蔣麗婭，羅 平，鄧少榮，葉 浩，俞 雁，韓 偉*

（1上海交通大學(xué)藥學(xué)院，再生組學(xué)實(shí)驗室，上海200240；2上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，上海 200240）

白介素-33（IL-33）是2003年首次在人高內(nèi)皮小靜脈中發(fā)現(xiàn)的核細(xì)胞因子，屬于IL-1家族成員，表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等細(xì)胞［1］。IL-33受體為IL1RL1基因編碼的ST2，在肥大細(xì)胞、ILC2s和 Tregs上組成型表達(dá)［1-2］。早期發(fā)現(xiàn)IL-33/ST2通路與過敏和炎癥有關(guān)，但近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)IL-33/ST2通路在腫瘤發(fā)展中也有重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者腫瘤組織中的IL-33水平顯著低于正常人［3］，但另有報道稱肝癌患者組織和血清中的IL-33水平顯著增高［4］。然而肝小葉接種過表達(dá)IL-33的Hepa 1-6肝癌細(xì)胞或質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)腫瘤質(zhì)量和數(shù)目均顯著低于對照組，初步顯示IL-33對肝癌可能具有抑制作用［5］。有研究表明肺癌患者血清中IL-33顯著高于正常人血清中的IL-33含量［6］，但是在LLC肺轉(zhuǎn)移模型中，轉(zhuǎn)IL-33基因過表達(dá)的小鼠生存率顯著高于對照組，提示IL-33或許可抑制肺癌生長［7］。Deng等［8］發(fā)現(xiàn)過表達(dá)鋅指蛋白36（tristetraprolin）能降低IL-33水平，從而抑制胃癌生長。另有研究發(fā)現(xiàn)胃癌生長必需的炎癥細(xì)胞因子IL-11刺激腫瘤上皮細(xì)胞，使其產(chǎn)生IL-33，從而激活肥大細(xì)胞，并促進(jìn)胃癌的生長［9］。這個結(jié)果提示IL-33與胃癌的生長有關(guān)，但外源性IL-33對胃癌生長的影響還未見報道。先前研究發(fā)現(xiàn)IL-33在腫瘤中的低表達(dá)是一種與復(fù)發(fā)性前列腺癌和腎透明細(xì)胞癌相關(guān)的免疫生物標(biāo)志物。在mRNA水平上，良性前列腺癌IL-33表達(dá)最多，初發(fā)性腫瘤次之，轉(zhuǎn)移性前列腺癌最少，表明IL-33與疾病發(fā)展進(jìn)程呈負(fù)相關(guān)；同時發(fā)現(xiàn)其與疾病預(yù)后也呈負(fù)相關(guān)，即IL-33表達(dá)越低，前列腺癌預(yù)后越差［10］：這提示IL-33可能抑制前列腺癌發(fā)展。在結(jié)腸癌小鼠模型中，IL-33誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中ST2L＋調(diào)節(jié)T細(xì)胞（ST2L+Treg）的增加或招募CD11b+GR1+、CD11b+F4/80+骨髓細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌生長或肝轉(zhuǎn)移［11-12］。然而，另有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性IL-33對結(jié)腸癌具有抑制作用［13］、阻斷IL-33/ST2通路可顯著促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)展［14］以及ST2缺失導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞中Treg細(xì)胞浸潤增多［15］，表明IL-33/ST2通路能抑制結(jié)腸癌發(fā)展。目前IL-33對于結(jié)腸癌生長的影響仍有爭議，且關(guān)于IL-33給藥時間與給藥時長對于結(jié)腸癌影響的研究也未見報道。

本課題組前期已證明了重組小鼠白介素-33（mIL-33）可顯著激活小鼠體內(nèi)的抗腫瘤免疫系統(tǒng)，并有效抑制腫瘤生長［16］。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探討mIL-33在不同類型腫瘤中的抑瘤作用，為后續(xù)臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑

mIL-33由上海交通大學(xué)藥學(xué)院再生組學(xué)實(shí)驗室構(gòu)建純化得到，純化后的mIL-33蛋白純度大于95%，內(nèi)毒素水平小于 0.1 EU/μg［16］；DPBS（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline）、胎 牛 血 清（FBS）、青霉素鏈霉素雙抗、RPMI 1640和DMEM培養(yǎng)基（北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司）；胰酶（北京索萊寶科技有限公司）；CCK-8試劑盒（上海東仁化學(xué)科技有限公司）。

1.2 儀器

L500臺式低速自動平衡離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；TS100倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）。

1.3 細(xì)胞株和動物

Hepa1-6小鼠肝癌細(xì)胞和RM-1小鼠前列腺癌細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫；MFC小鼠胃癌細(xì)胞、LLC小鼠肺癌細(xì)胞和CT26小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞來源于美國菌種保藏中心。

BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠來自于上海杰思捷實(shí)驗動物有限公司（合格證號：SCXK（滬）2018-0004），采用6～8周齡的雄性小鼠，并得到上海交通大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)

本實(shí)驗所使用的腫瘤細(xì)胞均貼壁生長。其中Hepa1-6細(xì)胞和LLC細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；RM-1細(xì)胞、MFC細(xì)胞和CT26細(xì)胞用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)方法同文獻(xiàn)［17］一致。

2.2 腫瘤模型的構(gòu)建

在皮下荷瘤模型中，所有腫瘤細(xì)胞均接種于小鼠的右側(cè)腋下皮下，其中Hepa1-6細(xì)胞（4×106個）、LLC細(xì)胞（4×106個）或RM-1細(xì)胞（2×106個）分別接種于C57BL/6J小鼠皮下；MFC細(xì)胞（4×106個）和CT26結(jié)腸癌細(xì)胞（1×106個）分別接種于BALB/c小鼠皮下。待腫瘤生長至30 mm3大小左右，將小鼠隨機(jī)分成4組。從腫瘤可見起，每隔1天使用游標(biāo)卡尺測量一次小鼠腫瘤的長度（L）和寬度（W），使用小鼠腫瘤體積計算公式V=（L×W2）/2計算腫瘤體積，并在檢測終點(diǎn)采用頸椎脫臼法處死小鼠后，剝?nèi)∧[瘤組織稱重。

2.3 給藥方法

mIL-33用DPBS稀釋，待腫瘤生長至30 mm3左右（即腫瘤細(xì)胞接種后第5天）開始皮下給藥，每天1次。注射DPBS為對照組。

2.4 mIL-33的體外藥效實(shí)驗

待Hepa1-6、LLC、MFC與RM-1細(xì)胞生長至對數(shù)期后，消化細(xì)胞，用5%FBS的培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至每毫升2.5×104個。每孔100 μL，接種于96孔板中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)上清液。分別加入含0、0.012、0.037、0.11、0.33、1、3 μg/mL質(zhì)量濃度mIL-33的5%FBS培養(yǎng)基100 μL。每個梯度3～5個復(fù)孔。置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，按照CCK-8試劑盒說明書進(jìn)行檢測。在酶標(biāo)儀上，以450 nm為主波長，655 nm為參比波長讀數(shù)。計算公式：細(xì)胞存活率（%）=［（試驗孔吸收度-空白孔吸收度）/（對照孔吸收度-空白孔吸收度）］×100。

2.5 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié) 果

3.1 mIL-33對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠模型中腫瘤生長的抑制作用

在Hepa1-6肝癌皮下荷瘤小鼠模型中，mIL-33給藥組（10，30和90 μg/kg）腫瘤體積均極顯著小于溶劑對照（DPBS）組；且給藥組中，90 μg/kg組的腫瘤體積也分別顯著小于10 μg/kg組和30 μg/kg組（圖1）。這些結(jié)果表明，mIL-33可顯著抑制Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠模型中腫瘤的生長，且隨著劑量增高，腫瘤生長呈逐漸降低的趨勢。

Figure 1 Inhibitory effect of mIL-33 on tumor growth in Hepa1-6 subcutaneous tumor model in C57BL/6 mice(-x±sx,n=6)Dulbecco's phosphate buffered saline(DPBS)group was the solvent control group

3.2 mIL-33對LLC肺癌荷瘤小鼠模型中腫瘤生長的影響

在LLC肺癌皮下荷瘤小鼠模型中，mIL-33給藥組（10，30和90 μg/kg）腫瘤體積和質(zhì)量均顯著小于DPBS組（圖2）。且給藥組中，30 μg/kg組的腫瘤體積和質(zhì)量均顯著高于90 μg/kg組，但均顯著低于10 μg/kg組（圖2）。這些結(jié)果表明，mIL-33顯著抑制LLC肺癌荷瘤小鼠模型中腫瘤的生長，且隨著劑量的增高，腫瘤生長呈顯著降低的趨勢。

Figure 2 Inhibitory effect of mIL-33 on tumor volume（A）and tumor weight（B）in LLC subcutan-eous tumor model in C57BL/6 mice.Mice were sacrificed on day 21 after tumor inoculation，and tumors were dissected and weighed for comparison(x± sx,n=8-10)

3.3 mIL-33對MFC胃癌荷瘤小鼠模型中腫瘤生長的抑制作用

在MFC胃癌皮下荷瘤小鼠模型中，mIL-33給藥組（10，30和 90 μg/kg）腫瘤體積均顯著小于DPBS組（圖3）。在給藥組中，10、30和90 μg/kg組小鼠腫瘤體積在治療后第5天開始變小，而溶劑對照組腫瘤體積呈增加趨勢（圖3）。上述結(jié)果表明，mIL-33顯著抑制MFC胃癌荷瘤小鼠模型中腫瘤的生長，且在較低的給藥劑量（10 μg/kg）就具有較好的抑制作用。

3.4 mIL-33對RM-1前列腺癌荷瘤小鼠模型中腫瘤生長的影響

Figure 3 Inhibitory effect of mIL-33 on tumor growth in MFC subcutaneous tumor model in BALB/c mice(-x±sx,n=9)

在RM-1前列腺癌皮下荷瘤小鼠模型中，mIL-33給藥組（90 μg/kg）腫瘤體積和質(zhì)量均顯著小于DPBS組與 mIL-33給藥組（10，30 μg/kg）。然而，DPBS組和mIL-33給藥組（10，30 μg/kg）之間的腫瘤體積和質(zhì)量均無顯著性差異（圖4），表明mIL-33顯著抑制RM-1前列腺癌荷瘤小鼠模型中腫瘤的生長，但可能需要較高的劑量（90 μg/kg）才能發(fā)揮抑瘤作用。

3.5 等劑量mIL-33在不同給藥時長下對CT26結(jié)腸癌荷瘤小鼠模型中腫瘤生長的影響

在CT26結(jié)腸癌皮下荷瘤小鼠模型中，mIL-33給藥組均于腫瘤細(xì)胞接種后第5天（d 5）開始皮下注射 360 μg/kg mIL-33，給藥時長分別為3 d（d 5-d 7）、6 d（d 5-d 10）和9 d（d 5-d 13），每天 1次。從圖5可知，mIL-33給藥組（給藥3 d、6 d）的腫瘤體積和質(zhì)量分別顯著小于DPBS組，但均分別顯著高于mIL-33給藥組（給藥9 d）。且給藥組中，給藥3 d組和給藥6 d組的腫瘤體積和質(zhì)量均無顯著性差異（圖5）。實(shí)驗結(jié)果表明mIL-33可顯著抑制CT26結(jié)腸癌荷瘤小鼠模型中腫瘤的生長，mIL-33給藥3 d和給藥6 d對于腫瘤抑制效果無顯著差異，但延長給藥至9 d時對腫瘤的抑制作用則顯著增加。進(jìn)一步提示mIL-33能較快地能激活抗腫瘤免疫應(yīng)答，但其作用強(qiáng)度可能具有時效關(guān)系，即持續(xù)刺激腫瘤免疫一定時間后，其抗腫瘤應(yīng)答能顯著增強(qiáng)。

3.6 等劑量mIL-33在不同給藥時期下對CT26結(jié)腸癌荷瘤小鼠模型中腫瘤生長的影響

在CT26皮下荷瘤模型中，mIL-33給藥組分別于腫瘤細(xì)胞接種后第5天（d 5）、第10天（d 10）和第15天（d 15）開始皮下注射90 μg/kg mIL-33，每組給藥時長均為9 d（d 5-d 13、d 10-d 18和d 15-d 23），每天1次。mIL-33給藥組（d 10-d 18）腫瘤體積顯著小于DPBS組，但顯著高于mIL-33給藥組（d 5-d 13）（圖6）。且給藥組中，d 15-d 23組在給藥后腫瘤生長迅速減緩，并于第21天開始腫瘤生長趨勢與d 5-d 13組基本一致，提示這兩種給藥方案對腫瘤生長的最終影響較為一致（圖6）。此外，d 15-d 23組與d 10-d 18組的腫瘤體積無顯著性差異，但有降低的趨勢（圖6）。這些結(jié)果表明mIL-33抑制CT26結(jié)腸癌荷瘤小鼠模型中腫瘤生長的作用與起始給藥時間有一定關(guān)聯(lián)，似乎在腫瘤發(fā)展較“早期”（d 5）與較“后期”（d 15）給藥mIL-33能有效且持續(xù)地激活抗腫瘤免疫應(yīng)答，而在腫瘤發(fā)展“中期”給藥mIL-33不能有效地增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫（尤其在d 10-d 15期間）。本實(shí)驗室先前研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在腫瘤接種2周時的增殖能力和分泌IFN γ的量達(dá)到峰值［18］。因此，此階段機(jī)體內(nèi)具有較強(qiáng)的抗腫瘤免疫應(yīng)答，額外給予mIL-33可能難以起到增效的作用。

3.7 mIL-33在體外對Hepa1-6、LLC、MFC與RM-1細(xì)胞增殖的影響

前期研究了外源性mIL-33在小鼠體內(nèi)對腫瘤生長的影響，但其在體外是否直接對腫瘤細(xì)胞造成殺傷有待進(jìn)一步研究。如圖7所示，與對照組相比，mIL-33在不同質(zhì)量濃度梯度下對Hepa1-6、LLC、MFC和RM-1細(xì)胞存活率均無顯著影響，且這些細(xì)胞的存活率隨著mIL-33質(zhì)量濃度的增加也無顯著變化。因此，mIL-33在體外不能直接抑制Hepa1-6、LLC、MFC與RM-1細(xì)胞的生長，提示mIL-33可能通過免疫細(xì)胞發(fā)揮抑制腫瘤生長作用。

4 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)外源性mIL-33顯著抑制小鼠肝癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌和前列腺癌的生長，但在不同的腫瘤模型中，mIL-33的量效關(guān)系有一定差別。另外，本實(shí)驗還發(fā)現(xiàn)外源性mIL-33不能在體外抑制Hepa1-6肝癌細(xì)胞、LLC肺癌細(xì)胞、MFC胃癌細(xì)胞和RM-1前列腺癌細(xì)胞的生長，提示其不能直接對腫瘤細(xì)胞造成殺傷，而可能通過體內(nèi)免疫細(xì)胞或分子通路發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究發(fā)現(xiàn)外源性注射mIL-33也能有效地抑制Hepa1-6肝癌、LLC肺癌和CT26結(jié)腸癌的生長，與文獻(xiàn)［5，7，15］報道一致。然而另有報道稱阻斷mIL-33可抑制免疫缺陷小鼠體內(nèi)非小細(xì)胞肺癌的生長［19］、體內(nèi)過表達(dá)IL-33促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的生長和轉(zhuǎn)移［20］、IL-33可通過改變腫瘤內(nèi)環(huán)境來促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生與肝轉(zhuǎn)移［12，21］。在MFC胃癌小鼠模型中，鋅指蛋白36通過抑制IL-33途徑來限制胃癌的發(fā)展［8］，且腫瘤來源的IL-33維持肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞依賴性信號級聯(lián)，是胃癌生長所必需的重要因子［9］。與此相反，本研究發(fā)現(xiàn)外源性注射mIL-33顯著抑制小鼠體內(nèi)MFC胃癌的生長，提示IL-33可能是一個頗有前景的治療胃癌新靶點(diǎn)。

Figure 7 Effect of different concentrations of mIL-33 on the proliferation of Hepa1-6 liver cancer cells（A，n=5），LLC lung cancer cells（B，n=4），MFC gastric cancer cells（C，n=5）and RM-1 prostate cancer cells（D，n=5）in vitro

目前關(guān)于IL-33對腫瘤生長的作用仍存在爭議，促腫瘤生長和抑制腫瘤生長均有相關(guān)報道，其中可能涉及多種因素影響。有研究發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞來源的IL-33對腫瘤的生長具有完全不同的作用。腫瘤上皮細(xì)胞表達(dá)的IL-33會增加其免疫原性，通過CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞促進(jìn)1型抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而抑制腫瘤生長；而腫瘤基質(zhì)和血清中表達(dá)的IL-33能通過Treg細(xì)胞和骨髓來源的抑制細(xì)胞來增強(qiáng)免疫抑制，從而促進(jìn)腫瘤生長［22］。也有報道稱IL-33的不同作用取決于不同免疫細(xì)胞中的IL-33/ST2信號傳導(dǎo)。因為IL-33既可以激活促進(jìn)腫瘤生長的細(xì)胞，如肥大細(xì)胞、Treg細(xì)胞等，又可以激活抑制腫瘤發(fā)展的細(xì)胞，如NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等，最終促進(jìn)或者抑制腫瘤生長取決于哪種作用更強(qiáng)［23］。從本研究來看，IL-33對腫瘤的作用強(qiáng)度和腫瘤類型、給藥劑量以及給藥時期密切相關(guān)，不同情況下可能具有完全不一樣的效果。因此，推測不同研究IL-33的方式（過表達(dá)IL-33、敲除IL-33或外源注射IL-33蛋白）、腫瘤模型以及給藥時期可能會對IL-33在腫瘤中扮演角色的判斷造成較大干擾，后續(xù)的研究應(yīng)充分考慮這些因素所帶來的影響。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)外源性mIL-33顯著抑制小鼠肝癌、肺癌、胃癌、前列腺癌和結(jié)腸癌的生長，較詳細(xì)地研究了相關(guān)的量效或時效關(guān)系。盡管IL-33在這些腫瘤中的抗腫瘤作用機(jī)制尚未完全揭示，但本研究的結(jié)果充分表明IL-33在治療各類腫瘤中具有良好的應(yīng)用前景。