牛 群，孫秋爽，邱志霞，黃 芳*

（1中國藥科大學中藥學院中藥藥理與中醫(yī)藥學系，南京211198；2中國藥科大學藥學院藥物代謝動力學研究中心，南京211198）

SLC13A5基因編碼的載體蛋白又被稱為質膜檸檬酸轉運體/鈉離子依賴的檸檬酸轉運體（plasma membrane citrate transporter/Na+-citrate transporter，PMCT/NaCT），該載體蛋白位于上皮細胞質膜上，是控制檸檬酸轉運的開關，負責將循環(huán)系統中的檸檬酸轉運進入細胞內。早期對于SLC13A5的研究主要集中在果蠅、秀麗隱桿線蟲等低等生物中，通過降低SLC13A5的表達，可顯著延長它們的壽命，其機制類似于熱量限制，該研究揭示了SLC13A5基因對代謝過程的調控作用，因此SLC13A5也被稱為長壽基因（I’m not dead yet，INDY）［1］。在哺乳動物中，SLC13A5主要在肝臟中高度表達，在腎、睪丸和大腦中也有一定分布。研究發(fā)現，在肥胖、NAFLD、胰島素抵抗等患者中，其肝臟SLC13A5的表達都顯著升高［2］。而敲除SLC13A5基因的小鼠可以避免高脂飲食（high fat diet，HFD）誘導的上述代謝性疾病的發(fā)生［3］。由于檸檬酸水平與糖脂代謝的高度相關性，SLC13A5已經成為調控能量代謝和脂質代謝的理想靶點，許多針對SLC13A5設計的小分子抑制劑，在體內外試驗中均可以抑制SLC13A5的表達，與在SLC13A5基因敲除、沉默或干擾等動物模型中的實驗結果相一致——肝臟脂質合成明顯減弱，脂質堆積顯著緩解［3-4］。

1 SLC13A家族

SLC13A家族包括5個基因，即SLC13A1～SLC13A5，其編碼具有8～13個跨膜螺旋的轉運蛋白。這些共轉運蛋白位于上皮細胞的質膜上，表達廣泛，但主要分布于肝、腎、小腸、胎盤和中樞神經系統，它們在不同的器官中發(fā)揮著不同的生理、病理作用。按照功能，SLC13A家族成員可分為兩類：（1）轉運硫酸鹽、硒和硫代硫酸鈉的共轉運蛋白（sodium-sulfate cotransporter，NaS），包 括SLC13A1 和 SLC13A4；（2）轉 運 三 羧 酸 循 環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）中間體琥珀酸、檸檬酸和α-酮戊二酸等的共轉運蛋白（sodium-di and tri-carboxylate cotransporter，NaDC），包括 SLC13A 2、SLC13A3和SLC13A5［5］。

SLC13A1，也被稱為NaS或NaSi-1，主要定位于腎近端小管和腸上皮細胞的頂端刷狀緣膜，對維持硫酸鹽穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。SLC13A1基因缺陷小鼠表現出許多病理特征，如低硫血癥、高硫尿、體質量下降、出生后生長和生育力下降、循環(huán)類固醇水平降低、糖皮質激素增加以及肝臟內脂質代謝改變等［6-7］。SLC13A4主要在胎盤和睪丸中表達，在腦、心臟、胸腺、肝臟和扁桃體中則表達較少，主要維持硫酸鹽的穩(wěn)態(tài)。硫酸鹽是胎兒生長發(fā)育的必需營養(yǎng)素［8］。有研究發(fā)現在小鼠中，腎臟SLC13A1在孕鼠中維持著較高的硫酸鹽循環(huán)水平，而胎盤中SLC13A4可調節(jié)胎鼠的硫酸鹽供應。這兩個基因都與小鼠嚴重的胚胎缺陷和胎鼠流產有關。但是，SLC13A1和SLC13A4在人類妊娠中的臨床意義尚不清楚［9］。

SLC13A2/NaDC1、SLC13A3/NaDC3 以 及SLC13A5則負責將細胞內的陰離子中間體如檸檬酸和琥珀酸從血液輸送到細胞內，這些中間體可以作為能源或細胞內的信號分子，參與到細胞的能量代謝和糖脂代謝中。其中，SLC13A2和SLC13A3主要在腎臟和腸道表達，兩者對琥珀酸的親和力高于檸檬酸，通過阻斷SLC13A2和SLC13A3可以抑制腎臟對檸檬酸的再攝取，增加檸檬酸的腎排泄，并且可以防止鈣沉積形成腎結石［10］。與前兩者不同，SLC13A5主要在肝臟表達，對檸檬酸的親和力最高，其主要功能是將血液循環(huán)中的檸檬酸轉運進入細胞內，參與脂質從頭合成途徑生成脂肪酸，調控細胞內糖脂代謝［11］（表1）。

2 檸檬酸在糖脂代謝中的作用

在正常的生理條件下，組織中的檸檬酸來源于血漿，其檸檬酸濃度相對恒定，范圍為50～200 μmol/L［16-17］。肝臟是脂質合成與代謝的主要場所，肝臟內檸檬酸來源主要有3個途徑：（1）由TCA并經由線粒體檸檬酸轉運體（SLC25A1/mitochondrial citrate carrier，CIC）轉運進入胞質；（2）由質膜上的檸檬酸轉運體（SLC13A5/PMCT）將血液循環(huán)中的檸檬酸轉運進入胞質；（3）由谷氨酰胺分解產生的α-酮戊二酸經過羧化反應產生檸檬酸。不論哪種來源的檸檬酸，均需要在胞質中的ATP依賴性檸檬酸裂解酶（ATP-dependent citrate lyase，ACLY）作用下轉化為草酰乙酸（oxaloacetate，OAA）和乙酰輔酶A（Acetyl-CoA），其中，乙酰輔酶A是生物合成三酰甘油（triglyceride，TG）、脂肪酸、低密度脂蛋白和膽固醇的重要前體分子。此外，檸檬酸還可以通過促進聚合，激活乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-coA carboxylase，ACC），后者則是催化脂質從頭合成的關鍵限速步驟［18］。另外，檸檬酸可以抑制多種糖酵解的關鍵酶，通過變構調節(jié)抑制磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK），同時通過降低1，6-二磷酸果糖的水平間接抑制丙酮酸激酶，從而對糖酵解產生負反饋作用［19］，同時通過激活1，6-二磷酸果糖激酶（fructose 1，6-bisphosphate phosphatase，F-1，6-BP）刺激糖異生，最終協調糖脂代謝［20-21］。因為檸檬酸能激活脂肪酸合成，影響糖異生和糖酵解通量，所以胞漿檸檬酸濃度與脂肪生成直接相關，是肝臟脂質合成與代謝的關鍵調節(jié)劑（圖1）。

表1 SLC13A家族成員在不同種屬中的分布及生理功能[12-15]

3 SLC13A5的轉錄與調控

圖1 調控檸檬酸在肝臟生物代謝中的作用[22]PMCT:質膜上的檸檬酸轉運體;F-1,6-BP:1,6-二磷酸果糖激酶;ACLY:ATP依賴性檸檬酸裂解酶;OAA:草酰乙酸;ACC:乙酰輔酶A羧化酶;PFK:磷酸果糖激酶;CIC:線粒體檸檬酸轉運體;TG:三酰甘油

SLC13A5作為調控細胞內糖脂代謝的重要靶點，其轉錄與調控受到越來越多的關注，許多研究成果為SLC13A5作為代謝性疾病潛在治療靶點的深入研究提供了理論依據。

研究發(fā)現，SLC13A5的轉錄調控是由營養(yǎng)狀態(tài)調節(jié)的，這表明代謝因素參與了該過程。例如，在果蠅中限制熱量攝入，可以顯著降低SLC13A5的表達［23］。小鼠饑餓超過36 h后，其肝臟內SLC13A5的表達會明顯減少［3］。相反，大鼠灌胃給予大量橄欖油，會誘導其肝臟中SLC13A5表達顯著升高［24］。Etcheverry等［25］通過全基因組甲基化與基因表達的綜合分析發(fā)現，膠質母細胞瘤患者中隨著其啟動子的高甲基化，肝臟SLC13A5的表達會明顯下調，證明SLC13A5的調節(jié)主要由表觀遺傳機制介導。

Neusch?fer-Rube等［26］研究發(fā)現，在大鼠肝原代細胞中，饑餓早期釋放的胰高血糖素可以調節(jié)SLC13A5的表達水平。胰高血糖素通過與SLC13A5啟動子區(qū)域cAMP依賴性反應元件蛋白（cAMP responsive element binding protein，CREB）的結合位點結合，瞬時增加SLC13A5的表達。體內研究表明，高脂飲食-鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠肝臟中SLC13A5水平升高，其中CREB是結構性活躍的。該課題組后續(xù)研究發(fā)現，SLC13A5為芳基碳氫化合物受體（arylhyrocarbon receptor，AhR）的靶基因，誘導AhR依賴的SLC13A5基因表達增加可能與肝臟脂肪變性有關［27］。高能量飲食和苯并［a］芘能夠激活AhR并異源二聚化為AhR核轉運子（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，Arnt），通過與SLC13A5啟動子中潛在的結合位點結合，使其移位到細胞核并激活和上調SLC13A5轉錄。該課題組已經在大鼠和人SLC13A5的啟動子區(qū)域中確定了AhR可能的結合位點。試驗證實AhR激動劑苯并［a］芘以AhR依賴的方式誘導大鼠肝原代細胞SLC13A5表達升高，使檸檬酸攝取和脂質合成增加，進而造成肝臟脂肪沉積。

愈來愈多的研究將SLC13A5的轉錄與脂質代謝聯系起來。SLC13A5已被確定為孕烷X受體（pregnant X receptor，PXR）的一個新的轉錄靶點，而PXR與脂質代謝和能量平衡有關。應用基于細胞的熒光素酶報告、電泳遷移率改變和染色質免疫沉淀等多種分析手段，鑒定了位于SLC13A5基因轉錄起始點上游的兩個增強子模塊，并對它們進行了功能鑒定，發(fā)現它們與PXR介導的SLC13A5誘導有關。給予PXR激動劑利福平，人肝原代細胞中SLC13A5 mRNA和蛋白水平以及脂質含量均顯著升高；而單獨下調SLC13A5表達可導致HepG2細胞脂質含量顯著降低。上述研究表明，SLC13A5水平升高在肝臟脂肪變性和代謝紊亂中具有重要作用［28］。

另外，von Loeffelholz等［2］研究發(fā)現，連續(xù)輸注白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）14 d后，小鼠肝臟SLC13A5 mRNA水平顯著提高，肝臟中檸檬酸的攝取和脂肪酸的合成均增加。其機制可能與白細胞介素受體磷酸化、轉錄因子STAT3激活以及后者轉移到細胞核有關。研究結果最終揭示IL-6/STAT3通路在體內的激活增加了SLC13A5的表達，從而增加檸檬酸的攝取和肝臟的脂肪生成。

4 SLC13A5在代謝性疾病中的作用

von Loeffelholz等［2］首次報道了NAFLD患者肝臟中SLC13A5水平升高與脂肪變性之間的直接聯系。其研究發(fā)現在偏瘦的個體中，SLC13A5表達降低與低水平的肝臟脂肪有關，而在體重指數增加和肝臟脂肪含量高的個體中，SLC13A5水平則升高。同樣，在非靈長類動物中，給予高脂肪高蔗糖飲食以及高脂肪低蛋氨酸、膽堿缺乏飲食誘導的小鼠，其肝臟中SLC13A5水平顯著升高。另外，該團隊還對NAFLD患者和對照樣本進行了肝臟微陣列研究，結果發(fā)現NAFLD患者肝臟全基因組轉錄水平的變化與參與脂質合成、代謝和免疫過程的基因表達增加之間存在關聯。

考慮到SLC13A5與脂質代謝之間的聯系，將SLC13A5作為治療代謝紊亂的重要靶點已成為研究熱點。越來越多的研究已證實，敲除SLC13A5基因和藥理性抑制SLC13A5均可以改善NAFLD、肥胖和胰島素抵抗等代謝性疾病。

4.1 SLC13A5與肝臟脂質代謝的關系研究

Birkenfeld 等［3］研究證實，整體敲除 SLC13A5基因的小鼠可以避免HFD誘導的胰島素抵抗、NAFLD和肥胖等代謝性疾病的發(fā)生。而這種保護作用主要是通過減少肝臟新生脂肪生成、增加肝臟脂質氧化、改善線粒體脂質氧化等過程實現。

Brachs等［29］的研究也發(fā)現，通過siRNA選擇性地敲除/沉默小鼠肝臟內SLC13A5基因，可以顯著改善高胰島素-正常血糖鉗夾試驗中的胰島素敏感性，并降低三酰甘油在肝臟中的蓄積，同時不依賴于體重的變化。

應用2′-O-甲氧乙基嵌合反義寡核苷酸（2′-O-methoxyethyl chimeric anti-sense oligonucleotide，ASO），選擇性敲除肝臟SLC13A5基因，觀察對高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠全身脂質和糖代謝的影響。結果發(fā)現，在ASO處理4周后，與對照組相比，ASO處理組體重無明顯變化，肝臟SLC13A5 mRNA表達降低91%，空腹血漿胰島素水平降低74%，血漿三酰甘油降低35%，肝臟三酰甘油含量亦顯著降低。在高胰島素-正常血糖鉗試驗中，肝臟糖異生降低25%［30］。這些數據表明敲除SLC13A5基因可以改善肝臟葡萄糖生成、增強胰島素敏感性和保護NAFLD等代謝性疾病的代謝表型。

另外，Li等［31］應用shRNA沉默人肝癌細胞系HepG2和Huh7中SLC13A5基因的表達，可顯著抑制細胞增殖、集落形成和誘導細胞周期停滯。其機制可能是通過影響細胞內脂質代謝過程實現的：敲除SLC13A5基因后，HepG2和Huh7細胞內檸檬酸濃度、ATP/ADP比率、磷脂含量和ATP依賴性檸檬酸裂解酶表達降低。而這些發(fā)現也進一步證實了上述提到的SLC13A5基因敲除小鼠試驗中的研究結果［3］。

4.2 SLC13A5抑制劑的研究

Sun等［32］最先使用質膜轉運體的同源模型和基于蛋白脂質體的試驗，通過分子對接技術初步篩選SLC13A5的小分子抑制劑，并檢測它們對檸檬酸轉運的抑制活性，其中有的小分子抑制劑的抑制率可達到約73%。但這些抑制劑在體內的吸收、分布、代謝和排泄均較差，因而限制其進一步的研究與開發(fā)。

輝瑞公司研發(fā)的一種新型二羧酸鹽小分子化合物PF-06649298，在體內外均能有效地抑制SLC13A5對檸檬酸的轉運，并且具有較高的選擇性［4］。轉運試驗結果表明，PF-06649298是以底物競爭和立體變構的方式與SLC13A5特異性結合，即作為SLC13A5轉運的底物產生抑制作用，這恰好與基于底物的設計策略相吻合。小鼠高脂飲食喂養(yǎng)12周后，按照250 mg/kg的劑量給予PF-06649298或賦形劑，每天2次，連續(xù)3周。結果顯示，在口服葡萄糖耐量試驗中，PF-06649298組可以完全逆轉高脂飲食引起的葡萄糖耐量的降低。此外，與高脂飲食模型組相比，PF-06649298組的小鼠肝臟和血漿三酰甘油含量顯著降低，而酰肉堿、β-羥基丁酸酯濃度則明顯增加。隨后，有研究人員應用分子建模技術、SLC13A5基因定點突變、轉運特性和細胞表面生物素化等多種手段來確定參與抑制劑結合和轉運的殘基［33］。然而，由于PF-06649298在體內的暴露和效力有限，不能對其機制進行廣泛的活體表征。但是其研究結果為SLC13A5抑制劑的轉運和抑制機制研究提供了新的見解，并為未來SLC13A5抑制劑的藥物設計與開發(fā)提供了依據。

借鑒PF-06649298的設計和開發(fā)經驗，Huard等［34］又發(fā)現了一種更有效的抑制劑PF-06761281，在抑制人肝細胞攝取檸檬酸方面的效力是前者的20倍，同時對SLC13A5的體外選擇性是前者的25倍。用放射性［14C］-檸檬酸進行體內研究發(fā)現，在嚙齒類動物的肝臟中，PF-06761281對［14C］-檸檬酸攝取的抑制呈現明顯的劑量依賴性，即抑制效力高度依賴于環(huán)境中檸檬酸的濃度［35］。結合基因敲除模型、基因沉默或干擾等試驗得到的結果，表明PF-06761281可明顯減弱肝臟脂質合成，顯著緩解脂質堆積。但PF-06761281在體內會增加血漿和尿液中檸檬酸鹽的濃度，因此其應用和安全性還有待進一步的研究。

5 總結與展望

NAFLD、肥胖、胰島素抵抗等代謝性疾病，影響因素多，發(fā)病機制復雜，臨床無特效藥物，已成為日益嚴重的全球性問題，逐年升高的發(fā)病率為全球醫(yī)療帶來了嚴重的經濟負擔，影響人民的健康生活。

越來越多的體內外研究已經證實，上述代謝性疾病患者肝臟中SLC13A5的表達顯著增加。SLC13A5表達缺失或降低可以減少肝臟檸檬酸的攝取與轉運，進而降低脂質從頭合成的通量，抑制肝臟脂肪沉積，改善肝臟胰島素和葡萄糖水平，對糖脂代謝的調節(jié)具有積極的意義?；赟LC13A5與代謝性疾病發(fā)生發(fā)展過程的高度相關性，可以推測，SLC13A5將成為未來代謝性疾病研究極具潛力的作用靶點，對其分子藥理學機制的深入研究則可以為藥物開發(fā)和臨床診療提供新的思路和策略。