蘇澤瑩,管柳柳,陳斯?jié)桑?

(1.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科； 2.廣東省食管癌精準(zhǔn)治療工程技術(shù)研究中心； 3.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院科學(xué)研究中心，廣東 廣州 510080)

類器官是由多系細胞組成的體外三維培養(yǎng)物，是由干細胞驅(qū)動而以自組織的方式而構(gòu)建形成，能夠模擬天然器官結(jié)構(gòu)和功能[1]。與傳統(tǒng)二維培養(yǎng)物相比，類器官更能模擬體內(nèi)細胞運動及多細胞間信號交流，且能在擴增中維持基因穩(wěn)定性。與動物實驗相比，類器官能模擬動物實驗不易或不能準(zhǔn)確代表的人體發(fā)育和疾病的發(fā)生發(fā)展過程，并可實現(xiàn)實時成像和更為符合實驗倫理要求[2](表1)。

類器官的提出起源于Clever(2009)等[3]對小腸干細胞分離培養(yǎng)，且實驗表明單個干細胞可以以自組織形式構(gòu)建成腸道的隱窩絨毛結(jié)構(gòu)。其培養(yǎng)原理主要來自對干細胞巢的理解。干細胞周圍的細胞可構(gòu)成微環(huán)境，即干細胞巢。在正常腸上皮，巢因子分布于干細胞周圍，并形成濃度梯度，離干細胞巢距離越遠則巢因子濃度越低，而促進分化因子濃度越高。體外構(gòu)建類器官即是對干細胞巢的構(gòu)建，并且其中添加的巢因子缺一不可。體外培養(yǎng)時提供因子重建干細胞巢，從而形成類器官。此后，類器官技術(shù)引起科學(xué)家的重視。近10年來，先后有不同研究相繼建立不同的類器官，使類器官技術(shù)得到發(fā)展，并在逐步研究中探討和解決類器官中的相關(guān)難題。

表1 3種疾病模型優(yōu)缺點比較

1 類器官的培養(yǎng)來源

類器官的建立可來源于多能干細胞、胚胎干細胞和成體干細胞。目前，由多能干細胞和胚胎干細胞得到的類器官主要有：視杯[4]、腦[5]、視網(wǎng)膜[6]、肺[7]、肝臟[8]和腎臟[9]。理論上，多能干細胞和胚胎干細胞可形成所有類器官。而目前研究重點在于如何使其按照類似胚胎發(fā)生的方向形成類器官，其主要應(yīng)用于研究相關(guān)器官的發(fā)生和發(fā)育問題。由成體干細胞培養(yǎng)成功的類器官主要有：腸道[3]、胃[10]、肝臟[11]、胰腺[12]和前列腺[13]、膀胱[14]、輸卵管[15]、卵巢[16]、食管[17]。成體干細胞來源的類器官研究重點在于鑒定、分離，以及通過對生態(tài)位的控制使其沿特定方向分化，其主要用于研究相關(guān)的組織生物學(xué)問題。

另外，近年來，腫瘤干細胞假說也得到認可及證實[18]。腫瘤干細胞，可類似地將其視為具有組織特異性的成體干細胞。研究者按照與正常類器官相似的培養(yǎng)方法也構(gòu)建了結(jié)腸癌[19]、前列腺癌[20]、胰腺癌[21]、食管癌[22]等類器官。由于腫瘤干細胞被認為是腫瘤整個微環(huán)境的構(gòu)建者，由此提出：類器官不僅僅單純模擬天然器官，在針對疾病模擬方面，更是疾病的濃縮與概括。

如上所述，對于研究所需的類器官，理論上可由多種起源細胞培養(yǎng)而成。然而，在實際的實驗研究中，卻需要對起源細胞進行選擇(表2)。對于不同研究目的，研究者也會選擇特定階段的起源細胞，從而更好地達到研究目的。至今，一些類型的類器官僅來源于多能干細胞，包括神經(jīng)外胚層類器官，如視杯和大腦，以及中胚層腎臟器官。表面外胚層譜系(特別是腺體組織)的類器官主要來源于成體干細胞。內(nèi)胚層譜系的大多類器官都來源于多能干細胞和成體干細胞。而腫瘤類器官，可由腫瘤干細胞而來，也可由成體干細胞經(jīng)基因編輯而來[23]。

由于類器官現(xiàn)存的長期培養(yǎng)的局限性及細胞本身的因素，導(dǎo)致不同起源細胞的選擇將決定不同的細胞成熟度及細胞命運。例如，研究表明[24],多能干細胞來源的胃和肺器官的轉(zhuǎn)錄組與胎兒的轉(zhuǎn)錄組更接近。此外，基于RNA序列的轉(zhuǎn)錄圖譜證實，人多能干細胞來源的小腸器官與胎兒組織最相似[25]。同樣，從肝發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子的表達來看，多能干細胞產(chǎn)生的肝細胞或肝類器官與早期胎兒肝臟的關(guān)系比成人肝臟更為密切[8,26]。由于與胎兒相似，來源于人多能干細胞的組織可能更適合于發(fā)育研究而不是成人過程的研究。因此，在設(shè)計實驗和實施這樣的系統(tǒng)時，要考慮每個系統(tǒng)的實驗優(yōu)勢和局限性，從而選擇合適的起源細胞以培養(yǎng)實驗相關(guān)的類器官。同時，針對長期培養(yǎng)的局限，也有研究取得進展，相關(guān)研究報道已成功構(gòu)建可維持至少半年的成年小鼠皮膚類器官[27]。

2 類器官的培養(yǎng)環(huán)境

理論上，根據(jù)體內(nèi)器官形成的機制，類器官的構(gòu)建依靠自組織的形式。類器官自組織指的是無序結(jié)構(gòu)的細胞系統(tǒng)在系統(tǒng)自主機制引導(dǎo)下的空間重組。自組織主要分為2個過程：自我模式化及形態(tài)重排。自我模式化是初始同質(zhì)系統(tǒng)中細胞分化模式的形成，這是系統(tǒng)自治機制和局部細胞間通訊的結(jié)果。形態(tài)重排是組織內(nèi)不同細胞類型的分類和系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的更高層次重組的結(jié)果。類器官的構(gòu)建依賴于這兩個過程的成功實現(xiàn)，因此在體外培養(yǎng)是需要考慮到實現(xiàn)自組織所需要的條件，包括物理環(huán)境和化學(xué)條件。

表2 構(gòu)建類器官的不同起源細胞的比較Table 2 Comparison of different staring cells to construct organoids

2.1 培養(yǎng)的物理環(huán)境

細胞在體外生長依賴于細胞黏附和細胞骨架[29]，由于類器官是三維結(jié)構(gòu)，因此需要相應(yīng)環(huán)境的支持。目前，促使類器官形成三維特性最常見方法是使用支持細胞生長和細胞可以黏附的固體細胞外基質(zhì)?，F(xiàn)今實驗室細胞外基質(zhì)仍是主要使用天然的細胞外基質(zhì)，其主要優(yōu)點是存在細胞外基質(zhì)成分和生長因子的結(jié)合，可有效促進細胞的生長和分化。然而，這種復(fù)雜性和成分的可變性也使得控制培養(yǎng)環(huán)境更加困難，并且可能降低再現(xiàn)性。其中，Matrigel(基質(zhì)膠)是目前應(yīng)用最廣泛的三維有機體衍生基質(zhì)。由于天然細胞外基質(zhì)存在的缺陷，也有相關(guān)研究[30]提出了引入實驗室化學(xué)合成的細胞外基質(zhì)-化學(xué)水凝膠來進行類器官培養(yǎng)，以替代成分不太明確的天然基質(zhì)；針對不同水凝膠對類器官體系的適用性也進行了比較[31]。此外，據(jù)研究顯示，針對某類特定類器官，如視杯、大腦、小腦和海馬等神經(jīng)外胚層類器官，其培養(yǎng)方式為三維細胞聚集體的懸浮培養(yǎng)。理論上，干細胞在不進行外界干擾的情況下可自主分化為神經(jīng)類器官。而該方式也沒有利用固體支架，但某些條件下仍需添加低濃度的Matrigel以促進極化上皮結(jié)構(gòu)的形成。對于多能干細胞培養(yǎng)成腦皮質(zhì)類器官的穩(wěn)定性問題，相關(guān)研究也提出分化培養(yǎng)方案[32]。還有特殊的類器官，如腎臟類器官，使用氣液界面培養(yǎng)法進行構(gòu)建。

對于不同類器官培養(yǎng)方案的確定，主要源于經(jīng)驗實驗。實際上，由于缺乏對類器官培養(yǎng)方案的系統(tǒng)比較，因而對各種方案的優(yōu)缺點及應(yīng)用方面尚欠缺了解。

2.2 培養(yǎng)的化學(xué)條件

類器官培養(yǎng)所需的化學(xué)條件包括內(nèi)源性信號和外源性信號。理論上，體內(nèi)的類器官來源的細胞群體在規(guī)定的時間點暴露于特定的形態(tài)因子，從而引起所需的發(fā)育信號通路的激活。反過來，當(dāng)系統(tǒng)中存在所有必要條件時，細胞群體中激活的這些信號可以觸發(fā)自組織。因此，必須外部提供缺少的條件，自組織才能適當(dāng)?shù)剡M行，即外源性信號的添加。不同的類器官培養(yǎng)所需的內(nèi)源性信號和外源性信號不同，其取決于細胞類型和細胞所處的生長階段。例如，視杯類器官理論上可依靠內(nèi)源性信號構(gòu)建，實際研究中雖添加了低濃度的Matrigel,但仍主要依靠內(nèi)源性信號形成。腎臟類器官的形成僅在形成輸尿管上皮細胞和后腎間充質(zhì)細胞的混合體是需要添加外源性信號因子，隨后將自組織成腎臟類器官，而無需向培養(yǎng)基添加其他因子。胃類器官的構(gòu)建則較為復(fù)雜，其需要特定的外源性因子來使定形內(nèi)胚層分化朝后部前腸方向進行，隨后需要進一步的外源性刺激引導(dǎo)細胞走向胃竇或胃底上皮命運，從而引導(dǎo)細胞生長、形態(tài)發(fā)生和分化為功能性的胃細胞類型。

體內(nèi)和體外環(huán)境存在差異，縱然無法否認這些差異的存在，但許多特化功能仍可在體外培養(yǎng)中表達，因此，只要認識到類器官模型的局限性，充分發(fā)揮其優(yōu)勢，仍可使其在研究中發(fā)揮重要作用。

3 類器官的表征

類器官是不同細胞組成的復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，對于系統(tǒng)的建立，確定細胞的身份十分重要，從而保證類器官準(zhǔn)確地代表人器官的結(jié)構(gòu)和功能。類器官身份的鑒定，可從表型和基因型2個方面鑒定類器官與原始器官的同源性。

表型上，可通過H&E染色組織和器官切片進行組織病理學(xué)分析，以確定類器官的表型與靶器官是否一致。或通過免疫組織化學(xué)方法，根據(jù)生物標(biāo)志物的表達進行確認。基因型上，使用全基因組測序(WGS)可作為當(dāng)前的金標(biāo)準(zhǔn)來表征類器官基因組，包括拷貝數(shù)改變和體細胞突變。或者使用單細胞測序技術(shù)[33]比較類器官的轉(zhuǎn)錄圖譜與靶器官的轉(zhuǎn)錄圖譜。這種方法不僅提供了類器官內(nèi)細胞身份的信息，而且還可以確定所選細胞類型的譜系軌跡。此外，還有RNA斷層攝影[34]可以產(chǎn)生具有空間分辨率的細胞轉(zhuǎn)錄概況，從而提供關(guān)于器官結(jié)構(gòu)內(nèi)不同細胞類型的位置信息。

4 類器官的應(yīng)用

4.1 組織生物學(xué)研究

在基礎(chǔ)研究中，類器官可以用來研究發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和再生的原理。相比動物模型，類器官在研究器官發(fā)育上更具有實驗可及性，有助于更好地理解器官生物學(xué)。Dotti等[35]和Howel等[36]分別構(gòu)建出健康人和患者來源的腸類器官，并從基因水平上證實了這些類器官是研究人腸道發(fā)育分子調(diào)控機制的有利工具。Camp等[37]研究表明類器官中細胞的基因表達程序與相應(yīng)的胎兒組織中的基因表達程序非常相似，這表明可以在類器官培養(yǎng)中研究人類靶器官發(fā)育的各個方面。Nakano等[38]利用多能干細胞構(gòu)建出視杯類器官，該視杯類器官顯示出人體視杯特有的特征，即其神經(jīng)視網(wǎng)膜形成了多層組織，并包含視桿細胞和視錐細胞。這表明視杯類器官其組織形態(tài)變化可模擬人體視杯的發(fā)育。

另外，類器管的構(gòu)建提供了簡化且易得的“最小器官”，可用于研究不同組織成分對形態(tài)發(fā)生的影響。Farin等[39]利用腸道類器官研究wnt信號梯度在腸道中的作用，而在人體中paneth細胞是wnt等腸道肝細胞生態(tài)位信號的來源，通過該研究表明生理上paneth在腸道隱窩的空間限制決定了腸道干細胞的自我更新和分化命運。

4.2 疾病模型

類器官保留了體內(nèi)器官的表型及其體外的可操作性，因此可用于構(gòu)建更多疾病模型，且可進行藥物篩選或構(gòu)建生物庫。

在研究疾病發(fā)生方面，如感染性疾病、炎癥免疫性疾病、遺傳性疾病、腫瘤等，此前多采用轉(zhuǎn)化細胞系或動物模型，且在模型的再現(xiàn)性及重復(fù)性和倫理等方面都存在局限，以致給疾病藥物研究帶來阻礙。而類器官模型建立表明可運用類器官技術(shù)培養(yǎng)正常的人類器官模型，通過研究其致病機理，從而為研究治療藥物創(chuàng)造實驗條件。例如：Schlaermann等[40]構(gòu)建了人的胃類器官，模擬幽門螺旋桿菌病原體感染導(dǎo)致的炎癥因子的升高現(xiàn)象，再現(xiàn)了感染時宿主-病原體之間的關(guān)系。Dekkers等[41]從囊性纖維化(CF)患者的內(nèi)鏡活檢樣本中培養(yǎng)出對應(yīng)的類器官，驗證了其與臨床上的相似表型及對不同藥物的特異性基因型應(yīng)答。類器官還可通過結(jié)合第三代基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas技術(shù)，對基因進行編輯，從而快速觀察疾病表型的變化[42]。例如：Schwank等[43]結(jié)合CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，修復(fù)了缺陷基因，恢復(fù)了類器官功能，為研究遺傳性疾病提供新的方法和思路。另外，從腫瘤組織或腫瘤干細胞建立的類器官模型也可用于化療及靶向藥物篩選。目前，現(xiàn)有的模型無法測試抗血管藥和免疫治療藥物，在參考PDX建立上，可構(gòu)建PDOX模型，以補充這一方面模型的缺失，使藥物測試更全面。并且，為達到個性化治療，還可構(gòu)建腫瘤生物庫[44]。同時，對所建生物庫的表征，可進一步證實類器官對靶器官的再現(xiàn)性，使生物庫的建立意義更確信，為進一步的臨床應(yīng)用提供依據(jù)?，F(xiàn)階段，已有較完善的腫瘤生物庫有大腸癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、兒童腎癌。通過生物庫的建立，可將生物信息與電子醫(yī)療記錄(EMR)中的健康數(shù)據(jù)或通過監(jiān)測技術(shù)獲得的健康數(shù)據(jù)聯(lián)系起來，為個性化治療的實現(xiàn)提供實際可行的操作方案。Vlachogiannis等[45]采用先前參加過I期或II期臨床試驗的癌癥患者的腫瘤類器官，把類器官對藥物的反應(yīng)與患者在臨床上的實際反應(yīng)進行比較。實驗顯示類器官具有與患者腫瘤相似的表型和基因型，這表明了類器官作為藥物篩選和平臺開發(fā)的價值。除對藥物反應(yīng)的研究外，目前對腫瘤反應(yīng)性T細胞的產(chǎn)生和功能亦有限制，針對此，相關(guān)團隊[46]通過將腫瘤類器官與自體外周血淋巴細胞共培養(yǎng)進行研究。

4.3 再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用

健康或遺傳校正后的患者供體細胞(如結(jié)合CRISPR-Cas9等基因編輯技術(shù))所構(gòu)建的類器官，可用作再生醫(yī)學(xué)的細胞或組織來源[47]。類器官應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)有兩大優(yōu)勢，一是來源多樣，如成體干細胞、多能干細胞和胚胎干細胞；二是類器官和受體都來源于同個個體，可避免免疫排斥反應(yīng)。并且，與運用體外培養(yǎng)細胞進行移植相比，類器官在生理上的結(jié)構(gòu)和功能更接近原器官，因此可能更有利于移植，實現(xiàn)再生醫(yī)學(xué)。

相關(guān)研究利用動物模型的移植實驗探究類器官在再生醫(yī)學(xué)上的可行性。例如，有實驗研究[48]將小鼠胚胎干細胞或誘導(dǎo)多能干細胞衍生的3D視網(wǎng)膜組織進行移植，觀察了宿主-移植物的突觸連接，為晚期視網(wǎng)膜退行性疾病的視網(wǎng)膜片狀移植治療提供了證據(jù)，且研究結(jié)果顯示與分離的胚胎視網(wǎng)膜后代相比，3D結(jié)構(gòu)的移植物可更好地整合到宿主小鼠的視網(wǎng)膜中。基于該理論基礎(chǔ)，Shirai等[49]培養(yǎng)人胚胎干細胞來源的視網(wǎng)膜，并將其移植到大鼠和靈長類的視網(wǎng)膜變性模型中，結(jié)果證實了其存活和成熟的能力，并與宿主組織顯示出一定程度的整合。

5 類器官的未來及挑戰(zhàn)

由于類器官與真實器官具有高度的結(jié)構(gòu)和功能相似性，同時具有簡化性及易獲得性，因此可以用作研究中的代替品，這也將推動生物醫(yī)學(xué)研究。但上述應(yīng)用依賴于其在實驗過程長期維持性及可大量重復(fù)性，目前在該項技術(shù)中針對這兩方面的研究仍是重點及難點。此外，類器官雖能模擬與靶器官相似的結(jié)構(gòu)與功能，但其本質(zhì)仍是體外模型，缺乏與血管相關(guān)的聯(lián)系。針對類器官的缺陷，相關(guān)研究也提出了與生物工程技術(shù)等結(jié)合的思考，例如器官芯片技術(shù)[50]。利用該技術(shù)微流控原理可對類器官及其微環(huán)境進行標(biāo)準(zhǔn)化和機械化，進而更好地進行控制和分析。且可利用集成系統(tǒng)的原理將多個類器官進行結(jié)合，更好地再現(xiàn)生理功能和結(jié)構(gòu)。

未來的類器官技術(shù)將更加成熟，這將引導(dǎo)人類對生物的研究從基因組學(xué)到功能基因組學(xué)；從了解基因型與表型關(guān)系，到實現(xiàn)腫瘤精準(zhǔn)、個性化治療；從細胞、動物疾病模型到構(gòu)建類器官模型；從傳統(tǒng)的生物樣本庫到類器官生物樣本庫；從類器官到器官，最后實現(xiàn)器官再生。