沈 杰，查 倩，高向東，陳 松

（中國藥科大學生命科學與技術學院江蘇省生物藥物成藥性研究重點實驗室，南京211198）

線粒體是細胞內(nèi)有氧呼吸的主要場所，參與了細胞代謝、信號傳導、氧化應激等多種重要胞內(nèi)活動［1-2］。呼吸鏈在線粒體中發(fā)揮著重要作用，線粒體復合體Ⅰ是呼吸鏈中結構最復雜、包含亞基最多的多蛋白復合體，由45種細胞核和線粒體基因編碼的蛋白裝配而成，相對分子質(zhì)量約1 000 kD［3-4］，它能夠?qū)ADH中的電子通過黃素單核苷酸傳遞給輔酶Q，并將質(zhì)子傳遞出線粒體內(nèi)膜進而產(chǎn)生能量［5-6］，為生命體的生命活動提供必要的能量，參與調(diào)控細胞生長、信號轉(zhuǎn)導和細胞凋亡等生命活動，在細胞能量代謝中發(fā)揮著重要作用［7-8］。

NDUFS7（NADH dehydrogenase（ubiquinone）Fe-S protein 7）是由細胞核內(nèi)基因編碼，人類NDUFS7基因定位于19號染色體，編碼的蛋白質(zhì)參與構成線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ，相對分子質(zhì)量約為20 kD，是復合體Ⅰ疏水亞基的重要組成部分［9-11］。線粒體復合體Ⅰ功能障礙可導致細胞功能發(fā)生障礙并退化凋亡，多種神經(jīng)毒素例如MPTP和魚藤酮等已經(jīng)被證明能夠抑制線粒體復合體Ⅰ的活性從而導致多巴胺能神經(jīng)元的退化［12-13］，線粒體功能發(fā)生障礙時，可能誘發(fā)細胞內(nèi)線粒體膜電位水平異常從而導致細胞死亡。此外有研究證明神經(jīng)退行性疾病也與復合體Ⅰ中亞基突變有著密切聯(lián)系［11，14］。NDUFS7 基因作為線粒體復合體Ⅰ的重要組成部分，其突變可能導致多巴胺能神經(jīng)元的退化。課題組前期基于線蟲模型發(fā)現(xiàn)了線粒體復合體Ⅰ亞基NDUFS7（線蟲NDUF7同源）突變導致多巴胺能神經(jīng)元退化［15］，但其對于人源多巴胺能神經(jīng)細胞的影響仍需進一步驗證。

本研究通過構建pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染分化后SH-SY5Y細胞，考察轉(zhuǎn)染NDUFS7基因突變質(zhì)粒對多巴胺能神經(jīng)細胞活力、凋亡情況以及細胞內(nèi)Bax、Bcl-2蛋白表達量的影響，同時采用抗氧化劑進行干預，明確轉(zhuǎn)染NDUFS7基因突變質(zhì)粒后可能通過影響線粒體正常功能導致多巴胺能神經(jīng)細胞凋亡。

1 材料

1.1 試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；DNA Marker（日本 TaKaRa公司）；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑、蛋白預染Marker、蛋白酶和磷酸酶抑制劑（美國Thermo公司）；Bax、Bcl-2抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG（美國Cell Signaling Technology公司）；β-actin抗體（中國Abclonal公司）；胰蛋白酶（美國Sigma公司）；MTT、氨芐青霉素、鏈霉素、牛血清白蛋白（中國Biosharp公司）；PVDF膜、ECL試劑盒（美國Millipore公司）；BCA蛋白濃度檢測試劑盒、RIPA細胞裂解液、一抗稀釋液、Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒、Hoechst 33342、碘化丙啶（propidium iodide，PI）（中國碧云天生物技術研究所）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器

高速冷凍離心機、全波長酶標儀、NanoDrop 2000C超微量分光光度計（美國Thermo公司）；倒置相差顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；TDZ5-WS臺式離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；流式細胞儀（美國Becton-Dickinson公司）。

1.3 菌株和細胞

TOP10菌株、神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y細胞株購自美國菌種保藏中心（ATCC）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及其誘導分化

SH-SY5Y細胞于含10%胎牛血清，1×105IU/L氨芐青霉素，100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。3 d后，取生長狀態(tài)良好的細胞按1∶3進行傳代，于含有終濃度為10 μmol/L反式維甲酸的DMEM高糖培養(yǎng)基中分化，連續(xù)分化6 d，每2 d換液一次，第7天進行后續(xù)實驗。

2.2 pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP質(zhì)粒的構建

將人源NDUFS7基因208位谷氨酰胺密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，與pcDNA3.1（+）質(zhì)粒連接構建pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至TOP10菌株中，使用LB培養(yǎng)基對含有突變基因質(zhì)粒的TOP10菌株進行擴增，接種于含100 mg/L氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性單克隆，于LB液體培養(yǎng)基中擴增并制成甘油菌保存。

2.3 pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP質(zhì)粒的鑒定

將含有pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP質(zhì)粒的TOP10菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至A為2.0～3.0，使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒提取質(zhì)粒。使用EcoRⅠ、XbaⅠ對質(zhì)粒進行雙酶切后制樣，取樣品溶液10 μL于1.0%瓊脂糖凝膠中上樣，90 V，30 min電泳，凝膠成像儀成像并拍照。

2.4 MTT法檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒對細胞活力的影響

實驗分為空白對照組、pcDNA3.1（+）對照組、pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。收集生長狀態(tài)良好的分化后SH-SY5Y細胞，以每毫升5×104個細胞的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，在含5%CO2細胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜。待細胞匯合度達到80%左右，更換無血清opti-MEM培養(yǎng)基，2 h后進行細胞轉(zhuǎn)染。按每孔Lipofectamine 3000 0.15 μL、P3000 0.2 μL、DNA 0.1 μg進行 pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，共同孵育5 h后將培養(yǎng)基換為含1%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，MTT法檢測各實驗組細胞活力：每孔加入MTT溶液10 μL，于含5%CO2細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育4 h后吸出上清液，加入DMSO 150 μL并置于酶標板振蕩器上500 r/min振蕩10 min，以570 nm檢測波長，630 nm參比波長于酶標儀中檢測各孔吸收度。

2.5 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染結合流式細胞術檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒對細胞凋亡情況的影響

實驗分組同“2.4”項。收集生長狀態(tài)良好的分化后SH-SY5Y細胞，以每毫升5×104個細胞的密度接種于6孔板中，每孔1 000 μL，在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜。待細胞匯合度達到80%左右，更換無血清opti-MEM培養(yǎng)基，2 h后進行細胞轉(zhuǎn)染。每孔Lipofectamine 3000 3.75 μL、P3000 5 μL、DNA 2.5 μg 進 行 pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，共同孵育5 h后將培養(yǎng)基換為含1%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染結合流式細胞術檢測各實驗組中細胞凋亡情況。具體步驟為：將細胞培養(yǎng)液吸至EP管中，PBS洗滌細胞一次，加入適量0.25%胰酶消化液消化細胞，室溫孵育1 min；加入收集的細胞培養(yǎng)液，把細胞輕輕吹打下來，轉(zhuǎn)移至EP管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)；取10萬個重懸細胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入Annexin V-FITC結合液195 μL重懸細胞；加入Annexin V-FITC溶液5 μL混勻，再加入PI溶液10 μL混勻；室溫避光孵育20 min，置于冰浴中，流式細胞儀檢測各組細胞熒光值。

2.6 Western blot檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒對細胞內(nèi)Bax、Bcl-2蛋白表達量的影響

實驗分組同“2.4”項。按照“2.5”項中的實驗方法進行分化后SH-SY5Y細胞鋪板和pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)48 h后，提取細胞內(nèi)總蛋白，Western blot檢測各實驗組中Bax、Bcl-2蛋白水平變化。具體步驟為：PBS洗滌細胞3次后置于冰上，每孔中加入RIPA細胞裂解液（按1∶100加入蛋白酶、磷酸酶抑制劑混合液）100 μL；使用細胞刮刀將細胞刮下并轉(zhuǎn)移至EP管中，置于冰上保存；使用渦旋儀充分振蕩裂解，每3 min 1次，共30 min；置于高速冷凍離心機中，4℃、12 000 r/min離心10 min收集上清液即為細胞內(nèi)蛋白溶液。制樣后進行SDS-PAGE電泳，使用半干法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，3%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗滌3次，每次10 min；一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌5次，每次5 min；二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌5次，每次5 min，ECL顯色成像并拍照。

2.7 JC-1探針檢測抗氧化劑Trolox及轉(zhuǎn)染pc DNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒對分化后SH-SY5Y細胞線粒體膜電位的影響

實驗分為空白對照組、pcDNA3.1（+）對照組、pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP+Trolox轉(zhuǎn)染后給藥干預組。按照“2.5”項下方法進行細胞鋪板和突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并在換液時使用終濃度為10 μmol/L的抗氧化劑Trolox進行給藥干預。細胞培養(yǎng)48 h后，JC-1探針檢測各實驗組中細胞內(nèi)線粒體膜電位水平變化情況。具體步驟為：取適量JC-1（200×）探針，按每50 μL 探針加入超純水8 mL的比例進行稀釋，劇烈渦旋使之混勻，再加入JC-1染色緩沖液（5×）2 mL充分混勻；吸去細胞培養(yǎng)液，使用PBS洗滌1次，每孔加入細胞培養(yǎng)基1 mL，再加入JC-1染色工作液1 mL，充分混勻，于37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min；吸去JC-1染色工作液，使用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次，每孔加入無血清培養(yǎng)基2 mL，使用倒置熒光顯微鏡進行觀察拍照。

2.8 Hoechst/PI雙染檢測抗氧化劑Trolox對轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒的分化后SH-SY5Y細胞凋亡情況的干預作用

實驗分組同“2.7”項。按照“2.5”項下方法進行細胞鋪板和突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并在換液時使用終濃度為10 μmol/L抗氧化劑Trolox進行給藥干預。細胞培養(yǎng)48 h后，PI/Hoechst雙染進一步檢測各實驗組中細胞凋亡情況。具體步驟為：棄去6孔板中培養(yǎng)基，使用PBS洗滌細胞2次，每孔加入含有終濃度為7 mmol/L Hoechst 33342的DMEM高糖培養(yǎng)基1 000 μL于37℃培養(yǎng)箱中孵育25 min；PBS洗滌細胞2次，每孔加入含有終濃度為2 mmol/L PI的DMEM高糖培養(yǎng)基1 000 μL，室溫下避光孵育15 min；染色完成后，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.9 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進行處理，各項指標以xˉ±s表示，來源于至少3次獨立實驗，以One-way ANOVA檢驗進行組間比較，P＜0.05時表明差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒的構建和鑒定

構建pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒，采用EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳驗證質(zhì)粒正確性。結果如圖1所示，條帶2中出現(xiàn)大小約為650 bp（NDUFS7突變基因條帶）和5 400 bp的兩個條帶，說明質(zhì)粒構建基本正確。進一步測序驗證，結果與預期構建的序列完全一致，表明已成功構建pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒。

Figure 1 Plasmid profile(A)and the agarose gel electrophoresis of enzyme digested plasmids(B)Line M:Marker;Line 1:pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP;Line 2:pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP digested by EcoR I and Xba I

3.2 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒對神經(jīng)細胞活力的影響

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒48 h后，MTT法檢測各實驗組神經(jīng)細胞活力。結果如圖2所示，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）實驗組相比，轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒實驗組細胞活力顯著降低，說明轉(zhuǎn)染NDUFS7突變質(zhì)粒會導致分化后SH-SY5Y細胞活力下降。

3.3 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染結合流式細胞術檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒對細胞凋亡水平的影響

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒48 h后，采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染結合流式細胞術檢測各實驗組細胞凋亡水平的變化。結果如圖3所示，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）實驗組相比，轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒實驗組神經(jīng)細胞凋亡比例顯著上升，說明轉(zhuǎn)染NDUFS7基因突變質(zhì)粒能夠?qū)е露喟桶纺苌窠?jīng)細胞的凋亡。

Figure 2 Cell viability after transfection with pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP mutant plasmid in differentiated SH-SY5Y cells was analyzed by the MTT assay(-x±s,n=10)

3.4 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒對神經(jīng)細胞內(nèi)Bax、Bcl-2蛋白表達量的影響

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒48 h后，采用Western blot檢測各實驗組細胞內(nèi)Bax、Bcl-2表達量的變化。結果如圖4所示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒后，分化后SH-SY5Y細胞中促凋亡蛋白Bax表達量和抑凋亡蛋白Bcl-2表達量的比值顯著上升，說明轉(zhuǎn)染NDUFS7基因突變質(zhì)粒后可以通過誘導多巴胺能神經(jīng)細胞中凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2的改變，對多巴胺能神經(jīng)細胞的凋亡起到促進作用。

Figure 3 The cell apoptosis level after transfection with pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP mutant plasmid in differentiated SH-SY5Y cells for 48 h(-x±s,n=3)A:Analysis of the proportion of apoptotic cells in differentiated SH-SY5Y cells by flow cytometry;B:Quantification of apoptotic cell proportion

Figure 4 Effects of transfection with pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP mutant plasmid on the levels of Bax and Bcl-2 in differentiated SH-SY5Y cells(-x±s,n=3)A:Detection of Bax and Bcl-2 by Western blot;B:Quantitative analysis of Bax/Bcl-2

3.5 抗氧化劑Trolox及轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒對分化后SH-SY5Y細胞線粒體膜電位的影響

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒并在換液時使用終濃度為10 μmol/L的Trolox進行給藥干預，孵育48 h后，采用JC-1探針檢測分化后SH-SY5Y細胞內(nèi)線粒體膜電位水平。結果如圖5所示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒后綠色熒光增強，說明細胞內(nèi)線粒體膜電位降低，而抗氧化劑Trolox給藥干預后，出現(xiàn)較強的紅色熒光，說明Trolox可緩解轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒導致的細胞內(nèi)線粒體膜電位異常。結果表明NDUFS7突變質(zhì)粒導致的神經(jīng)細胞異?？杀豢寡趸瘎㏕rolox緩解。

Figure 5 Effects of Trolox and transfection with pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP mutant plasmid on the mitochondrial membrane potential in differentiated SH-SY5Y cells

3.6 抗氧化劑Trolox對轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒的分化后SH-SY5Y細胞凋亡情況的干預作用

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒并在換液時使用Trolox進行給藥干預，孵育48 h后，采用PI/Hoechst雙染法檢測各組細胞凋亡情況并使用熒光顯微鏡觀察進行拍照。結果如圖6所示，與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒后凋亡細胞數(shù)量明顯增多，而使用Trolox給藥干預后凋亡細胞數(shù)量顯著降低，說明抗氧化劑Trolox能夠改善轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒后導致的多巴胺能神經(jīng)細胞凋亡。

4 討論

Figure 6 Effects of Trolox and transfection with pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP mutant plasmid on apoptosis in differentiated SH-SY5Y cells Scar bar:200 μm

多巴胺能神經(jīng)元是以多巴胺作為神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)元，人類大腦中約有40萬個多巴胺能神經(jīng)元。多巴胺能神經(jīng)元參與調(diào)節(jié)機體對環(huán)境的反應，對機體運動能力、認知能力都發(fā)揮著重要作用［16］。多巴胺能神經(jīng)元與大腦學習能力密不可分［17］，而且多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展與多巴胺能神經(jīng)元之間有著密切的聯(lián)系［18-19］，其中帕金森病的主要病理特征即為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷導致的紋狀體多巴胺嚴重缺失［20］。線粒體功能障礙是多巴胺能神經(jīng)元退化凋亡的重要原因之一，與線粒體功能相關的多個蛋白（如LRRK2、ATP13A2等）與帕金森病有著顯著的關聯(lián)［21］。線粒體復合體Ⅰ是線粒體呼吸鏈的關鍵成分之一，復合體Ⅰ中亞基的突變與PD、Leigh綜合征等神經(jīng)退行性疾病有著密切聯(lián)系［22］。例如Leigh綜合征與線粒體復合體Ⅰ中23個基因的突變有關，包括NDUFS1、NDUFS2、NDUFS8等［23］。本課題組前期報道了線蟲中NDUF7基因突變能夠引起多巴胺能神經(jīng)元特異性退化［15］，進一步于本研究中證明了在哺乳動物細胞中NDUFS7（線蟲NDUF7同源）基因突變與多巴胺能神經(jīng)元凋亡之間的聯(lián)系，并且揭示突變型NDUFS7質(zhì)?？赡苁峭ㄟ^誘導神經(jīng)細胞線粒體功能異常進而促進細胞凋亡。

本研究設計并構建pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染分化后SH-SY5Y細胞，進而影響線粒體復合體Ⅰ的正常功能，證明了哺乳動物多巴胺能神經(jīng)細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染NDUFS7基因突變質(zhì)粒后能夠?qū)е录毎蛲?。同時，本研究揭示了抗氧化劑給藥干預后能夠改善轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒導致的神經(jīng)細胞線粒體膜電位異常，從而降低細胞凋亡水平。以上實驗結果說明轉(zhuǎn)染NDUFS7基因突變質(zhì)粒后，通過引起細胞內(nèi)線粒體功能異常導致多巴胺能神經(jīng)元凋亡，證明了突變型NDUFS7質(zhì)粒導致多巴胺能神經(jīng)元凋亡的作用及機制，為與多巴胺能神經(jīng)元退化凋亡相關的疾病和藥物研究提供新的思路和理論依據(jù)。