江福能，朱瑩瑩，張玉婷，楊盛幫，吳永定，譚惠靜，鐘惟德

(1.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院(廣州市第一人民醫(yī)院)中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510180； 2.廣州醫(yī)科大學(xué)南山學(xué)院南山班， 廣東 廣州 511436)

3-磷酸甘油脫氫酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1)是甘油代謝途徑中的關(guān)鍵限速酶[1]，可與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)一同參與代謝反應(yīng)，將糖酵解的中間產(chǎn)物磷酸二羥丙酮和NADH催化反應(yīng)生成3-磷酸甘油和NAD+，以作為三酸甘油酯合成的G-3-P骨架[2-3]，直接決定了葡萄糖分解代謝中甘油合成方向的物質(zhì)流分配量和甘油合成水平[4]。GPD1廣泛分布于組織中，包括大腦的各個(gè)區(qū)域和內(nèi)部組織，其中腸系膜脂肪、皮下脂肪和十二指腸脂肪含量最高[5]。

在近期的研究中驗(yàn)證了GPD1在人乳腺癌部分亞型中的表達(dá)顯著下降， GPD1是一種優(yōu)秀的人類乳腺癌標(biāo)志物，且GPD1的表達(dá)與乳腺癌的預(yù)后有明顯的相關(guān)性，將GPD1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入乳腺癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)其增殖、遷移和侵襲能力明顯下降；實(shí)驗(yàn)選擇了21種類型的人類癌癥，其中7種癌癥也表現(xiàn)出了與GPD1表達(dá)水平一定的相關(guān)性；且實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡述了GPD1可能是miR-370的直接靶點(diǎn)[6]，miR-370的調(diào)控已在各種癌癥中被報(bào)道[7-9]。

大量表達(dá)純化GPD1酶，可為進(jìn)一步的機(jī)制研究和未來(lái)可能的腫瘤治療方向的研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究提取人細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用特異引物通過(guò)PCR擴(kuò)增GPD1基因，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pPICZα-C-gpd1，將其電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33中，并通過(guò)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)、鎳柱分離純化，建立了GPD1酶的基因工程制備方法。

1 材料和儀器

1.1 材料

菌株和質(zhì)粒載體：畢赤酵母X33和表達(dá)載體pPICZα-C(由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院王曉虎副研究員饋贈(zèng))，大腸桿菌DH5α(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)。PCR相關(guān)試劑(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XbaⅠ、NheⅠ和SalⅠ(購(gòu)自NEB(北京)有限公司)；質(zhì)粒小量提取試劑盒(購(gòu)自廣州欣研生物科技有限公司)；酵母基因組提取試劑盒(購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司)；DNA分子量marker(購(gòu)自Takara公司)；ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit(購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司)；酵母粉、胰蛋白胨(購(gòu)自O(shè)XOID公司)，Zeocin、His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖純化樹(shù)脂(購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司)；蛋白質(zhì)分子量marker[購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；酵母蛋白提取試劑盒[購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司]；考馬斯亮藍(lán)快速染色液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

PCR儀(購(gòu)自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)、電泳儀(購(gòu)自上海天能科技有限公司)，微量分光光度計(jì)(購(gòu)自杭州奧盛儀器有限公司)，點(diǎn)轉(zhuǎn)儀(購(gòu)自Eppendorf公司)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(購(gòu)自長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 GPD1基因的PCR擴(kuò)增

提取人細(xì)胞的總RNA并且逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA，以此為模板，采用一對(duì)GPD1基因的特異引物：GPD1-F(5′-GGCTGAAGCATCGATGAATTCTGCTAGC AAGAAAGTCTGCATTG-3′)和GPD1-R(5′-GAG ATGAGTTTTTGTTCTAGCATATGTTCTGGATGATTC TGCAGG-3′)，對(duì)GPD1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收純化PCR產(chǎn)物中的目的條帶。

2.2 表達(dá)質(zhì)粒pPICZα-C-gpd1的構(gòu)建

將pPICZαC載體用EcoRⅠ 和XbaⅠ雙酶切，經(jīng)切膠回收，利用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit將回收純化的PCR產(chǎn)物連接到pPICZαC載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α 中，用含25 μg/mL Zeocin的LB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)約16 h，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，用質(zhì)粒小提試劑盒提取pPICZα-C-gpd1質(zhì)粒，用NheⅠ和SalⅠ雙酶切驗(yàn)證，并且進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。

2.3 電擊轉(zhuǎn)化pPICZα-C-gpd1及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定

pPICZα-C-gpd1質(zhì)粒用Sac I線性化處理，使用電轉(zhuǎn)儀將線性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)參數(shù)為電壓1 200 V，時(shí)間5 ms。加入600 μL預(yù)冷的1 mol/L的山梨醇，30 ℃靜置1～2 h后，涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPDS培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d。

選取長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落，提取其基因組DNA作為模板，用α-factor-SF：5′-GCATCCTCCGCATTAGCTG-3′和GPD1-SR：5′-GTTCCCGGAGCCTACAATG-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

2.4 甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)GPD1

選取陽(yáng)性畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，接種到5 mL YPD培養(yǎng)基中，28～30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，全部轉(zhuǎn)入100 mL BMGY培養(yǎng)基中，加入抗生素Zeocin至濃度為2 μL/mL，250 r/min，30 ℃振蕩培養(yǎng)16～18 h至A600nm=2.0～6.0。將培養(yǎng)液分裝至50 mL離心管中，4 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清，收集菌體，用滅菌水清洗2次，BMMY培養(yǎng)液清洗1次，加入20～30 mL的BMMY培養(yǎng)液重懸菌體沉淀，將菌液倒入具有400 mL培養(yǎng)基的2 L錐形瓶中，每瓶加入2 mL甲醇，于30 ℃，250 r/min培養(yǎng)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，每24 h向瓶中加入4 mL甲醇，誘導(dǎo)96 h；培養(yǎng)液經(jīng)8 000 r/min離心10 min，用酵母蛋白提取試劑盒提取菌體中的總蛋白，上清液和菌體總蛋白用15%的SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，檢測(cè)GPD1酶的表達(dá)情況。

2.5 重組GPD1酶的純化

上清液用透析法將溶液換為PBS (pH7.4)。用0.22 μm濾膜過(guò)濾后，利用Profinia蛋白純化系統(tǒng)上樣于His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖純化樹(shù)脂，PBS洗滌去除雜蛋白，梯度咪唑洗脫目的蛋白，獲得純化的GPD1酶，用考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)純化結(jié)果。

2.6 檢測(cè)純化蛋白的濃度

將BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)中的A液和B液按50∶1的體積比加到離心管中，混勻，得到工作液。把195 μL工作液加至96孔板中，每孔加入5 μL標(biāo)準(zhǔn)蛋白或者純化蛋白，混勻，37 ℃溫浴30 min。然后用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(波長(zhǎng)選擇562 nm)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的蛋白濃度。

3 結(jié)果

3.1 GPD1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到GPD1基因，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，最亮的條帶略大于1 000 bp，與理論大小(1 086 bp)相符(圖1)。

M. Marker； 1. PCR產(chǎn)物1； 2. PCR產(chǎn)物2； 3. PCR產(chǎn)物3。

3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZα-C-gpd1的構(gòu)建及鑒定結(jié)果

將切膠回收純化的PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pPICZα-C用EcoRⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切后用T4 DNA連接酶連接，得到重組表達(dá)載體pPICZα-C-gpd1(圖2)。為了確定重組載體是否構(gòu)建成功，使用NheⅠ和SalⅠ對(duì)重組載體進(jìn)行雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，酶切產(chǎn)物大小與理論大小(1 086 bp和3 499 bp)相符(圖3)。DNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證明重組載體pPICZα-C-gpd1構(gòu)建成功，且未發(fā)生堿基突變。

(a) (b)

bpM1275050050003000200015001000250100

3.3 酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定結(jié)果

用電擊轉(zhuǎn)化法，把經(jīng)SacI線性化的pPICZα-C-gpd1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞中，在含有Zeocin的YPDS培養(yǎng)基上培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落；分別提取長(zhǎng)勢(shì)好的酵母轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，并以此為模板，用引物α-factor-SF和GPD1-SR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條比250 bp略大的特異性條帶(圖4)。結(jié)果符合理論值(276 bp)，證實(shí)pPICZα-C-gpd1已成功整合入酵母基因組中。

bpM12345678920001000750500250100

3.4 GPD1的表達(dá)和純化

誘導(dǎo)后的上清液、誘導(dǎo)后的酵母總蛋白和純化后的重組GPD1酶分別經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，用考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)，由檢測(cè)結(jié)果(圖5)可見(jiàn)上清液中的重組GPD1酶(37 500)比菌體中的多，表明重組GPD1酶主要被分泌到菌體外。使用Image-Pro Plus軟件分析圖5中條帶的灰度值，純化后的重組GPD1酶的純度為90.83%。

M. Marker； 1.未純化的培養(yǎng)液上清； 2.酵母總蛋白； 3.純化后的培養(yǎng)液上清。

3.5 GPD1重組酶的產(chǎn)量

利用BCA法測(cè)得純化蛋白的濃度為166.18 μg/mL，則純化后的重組GPD1酶的濃度為150.94 μg/mL，總共純化得到1.51 mg重組GPD1酶,重組GPD1酶的收率為3.55 mg/L。

4 討論

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種高效表達(dá)異源蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)，具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如：操作簡(jiǎn)易、易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度快、表達(dá)量高、不易形成包涵體、酵母表達(dá)載體含分泌型信號(hào)肽利于胞外表達(dá)、高密度發(fā)酵生產(chǎn)成本低,并且與大腸桿菌相比，不會(huì)引入內(nèi)毒素，該系統(tǒng)的安全性已得到美國(guó) FDA 認(rèn)可[10-12]。

pPICZα-C是一種常用的畢赤酵母蛋白表達(dá)載體，其含有Zeocin抗性基因，可以篩選獲得拷貝數(shù)高的轉(zhuǎn)化子，具有AOX1啟動(dòng)子，能夠利用甲醇誘導(dǎo)高水平表達(dá)目的蛋白，該載體本身含有α-因子分泌信號(hào)肽，可以將目的蛋白分泌到胞外， 方便了后續(xù)的分離純化[13]。通過(guò)載體上的3個(gè)信號(hào)切除位點(diǎn)，該信號(hào)肽被自動(dòng)切除。載體自身帶有 C-Myc和C-His 標(biāo)簽，便于目的蛋白的檢測(cè)和純化。

本研究構(gòu)建了畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZα-C-gpd1，成功篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，利用甲醇誘導(dǎo)和鎳柱純化獲得了分泌表達(dá)的GPD1酶，純度為 90% 以上，建立了畢赤酵母分泌表達(dá)GPD1酶的方法，為后續(xù)的GPD1腫瘤機(jī)制研究和靶向GPD1的抗腫瘤應(yīng)用治療奠定了基礎(chǔ)。