.度數(shù)排序。

圖5淫羊藿抗PTSD發(fā)病相關(guān)靶點(diǎn)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖和度數(shù)排序
Figure5PPI network diagram and degree ordering of target proteins of epimedium against PTSD

圖6 GO生物分子功能分析Figure 6 GO analysis of biomolecular function

圖7 GO生物分子功能分析 (基因比例)Figure 7 GO analysis of biomolecular function (gene ratio)

2.8 淫羊藿抗PTSD的作用信號通路圖結(jié)果

結(jié)合圖9和圖10的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究選取相關(guān)核心靶點(diǎn)基因主要富集的作用信號通路，如細(xì)胞因子受體的相互作用的富集信號通路 (圖10)，美國錐蟲病的富集信號通路 (圖11) 和白介素17富集信號通路 (圖12)。圖中相關(guān)靶點(diǎn)基因已用紅色所以標(biāo)記。結(jié)果顯示IL-2、IL-8、CXCL2、CXCL10等基因與細(xì)胞免疫和炎癥調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)。信號通路圖結(jié)果提示淫羊藿抗PTSD的作用靶點(diǎn)可能是通過細(xì)胞免疫和炎癥調(diào)節(jié)過程產(chǎn)生藥效。

3 討論

本研究主要探討和推測淫羊藿抗PTSD的可行性和潛在的作用機(jī)制。文獻(xiàn)檢索和TCMSP和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫搜索和篩選得淫羊藿活性成分21個(gè)。目前，部分研究關(guān)于PTSD的致病與免疫系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)[28-29]。PTSD的發(fā)病可引起機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)的異常，但具體機(jī)制尚未完全清楚。近年研究表明，促炎性細(xì)胞因子水平的變化可能是PTSD潛在的發(fā)病機(jī)制之一[30-31]。PTSD患者免疫系統(tǒng)功能可產(chǎn)生異常，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，如患者血清中IL-6、IL-10和IL-1B等免疫因子的水平顯著性提高[32-33]，提示PTSD患者可能存在免疫系統(tǒng)的激活，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥的產(chǎn)生[30-33]。在恐懼記憶恢復(fù)后IL-6的釋放可維持恐懼記憶。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步加深對炎癥因子在PTSD發(fā)病中作用，并提示IL-6和其他促炎細(xì)胞因子可能維持PTSD患者恐懼記憶，這并不能使恐懼記憶消失[34]。

圖8 KEGG作用信號通路富集分析

圖9 KEGG作用信號通路富集分析 (基因比例)Figure 9 KEGG analysis of action signal pathway concentration (gene ratio)

圖10 淫羊藿活性成分在細(xì)胞因子受體的相互作用的富集信號通路中標(biāo)注圖Figure 10 Enrichment of the active components of epimedium on the interaction of cytokine receptor signaling pathways

圖11 淫羊藿活性成分在美國錐蟲病的富集信號通路中標(biāo)注圖Figure 11 Enrichment of the active components of epimedium in the American Chagas disease

圖12 淫羊藿活性成分在白介素17的富集信號通路中標(biāo)注圖Figure 12 Enrichment of the active components of epimedium in the signaling pathway of interleukin 17

此外，文獻(xiàn)也報(bào)道PTSD的致病與IL-1B的調(diào)節(jié)密切關(guān)聯(lián)。如IL-1B中rs16944和rs1143633單核苷酸與PTSD的發(fā)病呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果顯示與對照組相比，PTSD患者的IL-1B中rs1143633*C和rs16944*A等位基因頻率和攜帶率顯著下降[35]。再者，細(xì)胞凋亡也參與PTSD的致病機(jī)理[36]。FOS蛋白被認(rèn)為具有細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)作用[37]。FOS基因家族由以下蛋白組成，分別是FOS、FOSB、FOSL1和FOSL2[38-39]。其相關(guān)的基因編碼亮氨酸拉鏈蛋白，與Jun家族蛋白質(zhì)構(gòu)建二聚體，形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1[39]。因此，F(xiàn)OS基因/蛋白的表達(dá)與凋亡細(xì)胞死亡有關(guān)，已有報(bào)道FOS基因/蛋白的表達(dá)與PTSD的致病相關(guān)，與本研究中FOS蛋白作為PTSD發(fā)病的核心靶點(diǎn)蛋白一致。

進(jìn)一步探索以上的靶點(diǎn)基因所富集的分子生物學(xué)功能和所在的富集信號通路，研究采用GO富集分析 和KEGG富集分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示細(xì)胞因子的活性和受體的結(jié)合程度的富集是核心靶點(diǎn)基因分子功能的主要影響因素。結(jié)合上述炎癥因子在PTSD發(fā)病中的重要性，推測細(xì)胞因子中炎癥因子及其與受體的結(jié)合程度是影響PTSD發(fā)病的關(guān)鍵，神經(jīng)遞質(zhì)、生長因素、兒茶酚胺等生物因素也參與到PTSD的發(fā)病機(jī)制中。以上因素已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道可從不同方面影響PTSD的病程進(jìn)展，如神經(jīng)遞質(zhì)中5羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺等水平的紊亂均是PTSD發(fā)病的重要影響因素[40-41]。在KEGG富集研究中，細(xì)胞因子之間受體的相互作用和白介素17通路是相關(guān)核心作用靶點(diǎn)主要富集的信號通路。這些信號通路富集多種炎癥因子和趨化因子，并與其調(diào)控密切相關(guān)。其中在白介素17信號通路上富集的相關(guān)基因如AP-1、IL-4、IL-6、CXCL13等免疫相關(guān)的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子成為影響白介素17信號通路上的重要因素，并影響PTSD的發(fā)病。本研究還發(fā)現(xiàn)在美國錐蟲病的信號通路中多個(gè)相關(guān)基因與本研究中核心靶點(diǎn)相關(guān)，其中包括IL-10、IL-6等。這些基因均涉及免疫機(jī)體功能的調(diào)節(jié)。從GO富集分析和KEGG富集分析等研究的結(jié)果提示，淫羊藿抗PTSD的潛在藥理效應(yīng)與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中炎癥因子的水平和表達(dá)關(guān)系密切。

本研究僅對網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)挖掘的資料進(jìn)行分析后推測淫羊藿抗PTSD的潛在作用機(jī)制，其意義在于給實(shí)驗(yàn)研究方向性。研究分析得涉及多種分子功能和多條作用通路。然而，以上結(jié)果尚需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，如動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等。在研究淫羊藿抗PTSD效應(yīng)中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可添加以上推測基因/蛋白的相關(guān)拮抗劑以驗(yàn)證該藥理效應(yīng)是否與所拮抗的基因/蛋白相關(guān)；在細(xì)胞水平探討中，可上(下)調(diào)推測基因/蛋白以評價(jià)該藥理效應(yīng)是否與相應(yīng)的基因/蛋白相關(guān)。據(jù)此，仍需通過相關(guān)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以上的推測。

綜上，研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)淫羊藿中多個(gè)活性成分可作用于同一靶點(diǎn)，單個(gè)活性成分也可以作用于多個(gè)靶點(diǎn)，并通過多條信號通路共同發(fā)揮藥理效應(yīng)。這體現(xiàn)出中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路的整體調(diào)節(jié)作用特點(diǎn)。其活性成分能通過信號傳導(dǎo)通路而起到抗PTSD的作用，對淫羊藿從基因蛋白層面推測其防治PTSD機(jī)制和可行性具有重要意義。