任妍，陳嘉慧，張雅心，劉孟華，鄒威，何盈，饒文婷，黃凱，周鳳華

(1.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515； 2.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515； 3.湖南省婦幼保健院，湖南 長(zhǎng)沙 410008)

《素問(wèn)·痹論》中“脈者，血之府也，澀則心痛。”可見(jiàn)，冠心病是由于病邪久留于心以致瘀血，使得血行不暢、心脈失養(yǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致津痰凝結(jié)、氣滯血瘀，最終心脈癥積而成[1]。針對(duì)冠心病瘀毒致變的基本病機(jī)，本課題組確立從心論治冠心病的治療思想，選取南方醫(yī)院臨床效驗(yàn)方定心方(Dingxin Recipe，DXR)中主入心經(jīng)的黃連、丹參、酸棗仁及靈芝四味藥材，組成定心方Ⅳ號(hào)，共奏清熱解毒、益氣活血功效。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，定心方Ⅳ號(hào)能有效調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血脂水平，延緩斑塊進(jìn)展，但其發(fā)揮藥效的成分不清楚[2]。因此，本研究采用靈敏準(zhǔn)確的超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技術(shù)，首次鑒定了定心方Ⅳ號(hào)的化學(xué)成分，尋找其發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，以期為后續(xù)藥理機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290型高效液相色譜儀-6550Q/TOF-MS/MS(美國(guó)Agilent科技公司)；Qualitative Analysis質(zhì)譜分析軟件以及MassHunter 色譜工作站；EYELA N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(埃郎科技國(guó)際貿(mào)易上海有限公司)；BT25S型電子分析天平(廣州計(jì)量檢測(cè)技術(shù)研究院檢定合格，編號(hào)20080775)及ELGA ClassicUV超純水系統(tǒng)。

1.2 藥材與試劑

丹參飲片(廣西玉林有田藥業(yè)有限公司，批號(hào)180701)；黃連片(廣東大翔藥業(yè)有限公司，識(shí)別號(hào)187HX18D01)；酸棗仁片(廣東大翔藥業(yè)有限公司，批號(hào)BJHX18F01)；靈芝片(廣東大翔藥業(yè)有限公司，批號(hào)187HX18D01)，飲片由南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院張宏偉教授鑒定。腺嘌呤(批號(hào)：A8626，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%)、腺嘌呤核苷(批號(hào)：A9251，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%)、原兒茶酸(批號(hào)：03930590，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>97%)、原兒茶醛(批號(hào)：D108405，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>96.5%)、咖啡酸(批號(hào)：C0625，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)、丹參酮ⅡA(批號(hào)：T4952，質(zhì)量>98%)、丹酚酸A(批號(hào)：97599，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>97.5%)、丹酚酸B(批號(hào)：SML0048，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)、丹參素(批號(hào)：SML0679，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)，均購(gòu)買自默克生命科學(xué)(上海)有限公司。甲醇、甲酸均為分析純(廣州光華科技股份有限公司)，水為Millipore超純水。

2 方法

2.1 檢測(cè)條件

2.1.1 色譜條件 采用ZORBAX Eclipse-C18(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)液相色譜柱；檢測(cè)柱溫為25 ℃；流動(dòng)相由0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)組成，梯度洗脫(0～10 min，95%A；10～38 min，95%～0%A；38～40 min，0%A)；流速為0.5 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI源)，在正、負(fù)兩種模式下進(jìn)行掃描，分子量檢測(cè)范圍為50～1 000 D。干燥氣體積流量：14 L/min，干燥氣溫度：250 ℃，霧化氣壓力：241 kPa，裂解電壓：175 V，鞘氣流量：11 L/min，鞘氣溫度：350 ℃，鞘氣溫度：65 V，毛細(xì)管電壓：3 500 V，八級(jí)桿1射頻電壓：750 V，噴嘴電壓：1 000 V，碰撞能量：20 V。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取丹參15 g、黃連15 g、酸棗仁20 g、靈芝10 g，浸泡1 h，再加400 mL水，煮1 h后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成質(zhì)量濃度為1 g/mL的藥液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

取腺嘌呤、腺嘌呤核苷、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、丹參酮ⅡA、丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素對(duì)照品適量，精密稱定，加入甲醇配置成含各對(duì)照品質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

3 結(jié)果

3.1 建立復(fù)方全成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)

在國(guó)內(nèi)外數(shù)據(jù)庫(kù)，包括CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)、Pubmed、ScienceDirect、Web of Science等檢索丹參、黃連、酸棗仁、靈芝成分的有關(guān)文獻(xiàn)，共總結(jié)出707種復(fù)方中藥材的化學(xué)成分，其中包括275種靈芝化學(xué)成分，254種丹參化學(xué)成分，148種黃連化學(xué)成分及30種酸棗仁化學(xué)成分；建立包含化合物名稱、結(jié)構(gòu)式、分子式、精確分子量的復(fù)方成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。

3.2 化合物鑒定

采用UPLC-Q-TQF-MS/MS技術(shù)，依據(jù)“2.1”項(xiàng)下條件檢測(cè)供試品溶液，根據(jù)保留時(shí)間的先后順序?qū)?fù)方中化學(xué)成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，得到正、負(fù)離子模式的總離子流圖(TIC)，結(jié)果見(jiàn)圖1。根據(jù)已建立數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)信息，采用對(duì)照品對(duì)照、各化合物的精確質(zhì)荷比、保留時(shí)間、二級(jí)碎片裂解離子并結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)定心方Ⅳ號(hào)的化學(xué)成分進(jìn)行進(jìn)一步確證，最終在定心方Ⅳ號(hào)的供試品溶液總離子流圖中鑒別出54個(gè)化合物，包括14個(gè)酚酸類化合物、10個(gè)生物堿類化合物、8個(gè)萜類化合物、6個(gè)苯丙醇類化合物、5個(gè)黃酮類化合物和11個(gè)其他類化合物，其他類化合物包括氨基酸類、嘌呤類及木脂素類等。誤差值小于8×10-6，具體保留時(shí)間、分子式、理論值、主要碎片及藥材歸屬情況等見(jiàn)表1。各成分的藥材歸屬情況依據(jù)文獻(xiàn)及課題組前期的單味藥材液質(zhì)結(jié)果進(jìn)行判斷，并依據(jù)對(duì)照品與文獻(xiàn)對(duì)化合物進(jìn)行指認(rèn)及鑒定。

圖1 定心方Ⅳ號(hào)供試品的正離子模式(A)與負(fù)離子模式(B)TIC圖Figure 1 The total ion chromatogram (TIC) of positive ion mode (A) and negative ion mode (B) of DXR IV

表1 定心方Ⅳ號(hào)中的化合物鑒定Table 1 Identification of chemical constituents from DXR IV

表1 (續(xù))

3.3 復(fù)方水提液中主要化學(xué)成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律解析

3.3.1 酚酸類化合物 共鑒定出14個(gè)酚酸類化合物，包括丹參素(峰7)、原兒茶酸(峰8)、原兒茶醛(峰12)、咖啡酸(峰14)、綠原酸(峰15)、阿魏酸(峰18)、異阿魏酸(峰24)、丹酚酸F(峰25)、丹酚酸T(峰32)、丹酚酸D(峰39)、紫草酸(峰40)、迷迭香酸(峰42)、丹酚酸B(峰43)及丹酚酸A(峰46)，其中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、綠原酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A經(jīng)對(duì)照品對(duì)照確認(rèn)。沒(méi)有對(duì)照品的化合物采用準(zhǔn)確分子量和碎片裂解規(guī)律確定。丹酚酸類化合物是該處方中的特色化合物，主要來(lái)源于藥材丹參。在多級(jí)碎裂中，丹酚酸類化合物以丹參素基的丟失和CO及H2O的丟失較為明顯[48]。峰46的準(zhǔn)分子離子峰為m/z493.114 0[M-H]-，二級(jí)質(zhì)譜碎片離子為313.070 9[M-H-C9H8O4]-及295.061 0[M-H-C9H10O5]-，經(jīng)對(duì)照品及文獻(xiàn)[41]對(duì)比后確認(rèn)為丹酚酸A，可能裂解途徑見(jiàn)圖2。

3.3.2 二萜類 共鑒定出5個(gè)二萜類化合物，分別為化合物Tanshinol B(峰16)、tanshinaldehyde(峰48)、新隱丹參酮(峰52)、1,2,15,16-四氫丹參醌(峰53)及隱丹參酮(峰54)，均來(lái)自藥材丹參，且以丹參酮類化合物為特色化合物。該類成分的MS分子離子峰多為基峰，?？梢?jiàn)丟失1個(gè)或多個(gè)CO的碎片離子峰。在tR=38.707 min時(shí)，峰54給出的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z297.1485，失去一分子CO與一分子水后生成二級(jí)質(zhì)譜碎片離子m/z251.143 8，與文獻(xiàn)[49]描述相符，故推測(cè)為隱丹參酮，可能的裂解途徑見(jiàn)圖3。

3.3.3 三萜類 共鑒別出3個(gè)三萜類化合物，包括Epoxyganoderiol B(峰47)、Betulonic acid(峰50)及靈芝酸Md(峰51)，該類成分主要來(lái)自靈芝及酸棗仁。峰50的準(zhǔn)分子離子峰為m/z455.352 0[M+H]+，失去一分子CO與一分子水后生成二級(jí)質(zhì)譜碎片離子m/z409.348 1，進(jìn)一步裂解生成m/z369.279 0離子，結(jié)合文獻(xiàn)[44]鑒定為Betulonic acid。

3.3.4 生物堿類 共鑒別出10個(gè)生物堿類化合物，包括烏藥堿(峰17)、木蘭堿(峰19)、Stecepharine(峰26)、小檗紅堿(峰27)、黃連堿(峰28)、表小檗堿(峰29)、四氫小檗堿(峰31)、藥根堿(峰33)、小檗堿(峰36)、巴馬汀(峰37)，其中小檗堿(峰36)已經(jīng)對(duì)照品對(duì)比確認(rèn)。本處方中的生物堿類化合物來(lái)自藥材黃連及酸棗仁，且以黃連為主要來(lái)源。該類化合物在正離子模式下均產(chǎn)生[M+H]+的母離子，易丟失CO、CH4等。在tR=22.525 min時(shí)，峰36給出的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z336.123 0，失去一分子CH3后生成m/z321.099 0離子，進(jìn)一步裂解生成二級(jí)質(zhì)譜碎片離子292.096 6[M+H-CH4-CO]+，結(jié)合文獻(xiàn)[50-51]及對(duì)照品確認(rèn)為小檗堿，可能的裂解途徑見(jiàn)圖4。

圖2 丹酚酸A(峰46)的裂解途徑Figure 2 The fragmentation of Salvianolic acid A (Peak 46)

圖3 峰54(隱丹參酮)可能的裂解途徑Figure 3 The feasible fragmentation of Peak 54 (Cryptotanshinone)

3.3.5 黃酮類 共鑒定出5個(gè)黃酮類化合物，分別為Vicenin-II(峰23)、斯皮諾素(峰34)、當(dāng)藥素(峰38)、6?-阿魏酰斯皮諾素(峰44)及煙花苷(峰45)，均來(lái)自于藥材酸棗仁。本研究依據(jù)準(zhǔn)確分子量及碎片裂解規(guī)律對(duì)此類化合物進(jìn)行鑒別確認(rèn)。在質(zhì)譜條件下，該類化合物主要在C環(huán)發(fā)生RDA(Retro-Diels-Alder)裂解，生成A環(huán)和B環(huán)2個(gè)碎片離子，若其A環(huán)具有5,7-二羥基取代則易失去中性分子C3O2、C2H2O等[52]。峰34在負(fù)離子模式下可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z607.166 8[M-H]-,首先從準(zhǔn)分子離子峰上脫去C4H8O4生成m/z487.127 4離子，進(jìn)而再脫去C2H4O2生成m/z427.103 5離子；結(jié)合文獻(xiàn)[28]及特征碎片離子推測(cè)為斯皮諾素，裂解途徑見(jiàn)圖5。

圖4 小檗堿(峰36)的裂解途徑Figure 4 The fragmentation of Berberine(Peak 36)

圖5 斯皮諾素(峰34)可能的裂解途徑Figure 5 The feasible fragmentation of Spinosin (Peak 34)

3.3.6 苯丙醇類 共鑒定出6個(gè)苯丙醇類化合物，包括3-(3′4′-Dihydroxyphenyl)-(2R)-lactic acid-4′-O-β-d-glucopyranoside(峰9)、3-(3′4′-Hydroxy-phenyl)-(2R)-lactic acid(峰10)、Methyl-3-(4′-O-β-d-glucopyranosyl-3′4′-dihydroxyphenyl)-lactate(峰13)、5-O-Feruloylquinic acid(峰20)、4-O-Feruloylquinic acid(峰22)及Methyl 4-O-feruloylquicinate(峰35)。該類化合物均來(lái)自黃連，多含酚羥基及羧基，并結(jié)合文獻(xiàn)[14]進(jìn)行指認(rèn)。峰22的準(zhǔn)分子離子峰為m/z367.103 5[M-H]-，脫去C10H10O4生成m/z173.046 6離子，結(jié)合文獻(xiàn)[24]推測(cè)為4-O-Feruloylquinic acid。

3.3.7 其他類 包括有機(jī)酸類、氨基酸類、嘌呤類、木脂素類等。3號(hào)峰給出準(zhǔn)分子離子峰m/z191.019 7[M-H]-，二級(jí)質(zhì)譜碎片離子為163.033 3[M-H-CO]-，結(jié)合結(jié)構(gòu)式及文獻(xiàn)[6]推測(cè)為枸櫞酸。經(jīng)對(duì)照品鑒定，分別鑒定出1號(hào)峰、5號(hào)峰為腺嘌呤與腺嘌呤核苷。

4 討論

定心方Ⅳ號(hào)中的主要成分包括以丹酚酸A/B/D/E/F及丹參素為主的酚酸類化合物，以隱丹參酮、新隱丹參酮為主的二萜類化合物，以小檗堿、表小檗堿、巴馬汀、藥根堿等為主的生物堿類化合物及以斯皮諾素與6?-阿魏酰斯皮諾素為主的黃酮類化合物。研究證實(shí)，丹酚酸A可減少動(dòng)脈血栓形成，抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活化，下調(diào)極低密度脂蛋白受體，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[53]；丹參素可通過(guò)抗氧化機(jī)制減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，發(fā)揮心血管保護(hù)作用[54]；小檗堿能抗血小板聚集，影響血栓形成，并降低實(shí)驗(yàn)大鼠血清與組織中甘油三酯含量，降低血清游離脂肪酸水平，改善大鼠脂代謝[55]。此外，在定心方Ⅳ號(hào)水提液中鑒定出了酸棗仁中活性最好的抗氧化組分即6?-阿魏酰斯皮諾素，但研究顯示其與斯皮諾素在總抗氧化能力反應(yīng)中呈拮抗作用[56]，提示后續(xù)研究需進(jìn)一步測(cè)定復(fù)方中各化學(xué)成分的含量，以便區(qū)分復(fù)方中實(shí)際發(fā)揮抗氧化作用的有效成分。本研究表明，定心方Ⅳ號(hào)水提液中包含多種可抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、減小血栓形成及改善脂代謝的化學(xué)成分，有利于抗動(dòng)脈粥樣硬化，該結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。由此可見(jiàn)，定心方Ⅳ號(hào)清熱解毒、益氣活血的作用確有一定的現(xiàn)代藥理基礎(chǔ)。

值得注意的是，雖然各單味藥材化學(xué)成分所組成的復(fù)方數(shù)據(jù)庫(kù)中成分?jǐn)?shù)量繁多，但實(shí)際指認(rèn)出的成分僅有54種，可能由溶劑、藥材品質(zhì)、藥材批次等原因所致。由于組成復(fù)方的藥材成分較為復(fù)雜、所含同分異構(gòu)體較多、部分成分可參考文獻(xiàn)較少、無(wú)統(tǒng)一化合物名稱等因素，使部分成分指認(rèn)的可信程度受損。此外，各藥材成分重疊度雖較小，能根據(jù)保留時(shí)間進(jìn)行一定程度的區(qū)分，但仍然對(duì)探究定心方Ⅳ號(hào)的化學(xué)成分有所阻礙。在更進(jìn)一步的研究中，應(yīng)增加供試藥材的批量，建立定量結(jié)構(gòu)分析的結(jié)構(gòu)鑒定方法，并對(duì)各成分進(jìn)行定量分析。

綜上，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，首次對(duì)定心方Ⅳ號(hào)水提液所含的化學(xué)成分進(jìn)行了分析，較傳統(tǒng)方法有更高的分離度及敏銳度，基本闡明了復(fù)方的組成成分，對(duì)定心方Ⅳ號(hào)水提液成分的研究與鑒定有一定價(jià)值，為進(jìn)一步闡明定心方Ⅳ號(hào)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理作用研究提供參考。