袁芳，楊智承

(廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

肝移植、肝切除術(shù)中，需分次、分段阻斷肝臟血流，達(dá)到控制術(shù)中出血的目的，該過程會(huì)造成肝臟的缺血再灌注損傷(hepatic ischemic reperfusion injury ,HI/R)[1]。研究顯示，HI/R可造成肝竇內(nèi)細(xì)胞損傷，并誘導(dǎo)活性氧自由基，釋放促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子，引發(fā)肝細(xì)胞壞死、誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致肝功能異常，是肝臟手術(shù)的常見死亡原因[1-2]。近年來(lái)研究顯示，肝細(xì)胞凋亡在HI/R的病理過程中發(fā)揮重要作用[3]。

目前，針對(duì)肝缺血再灌注損傷，臨床以對(duì)癥支持治療為主，仍缺乏有效措施，亟待尋求預(yù)防HI/R的有效手段。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究顯示，中藥單體苦參堿(matrine，MT)有抗氧化、抗炎和護(hù)肝等作用[4-5]，對(duì)于缺血再灌注有保護(hù)作用[6-8]，但MT對(duì)于肝缺血再灌注的作用和機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。本研究在建立大鼠HI/R模型[9]的基礎(chǔ)上觀察 MT對(duì)HI/R的作用并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

苦參堿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%) 購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所,生產(chǎn)批號(hào)：110805-201509；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑和NE-PERTM細(xì)胞核和胞漿提取試劑盒均購(gòu)于Pierce Biolab 公司；MAPK家族一抗：ERK1/2、p38、JNK、MKK7抗體及內(nèi)參GAPDH購(gòu)于Cell Sigaling Technology公司；TUNEL染色試劑盒由美國(guó)Promega公司生產(chǎn)；丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Hitachi7180臨床分析儀、5810冷凍離心機(jī)(Eppendorf)；OlympusCKX41倒置顯微鏡(奧林巴斯)；-80 ℃超低溫冰箱(Thermo Scientific)；免疫印跡系統(tǒng)(BioRad)；680XHR凝膠成像系統(tǒng)(GBOX)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)： SCXK(粵)2019-0005。

1.4 分組與給藥

健康成年雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為4組，每組6只：(1)肝缺血再灌注組(I/R組):連續(xù)7 d腹腔注射含1%吐溫80生理鹽水；(2)苦參堿(MT組)：給藥劑量分別為20、40 mg/kg，溶解于含1%吐溫80生理鹽水，連續(xù)7 d腹腔注射。該劑量由臨床常用苦參堿劑量折算[10- 11]，并通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定給藥天數(shù)。(3)假手術(shù)組(Sham組):連續(xù)7 d腹腔注射含1%吐溫80的生理鹽水。

1.5 模型建立

大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水。I/R組和MT組分別給予溶媒和苦參堿30 min后，經(jīng)腹腔注射4%(φ)戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，固定，常規(guī)消毒。取上腹正中切口入腹，用無(wú)創(chuàng)血管夾阻斷肝門靜脈和肝動(dòng)脈，造成約70%肝臟缺血。1 h后去除血管夾，恢復(fù)缺血肝的血流，縫合腹腔，繼續(xù)再灌注4 h，取左葉肝臟組織標(biāo)本和下腔靜脈血待測(cè)；Sham組給予同體積生理鹽水溶媒腹腔注射30 min后，開腹及暴露肝蒂處理后，關(guān)腹，不阻斷肝血流，然后縫合腹腔，4 h后同上取樣本待測(cè)[9]。

1.6 標(biāo)本處理

所有血漿樣本，常溫離心15 000 r/min×15 min，取上清-80 ℃凍存。肝組織用PBS清洗后，凍存于液氮中，待測(cè)。檢測(cè)時(shí)，解凍肝組織，稱重，用1∶10(v∶v)的冰浴PBS勻漿，4 ℃，14 000×g離心15 min。分離上清，分別測(cè)定酶活性和蛋白定量。肝組織10%(φ)甲醛固定，石蠟包埋制成蠟塊備用。將包埋肝組織蠟塊進(jìn)行修塊、脫水、包埋、切片等處理后，按照說(shuō)明，分別進(jìn)行HE染色和TUNEL染色。另取5 g肝組織，破碎離心后，用于Western blot檢測(cè)。

1.7 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、MDA和SOD的檢測(cè)

血清ALT、AST用Hitachi7180臨床分析儀進(jìn)行檢測(cè)。按照說(shuō)明書，利用酶比色法試劑盒測(cè)定組織中MDA、SOD的含量。

1.8 組織病理學(xué)檢測(cè)

HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行肝組織的病理形態(tài)學(xué)觀察。

1.9 TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡

每個(gè)切片隨機(jī)選取10個(gè)陽(yáng)性視野，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒者為凋亡細(xì)胞，計(jì)算每張切片中的凋亡細(xì)胞數(shù)目。

1.10 Western blot檢測(cè)

肝臟組織在冰上用含有10 mmoL/L Tris (pH 7.5)，1.5 mmoL/L MgCl2，10 mmoL/L KCl 和0.1% Trition X-100的緩沖液中混懸、勻漿裂解，12 000 r/min,4 ℃離心15 min，取上清收集總蛋白。5×上樣緩沖液混合煮沸5 min。垂直板電泳分離條帶，轉(zhuǎn)膜，分別加入GADD45Β、MMK7、MAPK家族蛋白ERK1/2、磷酸化ERK1/2、磷酸化p38、p38、磷酸化JNK和JNK一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，洗膜后用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶2 000，HRP標(biāo)記)孵育2 h，利用化學(xué)發(fā)光儀器曝光，采集目標(biāo)蛋白條帶。Western blot圖像灰度值采用Quantity One2.4軟件分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18.0軟件處理數(shù)據(jù)，各組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血漿ALT、AST和組織中MDA、SOD的比較

血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果提示：與假手術(shù)組比較，I/R組血清ALT、AST水平均顯著升高(P<0.01);MT(20、40 mg/kg)組血清ALT、AST水平與I/R組比較顯著降低(P<0.01)，且高劑量組的降低程度較低劑量組更顯著(見表1 )。

與假手術(shù)組比較,I/R組組織中MDA、SOD含量均顯著增加(P<0.01); MT(20、40 mg/kg)組組織中MDA與I/R組比較顯著降低、SOD含量增高(P<0.01或P<0.05)(見表1)。

2.2 各組肝組織病理學(xué)變化

HE染色肝組織，顯微鏡下可見：Sham組肝索排列規(guī)則，肝竇不擴(kuò)張，僅少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。I/R組肝組織腫脹、肝竇擴(kuò)張，肝細(xì)胞空泡變性和點(diǎn)狀壞死，周圍有大量紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴有空泡變性和點(diǎn)狀壞死。 MT 20、40 mg/kg組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞腫脹程度和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況，均較I/R組有所減輕(見圖1)。

2.3 TUNEL檢測(cè)各組肝細(xì)胞凋亡情況

TNUEL檢測(cè)結(jié)果顯示，I/R組、MT 20、40 mg/kg組均有一定數(shù)量的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。較之I/R組，MT 40 mg/kg組降低明顯(P<0.01),見圖2。

2.4 Western blot結(jié)果

2.4.1 各組ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38和p-p38的表達(dá)情況 與Sham組比較， I/R組和MT組的p-JNK和p-p38蛋白表達(dá)顯著增加 (P<0.01)；與I/R組比較，MT 20、40 mg/kg組p-JNK、p-p38表達(dá)顯著降低(P<0.05)，對(duì)于p-ERK1/2則無(wú)明顯影響，見圖3。

2.4.2 各組MKK7的表達(dá)情況 Sham組僅有少量MKK7表達(dá)；與Sham組比較，I/R組MKK7的表達(dá)顯著升高(P<0.01)，MT組可以顯著降低MKK7表達(dá)(P<0.05)，見圖4。

表1 各組ALT、AST、MDA和SOD水平比較Table 1 Comparison of the levels of ALT,ALT,MDA and SOD in each group

A. Sham 組； B. I/R組； C.MT 20 mg/kg組；D. MT 40 mg/kg組。

p-ERK1/2ERK1/2p-JNKJNKp-p38p381234p-ERK1/2p-JNKp-p38543210****####1234AB蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

中藥單體苦參堿具有抗氧化[12]、抗炎、抗代謝等一系列作用[7,13]，有報(bào)道苦參堿術(shù)前單次靜脈注射，可以通過TRAIL/BAX途徑抑制大鼠肝缺血-再灌注損傷后的肝細(xì)胞凋亡[13]。但報(bào)道多為一次性術(shù)前預(yù)防給藥，與臨床治療模式不符，且苦參堿對(duì)于凋亡的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。因此本研究在建立大鼠HI/R模型的基礎(chǔ)上，將臨床常用苦參堿劑量折算成動(dòng)物給藥劑量[10-11]，大鼠連續(xù)7 d給予苦參堿(20、40 mg/kg)腹腔注射后，實(shí)施肝缺血再灌注術(shù)，術(shù)后立即采樣，保存標(biāo)本。肝功能各項(xiàng)指標(biāo)顯示：苦參堿組AST和ALT的含量，肝組織中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA含量明顯低于肝缺血再灌注組(P<0.01)，肝組織中的抗氧化酶SOD含量，則高于肝缺血再灌注組(P<0.01)。病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，肝缺血再灌注組的肝組織標(biāo)本可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝竇擴(kuò)張，肝細(xì)胞空泡變性并有多處壞死灶；苦參堿高劑量組的肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均較肝缺血再灌注組明顯減少；苦參堿低劑量組的肝組織損傷也較肝缺血再灌注組輕。結(jié)果提示苦參堿連續(xù)給藥預(yù)處理，有助于緩解肝缺血再灌注損傷，具有護(hù)肝作用。

蛋白相對(duì)表達(dá)量1234AB2.01.51.00.50.0MMK71234MKK7GAPDH#*

本研究同時(shí)檢測(cè)了各組肝細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，苦參堿高劑量組能夠明顯減少缺血再灌注后的肝細(xì)胞凋亡，低劑量組對(duì)凋亡也有改善趨勢(shì)。

多項(xiàng)研究均顯示，在肝缺血再灌注損傷引發(fā)的肝壞死、術(shù)后死亡等一系列問題中，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2]，而絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路在調(diào)控肝細(xì)胞凋亡的作用已被諸多研究證實(shí)[1,14-15]。MAPK是一組能被不同的細(xì)胞外刺激如：細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素等激活的絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，包括ERK、JNK、p38 MAPK和ERK5四個(gè)亞族[16]，其中p38和C-Jun 氨基末端激酶(c-JunN-terminal kinase,JNK)通路的磷酸化激活和細(xì)胞凋亡與應(yīng)激時(shí)的多種病理生理過程有關(guān)[17-18]。

為探討苦參堿發(fā)揮肝缺血再灌注保護(hù)作用的機(jī)制，進(jìn)一步研究了苦參堿預(yù)處理對(duì)于肝缺血再灌注肝組織中MAPK通路的JNK、p38和ERK表達(dá)的影響。研究顯示，苦參堿預(yù)處理可顯著降低肝缺血再灌注肝組織中磷酸化JNK、p38表達(dá)，且對(duì)磷酸化JNK的表達(dá)影響最為顯著。JNK在多種組織中均有表達(dá)，能被MAPK激酶MKK7特異性激活[18-19]。反之，抑制MKK7的特異位點(diǎn)，可以最終達(dá)到抑制JNK磷酸化，發(fā)揮抗凋亡的作用[20]。本研究進(jìn)一步觀察了苦參堿預(yù)處理對(duì)于調(diào)控JNK磷酸化的MKK7表達(dá)，結(jié)果顯示，苦參堿預(yù)處理可以顯著降低JNK的調(diào)控激酶MKK7的表達(dá)，因此苦參堿抗肝缺血再灌注的機(jī)制可能與抑制MKK7表達(dá)，降低JNK磷酸化有關(guān)。

綜上所述，苦參堿預(yù)處理對(duì)大鼠肝缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用，其可能機(jī)制與抑制MAPK通路的MKK7/JNK磷酸化以及p38磷酸化，發(fā)揮抗肝細(xì)胞凋亡作用有關(guān)，對(duì)于苦參堿預(yù)防肝缺血再灌注損傷的臨床意義有待進(jìn)一步研究，其相關(guān)信號(hào)通路的上游調(diào)控機(jī)制也有待進(jìn)一步明確。