李恒，羅宇琴，雷玉婧，彭幫貴，姚曉璇，魏梅，孫冬梅

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244)

紅花為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL. 的干燥花，具有活血通經(jīng)、散瘀止痛的功效，用于經(jīng)閉、痛經(jīng)、惡露不行、癥瘕痞塊、胸痹心痛、瘀滯腹痛、胸脅刺痛、跌撲損傷、瘡瘍腫痛[1]。紅花含有黃酮類、多炔類、木脂素類、生物堿類等多種化學成分[2-5]，其中黃酮類成分羥基紅花黃色素A和山柰素是紅花中的主要活性成分[6]，也是2015年版《中國藥典》一部紅花項下的質(zhì)控指標。紅花配方顆粒以符合炮制規(guī)范的紅花飲片為原料，經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒等現(xiàn)代工藝制成?，F(xiàn)有的紅花配方顆粒質(zhì)量標準相關(guān)文獻僅對部分指標的含量進行測定[7-9]，未見特征圖譜的相關(guān)報道。本研究采用UPLC法建立了紅花配方顆粒的特征圖譜，采用HPLC法建立了指標成分羥基紅花黃色素A和山柰素的含量測定方法，擬為綜合評價紅花配方顆粒的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與材料

ACQUITY UPLC H-Class型超高效液相色譜儀，e2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；ME204E型電子分析天平，XP26型百萬分之一電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q Direct型超純水機(德國Merck公司)。

紅花對照藥材(批號：120907-200609)、羥基紅花黃色素A(批號：111637-201609)及山柰素(批號：110861-201611)對照品購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇(德國Merck 公司)和磷酸(天津市科密歐化學試劑有限公司)為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。15批紅花配方顆粒均來自廣東一方制藥有限公司，編號依次為S1～S15。

2 方法與結(jié)果

2.1 特征圖譜測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent SB C18柱(100 mm × 2.1 mm，1.8 μm)；流動相：乙腈(A)-0.5%磷酸溶液(B)梯度洗脫(0～6 min，5%→8%A；6～10 min，8%→10%A；10～20 min，10%→18%A；20→28 min，18%→30%A；28～29 min，30%→90%A)；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；檢測波長：345 nm；進樣量：1 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取羥基紅花黃色素A對照品適量，加25%(體積分數(shù)，下同)甲醇制成含羥基紅花黃色素A 195.710 2 μg/mL的溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取紅花配方顆粒適量，研細，精密稱取0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%(體積分數(shù)，下同)乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得[1]。

2.1.4 專屬性試驗 取麥芽糊精、紅花對照藥材及紅花配方顆粒適量，按“2.1.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項色譜條件測定，如圖1。結(jié)果顯示，4個共有特征峰均不受輔料、溶劑等因素的干擾，表明方法專屬性良好。

2.1.5 精密度試驗 取同一紅花配方顆粒(編號S1)供試品溶液，按“2.1.1”項色譜條件進樣6次。以1號峰羥基紅花黃色素A為參照峰，計算各特征峰相對保留時間及相對峰面積的RSD分別為0.20%～0.35%，1.30%～2.08%，表明儀器精密度較好。

ABCDE1(S)234048121620242832t/min

2.1.6 重復性試驗 取同一紅花配方顆粒(編號S1)6份，按“2.1.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項色譜條件測定。以羥基紅花黃色素A為參照峰，計算各特征峰相對保留時間及相對峰面積的RSD分別為0.20%～0.28%，0.66%～2.68%，表明方法重復性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取同一紅花配方顆粒(編號S1)供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h按“2.1.1”項色譜條件測定。以羥基紅花黃色素A為參照峰，計算各特征峰相對保留時間及相對峰面積的RSD分別為0.30%～0.45%，1.21%～1.72%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 特征圖譜的建立 取15批紅花配方顆粒，按“2.1.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項色譜條件測定，得到15批紅花配方顆粒的UPLC特征圖譜疊加圖見圖2。可見，15批紅花配方顆粒特征圖譜中有4個色譜峰能穩(wěn)定重現(xiàn)，故確定了4個特征峰，其中1號峰鑒定為羥基紅花黃色素A。

2.2 羥基紅花黃色素A質(zhì)量分數(shù)的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent SB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(體積比26∶2∶72)，柱溫：30 ℃，流速：1 mL/min，檢測波長：403 nm，進樣量：10 μL。色譜圖見圖3。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取羥基紅花黃色素A對照品適量，加25%(體積分數(shù)，下同)甲醇制成含羥基紅花黃色素A 401.235 4 μg/mL的對照品儲備液。

048121620242832t/min1(S)234S15S14S13S12S11S10S9S8S7S6S5S4S3S2S1

AB110.300.200.100.000.300.200.100.00AUAU101202468t/min

2.2.3 供試品溶液的制備 取紅花配方顆粒適量，研細，精密稱取0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用25%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得[1]。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項下對照品儲備液5 mL，置10 mL量瓶中，加25%甲醇定容至刻度，分別稀釋成質(zhì)量濃度為12.538 6、25.077 2、50.154 4、100.308 9、200.617 7 μg/mL的對照品溶液。按“2.2.1”項下色譜條件進樣，測定羥基紅花黃色素A的峰面積，以羥基紅花黃色素A的峰面積為縱坐標、進樣量為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=3 288 646.99X+76 887.537 3(r=0.999 5)，結(jié)果表明羥基紅花黃色素A進樣量在0.125 4～4.012 3 μg范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好線性關(guān)系。羥基紅花黃色素A的檢測限(S/N=3)為0.40 μg/mL，定量限(S/N=10)為1.60 μg/mL。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液，按“2.2.1”項色譜條件進樣6次，結(jié)果測得羥基紅花黃色素A峰面積RSD值為0.15%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 精密稱取同一紅花顆粒樣品(編號S1)6份，按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件測定，結(jié)果測得樣品中羥基紅花黃色素A質(zhì)量分數(shù)RSD值為0.46%，表明方法重復性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液(編號S1)，分別在0、2、4、8、12、24 h按“2.2.1”項色譜條件進樣，結(jié)果測得羥基紅花黃色素A峰面積RSD值0.56%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗 取同一批已知含量的紅花配方顆粒(編號S1)9份，每份約0.1 g，精密稱定，分為3組，每組分別按樣品中羥基紅花黃色素A質(zhì)量分數(shù)的50%、100%、150%加入羥基紅花黃色素A對照品，按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件測定，結(jié)果測得平均回收率為96.97%，RSD為2.78%，見表1。

表1 羥基紅花黃色素A加樣回收率試驗結(jié)果Table 1 The recovery of hydroxysafflor yellow A(n=9)

2.2.9 樣品測定 取15批紅花配方顆粒，按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件測定，得到15批紅花配方顆粒的羥基紅花黃色素A的質(zhì)量分數(shù)為28～39.86 mg/g，平均質(zhì)量分數(shù)為33.91 mg/g；轉(zhuǎn)移率為53.85%～91.36%，平均轉(zhuǎn)移率為72.94%。

2.3 山柰素質(zhì)量分數(shù)的測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters X-Bridge C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱，流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液(體積比52∶48)，柱溫：30 ℃，流速：0.9 mL/min，檢測波長：367 nm，進樣量：10 μL。色譜圖見圖4。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取山柰素對照品適量，加甲醇制成含山柰素94.163 μg/mL的對照品儲備液。精密吸取上述儲備液適量，加甲醇進一步稀釋成質(zhì)量濃度分別為38.944、4.708 15 μg/mL的對照品溶液1和2，即得。

1110121402468t/min0.300.200.100.000.300.200.100.00AUAU

2.3.3 供試品溶液的制備 取紅花配方顆粒適量，研細，精密稱取0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液15 mL，置平底燒瓶中，加鹽酸溶液(15→37)5 mL，搖勻，置水浴中加熱水解30 min，立即冷卻，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得[1]。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.2”項對照品溶液1各0.2、0.3、0.5、0.75、1.5、3.0 mL，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，分別配制成質(zhì)量濃度為1.557 8、2.336 7、3.894 5、5.841 7、11.683 5、23.366 9 μg/mL的對照品溶液。按“2.3.1”項色譜條件進樣測定，以山柰素峰面積為縱坐標、進樣量為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=4 584 822.54X-12 064.606 6(r=1.000 0)，結(jié)果表明山柰素進樣量在0.015 6～0.399 4 μg范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好線性關(guān)系。山柰素的檢測限(S/N=3)和定量限(S/N=10)分別為0.08、0.25 μg/mL。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取“2.3.2”項對照品溶液2，按“2.3.1”項色譜條件進樣6次，結(jié)果測得山柰素峰面積RSD值為0.47%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復性試驗 精密稱取同一紅花配方顆粒(編號S1)6份，按“2.3.3”項方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項色譜條件測定，結(jié)果測得樣品中山柰素質(zhì)量分數(shù)RSD值為3.86%，表明方法重復性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一紅花配方顆粒(編號S1)供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h按“2.3.1”項色譜條件進樣測定，結(jié)果測得山柰素峰面積RSD值為0.61%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率試驗 取同一批已知含量的紅花配方顆粒(編號S1)9份，每份約0.1 g，精密稱定，分為3組，每組分別按樣品中山柰素質(zhì)量分數(shù)的50%、100%、150%加入山柰素對照品，按“2.3.3”項方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項色譜條件測定，結(jié)果測得平均回收率為103.19%，RSD為4.44%，見表2。

表2 山柰素加樣回收率試驗結(jié)果Table 2 The recovery of kaempferol(n=9)

2.3.9 樣品測定 取15批紅花配方顆粒，按“2.3.3”項方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項色譜條件測定，得到15批紅花配方顆粒的山柰素的質(zhì)量分數(shù)為1.17～2.27 mg/g，平均質(zhì)量分數(shù)為1.6 mg/g；轉(zhuǎn)移率為37.42%～74.63%，平均轉(zhuǎn)移率為55.57%。

3 討論

供試品溶液制備方法考察中，分別對提取溶劑、提取方式、提取時間等因素進行了考察。特征圖譜考察了25%甲醇、70%甲醇、70%乙醇、甲醇4種溶劑，羥基紅花黃色素A含量測定考察了10%甲醇、25%甲醇、60%甲醇3種溶劑。分析比較所得圖譜，特征圖譜及羥基紅花黃色素A含量測定分別采用70%乙醇和25%甲醇為提取溶劑時，成分提取最完全，圖譜提供的信息量最大。羥基紅花黃色素A、山柰素含量測定及特征圖譜考察了提取方式(超聲和加熱回流)和提取時間，從提取效率和操作方便考慮，羥基紅花黃色素A、山柰素含量測定采用超聲提取40 min和30 min；特征圖譜采用加熱回流提取30 min。15批紅花配方顆粒的羥基紅花黃色素A和山柰素的質(zhì)量分數(shù)分別為28～39.86 mg/g，1.17～2.27 mg/g，差異較小，與制劑用原藥材質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定有關(guān)。

本研究對特征圖譜色譜條件進行了優(yōu)選，分別采用乙腈-0.5%甲酸、甲醇-0.5%甲酸溶液、乙腈-0.5%磷酸、甲醇-0.5%磷酸溶液為流動相系統(tǒng)進行考察，結(jié)果顯示采用乙腈-0.5%磷酸可以使色譜峰達到良好的分離效果。對比了不同波長(220、254、275、345 nm)下各成分的吸收情況，當選取345 nm作為檢測波長時，基線平穩(wěn)、干擾較小，同時檢測出更多特征成分，且各特征峰峰面積相差不大。考察不同柱溫、流速及色譜柱對羥基紅花黃色素A、山柰素含量測定及特征圖譜的色譜條件耐用性的影響，結(jié)果顯示柱溫、流速的微小變化及不同廠家的色譜柱對指標成分含量、特征峰的相對峰面積和相對保留時間影響較小，表明方法的耐用性良好。

綜上所述，本研究建立的紅花配方顆粒UPLC特征圖譜及含量測定方法穩(wěn)定性、重復性良好，可為紅花配方顆粒的質(zhì)量控制和評價提供參考。