方芝，陳勇兒，賀蓮，黃松，侯少貞

( 1．廣州中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，廣東 廣州 510006； 2．廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006； 3.廣東食品藥品職業(yè)學院，廣東 廣州 510520)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis， UC) 主要以腹痛腹瀉、便血黏血為臨床表現(xiàn)。該病多綿延不愈反復發(fā)作，呈慢性病程，其已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織認定為世界難治性疾病之一[1]。由于UC的發(fā)病機制并未被研究清楚，探討日常飲食因素對UC病情的影響十分必要。木糖醇是一種從植物(甘蔗、玉米渣等)中提取出的常用天然甜味劑[2-3]，廣泛被添加于各種飲料和食品中。有報道指出進食一定量的木糖醇，可引起腹瀉，這可能與其影響腸道滲透壓有關[4]。腹瀉發(fā)病原因和具體機制復雜多樣，其中在腸道刷狀緣上的鈉氫交換體(Na/H exchangers,NHEs)功能與腸道腹瀉存在密切的關系[5-6]。動物腸刷狀緣膜上的NHEs 包括NHE1、NHE2和NHE3三種類型的蛋白，NHE1位于遠端結(jié)腸上，其與碳酸氫根的運輸密不可分；而NHE2、NHE3在結(jié)腸和小腸中均有發(fā)現(xiàn)[7-9]。Moeser等[10-11]研究表明若將老鼠敲除NHE3后，動物出現(xiàn)腹瀉，這證明了NHE3在鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運的時候發(fā)揮了重要的作用，其缺失可能是引起腹瀉的直接原因。SGLT-1 是主動轉(zhuǎn)運蛋白，負責在食物中吸收葡萄糖及半乳糖，主要在小腸黏膜的刷狀緣表達。SGLT-1與NHE3均參與了腸道正常運輸Na+和葡萄糖等過程，并且SGLT-1/NHE3通路表達異常與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病密切相關[12-13]。木糖醇引起的腹瀉是否會加重結(jié)腸炎的病變及SGLT-1/NHE3通路表達的異常，目前均未見研究報道。本研究擬通過硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘導建立UC模型，并給UC小鼠自由飲用不同濃度的木糖醇飲料，考察木糖醇飲料對UC小鼠結(jié)腸病變的影響及對SGLT-1/NHE3通路表達的改變。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

木糖醇(xylitol)由阿法埃莎(中國)化學有限公司制備提供，批號：A18944；普通標準小鼠飼料購買于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心；生理鹽水，購于山東華魯制藥有限公司，批號：B16020402；PMSF和商品化的蛋白酶抑制劑(批號：AB432322)、PBS(批號：AB217272)，均購于賽默飛世爾生物化學有限公司；4%(φ)多聚甲醛，購于廣州化學試劑廠，批號：20180302-2；硫酸葡聚糖鈉(DSS)，購于西寶生物科技(上海)股份有限公司，批號：1840050；異硫氰酸熒光素-硫酸葡聚糖(FITC-dextran)，購于美國Sigma公司，批號：#BCBV6326；4%多聚甲醛固定液，購于Biosharp生物公司，批號：1611976；蘇木素伊紅染液，購于北京吉美生物技術有限公司，批號：JD3207；無水乙醇，購于廣州化學試劑公司，批號：20180703-2；乙醚，購于西隴化工股份有限公司，批號：180107；組織包埋盒，由江蘇世泰實驗器材有限公司提供，批號：19022。

1.2 儀器與設備

移液槍(量程分別為5 mL，100～1 000 μL，1～100 μL，1～20 μL)，德國Eppendorf公司，型號：3120 000.224；普通電子天平，型號：G&GJJ2000，江蘇常熟市雙杰測試儀器廠；萬分之一分析天平，型號：BS110S，德國Sartorius公司；-80 ℃超低溫冰箱(柜)，海爾公司；4 ℃離心機，湘儀離心機儀器有限公司，型號：TGL20MW；光學顯微鏡，奧林巴斯(中國)有限公司，型號：CKC2000；超純水儀，廣州譽維生物科技儀器有限公司，型號：K9860；組織脫水儀、組織包埋機和組織切片機均購于美國Thermo Fisher Scientific生物公司，型號分別為YD-6LA、TEC2800、KD-2508；激光共聚焦顯微鏡，型號：Smartproof 5，德國卡爾蔡司公司。

1.3 實驗動物

45只 SPF級雄性KM小鼠，體質(zhì)量25～30 g，廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2013-0002。

1.4 方法

1.4.1 UC模型的建立[14]采用2.5%DSS誘導小鼠出現(xiàn)UC。另將適量的木糖醇溶于2.5%的DSS溶液中，分別配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.05、0.025 g/mL的木糖醇飲料供試驗。

將昆明雄性小鼠隨機分為5組，即正常組(Normal)、UC 模型組及木糖醇飲料高、中、低劑量組。正常組給予蒸餾水；模型組給予2.5%DSS溶液；木糖醇高、中、低各組分別給予上述木糖醇飲料(濃度分別為10%、5%、2.5%)。各組小鼠均自由飲用和進食，連續(xù)14 d。以正常小鼠作為對照，UC模型組小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量顯著減輕、稀便甚至血便視為小鼠出現(xiàn)UC；觀察各組小鼠體質(zhì)量和糞便的變化情況。

1.4.2 藥效評價指標 分別于造模、干預期間，每天記錄動物的體質(zhì)量和飲食飲水情況，觀察動物的基本狀態(tài)，主要包含精神狀態(tài)、毛發(fā)、稀便血便的程度并評分疾病活動指數(shù)[15]。0：體質(zhì)量無下降，糞便性狀正常，隱血；1：體質(zhì)量下降1%～5%，糞便較軟，出現(xiàn)較模糊的紅色，不易分辨；2：體質(zhì)量下降5%～10%，糞便濕軟十分明顯，出現(xiàn)能分辨較模糊的紅色；3：體質(zhì)量下降10%～20%，半稀便，糞便出現(xiàn)明顯的紅色；4：體質(zhì)量下降>20%，便稀，糞便較深和大范圍的紅色，紅色面積比3分大。

解剖后記錄結(jié)腸長度、厚度、潰爛及粘連情況，計算結(jié)腸宏觀評分。結(jié)腸組織宏觀評分根據(jù)Ruiz[16]之前所制定的評判手段。0：正常；1：局部水腫，無潰瘍和組織壞死；2：兩處組織潰瘍壞死，潰瘍長度>1 cm；3：組織潰瘍壞死多處，潰瘍長度>2 cm。

1.4.3 腸道通透性檢測[17]末次木糖醇干預后禁食12 h，以1 mg/mL 異硫氰酸熒光素(FITC)標記的葡聚糖灌胃(0.1 mL /10 g)，4 h后，動物采用乙醚麻醉后用毛細玻璃管眼眶取血，離心15 min。精確吸取100 μL血清，在避光狀態(tài)下添加到黑色熒光酶標板上，每孔加入標準品100 μL，在波長480 nm和520 nm處檢測樣品的熒光強度。

1.4.4 結(jié)腸組織病理學分析 參考文獻[18]，按照常規(guī)方法制作結(jié)腸組織切片及設置病理評分標準。在尼康倒置顯微鏡下觀察各組結(jié)腸的病變情況。

1.4.5 免疫組化方法檢測緊密連接蛋白的表達[19]取結(jié)腸組織在-20 ℃區(qū)域用OTC包埋成型后，切片固定在玻片上，用 PBS 漂洗后在封閉緩沖液中封閉標本 60 min。按照說明書中推薦的稀釋比例(1∶200)，在抗體稀釋緩沖液中配制一抗(分別為ZO-1抗體和Occludin抗體)。甩干封閉緩沖液，加入稀釋后的一抗，在4 ℃下孵育過夜。用抗體稀釋緩沖液將熒光物質(zhì)標記的二抗(驢抗兔抗體)稀釋后，室溫下避光孵育標本 1～2 h。避光狀態(tài)下使用 DAPI (#8961) 染色5 min，封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察蛋白的表達情況。

1.4.6 Western blot法檢測SGLT-1和NHE3的表達

1.4.6.1 小鼠結(jié)腸組織勻漿 截取小鼠結(jié)腸段，稱取120 mg，加入800 μL的已混合1 mmol/L PMSF的RIPA強裂解液，研磨均勻后將離心管從組織研磨機中取出，放入離心機中，以4 ℃、12 000 r/min的條件離心20 min；吸取上清液置于干凈預冷的離心管中-20 ℃保存。

1.4.6.2 小鼠結(jié)腸組織BCA濃度測定 按BCA試劑盒說明書完成蛋白標準品的制備、BCA工作液的制備、加樣測定吸光度；根據(jù)標準曲線計算樣品的蛋白濃度，將各個樣品調(diào)整為相同蛋白濃度；將定量后的樣品蛋白與5×上樣緩沖液按照4∶1(v∶v)的比例混勻，用電磁爐煮沸5 min，冷卻后分裝，-20 ℃保存。

1.4.6.3 配膠、上樣、電泳 按Weng等方法[20]先配好分離膠，用無水乙醇壓膠后按上表比例配好濃縮膠，待膠完全凝固后開始上樣，將兩側(cè)加入Marker以便標記分子量位置。組織樣品上樣體積為10 μL，Marker的上樣體積為5 μL。在電壓80 V，電泳時間40 min條件下跑濃縮膠；分離膠的跑膠條件則為電壓120 V，電泳時間60 min；跑至目的蛋白相通分子量Marker條帶分離即可。倒入轉(zhuǎn)膜緩沖液，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h；將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜根據(jù)Marker分子量切出條帶區(qū)域，做好標記，隨后用TBST清洗3次，每次10 min；把條帶浸入5%BSA配置的封閉液中，置于室溫，搖床上振蕩2 h。

1.4.6.4 孵抗體 分別把條帶浸入各目的蛋白所在的抗體稀釋溶液中，NHE3、SGLT-1和β-actin均各用抗體稀釋液稀釋為1∶1 000，置于4 ℃冰箱孵育過夜。把條帶浸入TBST配制的二抗(用抗體稀釋液稀釋為1∶2 000)，置于搖床上室溫孵育3 h；隨后用冰TBST清洗3次，每次10 min。

1.4.6.5 顯影 將ECL化學發(fā)光液按試劑A∶試劑B=1∶1的比例避光配制適量，混勻后均勻滴加在PVDF膜正面，在顯影儀中進行顯影檢測。

1.4.6.6 數(shù)據(jù)處理 使用Image J分析軟件處理圖片中各個條帶的灰度值，并進行對比分析。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠外觀表征的變化

正常組小鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)整潔，糞便成型并且顏色正常，狀態(tài)較為活躍；模型組自由飲用2.5%的DSS溶液后，逐漸出現(xiàn)稀便，毛色蓬亂潮濕，進食量減少，個別動物出現(xiàn)便血。同時飲用木糖醇與DSS的混合溶液后，隨著木糖醇濃度的升高，動物的飲食量下降明顯，出現(xiàn)血便的情況更加明顯，提示高濃度木糖醇可加重UC小鼠的病變。

圖1 木糖醇干預UC小鼠Figure 1 Effect of xylitol on signs of UC mice

2.2 木糖醇對UC模型小鼠疾病活動指數(shù)的影響

按 “1.4.2”計算小鼠疾病活動指數(shù)(DAI)，以直觀地反映小鼠的病程變化。由圖2可知，與正常組比較，模型組小鼠DAI顯著上升(P<0.01)；與模型組相比，高濃度組木糖醇飲料組DAI明顯升高(P<0.01)。表明高濃度木糖醇飲料能夠加劇潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的病變。

Normal2.5%DSS2.5%DSS+2.5%xylitol2.5%DSS+5%xylitol2.5%DSS+10%xylitol2.82.11.40.70.0活動指數(shù)036912**##t/d

2.3 木糖醇對UC小鼠腸道通透性、結(jié)腸組織長度及厚度的影響

圖3結(jié)果顯示：與正常組相比，模型組小鼠的結(jié)腸組織長度未明顯縮短(P>0.05)，但結(jié)腸組織顯著增厚(P<0.01)；與模型組比較，高劑量木糖醇飲料組結(jié)腸組織長度明顯縮短，結(jié)腸組織厚度增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與正常組比較，模型組小鼠與低濃度木糖醇飲料組小鼠腸道通透性變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組相比，中、高濃度組木糖醇飲料組小鼠的腸道通透性明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05)。結(jié)腸宏觀病理改變評分結(jié)果可知，肉眼觀察即可發(fā)現(xiàn)中、高濃度組木糖醇飲料組小鼠結(jié)腸的病變明顯(P<0.01或P<0.05)。

2.4 各組小鼠組織病理觀察結(jié)果

結(jié)腸組織HE結(jié)果顯示，正常組小鼠結(jié)腸組織中無明顯的炎性細胞浸潤，細胞之間緊密連接，杯狀細胞和隱窩均無壞死或缺失，結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)清晰完整，杯狀細胞和隱窩結(jié)構(gòu)完整，排列整齊；與正常組小鼠相比，模型組小鼠結(jié)腸黏膜層組織出現(xiàn)多處的組織潰爛以及壞死，細胞與細胞間的排列紊亂不緊密，部分杯狀細胞缺失；木糖醇干預組結(jié)腸組織的細胞形態(tài)發(fā)生較為明顯的變化，大量的炎性細胞浸潤結(jié)腸組織，杯狀細胞明顯腫大，出現(xiàn)較為明顯的缺失，炎性細胞聚集。隨著木糖醇飲料濃度的升高，結(jié)腸組織病理學評分明顯增高，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖4。

2.5 木糖醇對UC小鼠組織緊密連接蛋白表達的影響

由圖5可知，正常組的ZO-1和Occludin的表達較為緊密，結(jié)構(gòu)清晰；模型組小鼠能夠降低緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達、結(jié)構(gòu)模糊；而隨木糖醇濃度的增高，UC小鼠結(jié)腸ZO-1和Occludin的表達進一步下降，其中木糖醇中、高劑量組與模型組的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。表明木糖醇能夠加劇UC小鼠的結(jié)腸黏膜屏損傷。

A.結(jié)腸組織HE染色(200×)； B.動物結(jié)腸組織病理評分。與正常組比較：##P<0.01； 與模型組比較：**P<0.01。

A.緊密連接蛋白ZO-1免疫熒光圖； B.緊密連接蛋白ZO-1免疫熒光強度統(tǒng)計； C.緊密連接蛋白Occludiin免疫熒光圖； D.緊密連接蛋白ZO-1免疫熒光強度統(tǒng)計。

2.6 木糖醇對UC小鼠組織腸刷狀緣鈉-氫轉(zhuǎn)運蛋白SGLT-1和NHE3表達的影響

由圖6可知，正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸NHE3和SGLT-1的表達顯著下降(P<0.01)。與模型組比較，木糖醇干預組隨木糖醇濃度增高，NHE3和SGLT-1的表達進一步降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。這表明木糖醇可通過抑制鈉/葡萄糖共轉(zhuǎn)運蛋白1(SGLT-1)從而減少NHE3的易位并引起腸刷緣破壞，加劇小鼠潰瘍性病變。

Normal2.5%DSS2.55.0102.5%DSS+xylitol(%)Normal2.5%DSS2.55.0102.5%DSS+xylitol(%)1.61.20.80.40.01.61.20.80.40.0####**##*######**##*##結(jié)腸NHE3的相對表達結(jié)腸SGLT-1的相對表達

3 討論

木糖醇是一種常用的、安全性比較高的天然甜味劑，廣泛用于食品和飲料的添加[21]。迄今，關于木糖醇對人體的不良影響的報道極少，已知的不良反應主要為腹瀉。腹瀉是結(jié)腸炎患者一個典型的癥狀，本實驗的研究目的旨在探討木糖醇攝入后是否會加劇結(jié)腸炎的病變。

木糖醇的甜度與蔗糖接近，市售含糖飲料的濃度一般為5%～10%，因此實驗中木糖醇設置的濃度最高為10%。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)10%的木糖醇飲料可加劇DSS誘導的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎引起的腹瀉，甚至個別動物血便情況加重。木糖醇可進一步降低UC小鼠腸壁屏障的功能，表現(xiàn)為腸上皮緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達的顯著下降；同時，與腹瀉發(fā)生密切相關的SGLT-1/NHE3通路的表達亦顯著下調(diào)。這提示高濃度木糖醇飲料對UC小鼠存在不利的影響，能加重其結(jié)腸病變程度。

讓研究人員不解的是，10%的木糖醇溶液可明顯加劇UC小鼠結(jié)腸病變，這與木糖醇在人群廣泛應用但不良反應報道極少相悖。推測其原因可能與不同種屬對木糖醇的敏感性不同，例如大劑量的木糖醇對狗、貓有明顯的副作用[22]；另外人體對木糖醇的耐受性比較高，少量攝入未能誘發(fā)不良反應。盡管如此，基于臨床UC患者的發(fā)病機制復雜、病情容易復發(fā)，筆者建議UC患者盡量避免攝入含量高的木糖醇飲料或食物，以減少潛在的風險。另外，本課題組后續(xù)實驗也發(fā)現(xiàn)：木糖醇飲料對結(jié)腸產(chǎn)生的不良影響是可逆的，只要停止木糖醇的攝入，小鼠出現(xiàn)的腸道不良反應即可快速消除。因此，科學使用木糖醇，即能避免其對機體潛在的不良影響。