邱建清，李世洋，葉倩文，林少玲，曾紹校，胡嘉淼

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建省特種淀粉品質(zhì)科學(xué)與加工技術(shù)重點實驗室，福建 福州 350002）

自然界細(xì)菌種類繁多，很多細(xì)菌如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等因含有內(nèi)毒素，成為引發(fā)人類疾病的致病菌[1]。人類的歷史是一部與疾病的斗爭史，細(xì)菌感染曾是人類生存面臨的第一大挑戰(zhàn)[2]。20世紀(jì)20年代，英國科學(xué)家Fleming等[3]發(fā)現(xiàn)了青霉素。青霉素的應(yīng)用使當(dāng)時的細(xì)菌感染類疾病得到了有效控制，青霉素作為第一代抗生物具有了劃時代的意義。但抗生素在各領(lǐng)域的應(yīng)用甚至濫用導(dǎo)致細(xì)菌開始變異，“超級細(xì)菌”的到來為人類敲醒了警鐘。細(xì)菌耐藥性的發(fā)展和傳播越來越迅速，而抗生素的開發(fā)速度卻嚴(yán)重滯后，如果不尋求新的方法取代抗生素，學(xué)術(shù)界認(rèn)為“后抗生素時代”在不久的將來有可能到來[4]。為此，需要探索更多安全有效的滅菌手段。其中，聲動力技術(shù)是一種新興的滅菌方法，在過去的幾年里，聲動力技術(shù)主要用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域，如抗癌治療或者抗腫瘤治療等方面，且取得了良好的研究成效[5]。聲動力技術(shù)在抑制腫瘤方面的有效應(yīng)用以及其操作簡便、成本低廉、穿透力強且安全無副作用、不產(chǎn)生菌株耐藥性等特性[6]，讓學(xué)者們看到了聲動力技術(shù)在應(yīng)用于食品殺菌領(lǐng)域的希望。

1 聲動力概念

聲動力技術(shù)是在光動力技術(shù)的基礎(chǔ)上建立與發(fā)展起來的，指在超聲波的作用下，通過激活聲敏劑分子產(chǎn)生一系列殺菌物質(zhì)，從而達(dá)到滅菌效果的方法[7]。1989年，日本學(xué)者Umemura等[8]首次提出，采用超聲波激活從血紅蛋白中提取的有機聲敏劑血卟啉聯(lián)合治療腫瘤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血卟啉在聲場中可產(chǎn)生細(xì)胞毒性，Umemura等[9]將這種治療方法命名為聲動力技術(shù)。1990年，Yumita等[10]研究了超聲與血卟啉聯(lián)合對腫瘤細(xì)胞的抑制作用，發(fā)現(xiàn)聲動力技術(shù)對腫瘤的生長抑制率可達(dá)到74%，而單純超聲的抑制率僅為15%。超聲與血卟啉聯(lián)合對抑制腫瘤細(xì)胞生長具有協(xié)同增效作用。

鑒于聲動力技術(shù)在抑制腫瘤細(xì)胞方面取得的卓越成效，有部分學(xué)者開始將目光轉(zhuǎn)向聲動力抑制微生物生長方面的研究。1994年，Pitt等[11]發(fā)現(xiàn)67 kHz的超聲與慶大霉素聯(lián)用增強了對銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等致病菌的滅活作用。在此基礎(chǔ)上，眾多研究人員開始對其協(xié)同作用進(jìn)行了進(jìn)一步的探索。2009年，Ma Xiaopeng等[12]根據(jù)光動力技術(shù)在各領(lǐng)域的應(yīng)用情況，推測聲動力不但可以治療腫瘤細(xì)胞，或許也可以對微生物產(chǎn)生殺傷作用，并推測其將以穿透力強的獨特優(yōu)勢以及產(chǎn)生類似于光的自由基機制，成為一種極具前景的新型抗菌策略。2011年，Liu Bin等[13]研究發(fā)現(xiàn)在超聲波和環(huán)丙沙星與左旋氟沙作用下，大腸埃希氏菌的活性顯著降低。

在此前的研究報道中，使用的聲敏劑大多依舊為慶大霉素、環(huán)丙沙星、左旋氟沙等抗生素，但抗生素的毒副作用過大且極易引起細(xì)菌耐藥性。因此學(xué)者們開始尋求能夠替代抗生素的更為安全有效的聲敏劑進(jìn)行聲動力學(xué)滅菌治療。

2013年，Nakonechny等[14]通過實驗證明以玫瑰紅（rose bengal，RB）作為聲敏劑的聲動力處理可以有效根除革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性大腸桿菌。2015年，Wang Xinna等[15-16]探究了姜黃素作為聲敏劑對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌的聲動力效果。根據(jù)菌落計數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素以劑量依賴式對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出顯著的聲動力殺菌活性，且處理后細(xì)菌的DNA未發(fā)現(xiàn)明顯變化。同年，Wang Xinna等[17]將竹紅菌素B作為聲敏劑對表皮葡萄球菌的聲動力學(xué)作用進(jìn)行了考察，研究發(fā)現(xiàn)竹紅菌素B可以在超聲作用下通過增加細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平來破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，從而達(dá)到殺滅細(xì)菌的目的。2016年，Xu Chuanshan等[18]研究了二氫卟吩e6對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的聲動力學(xué)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過二氫卟吩e6介導(dǎo)的聲動力學(xué)作用誘導(dǎo)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌落總數(shù)分別減少了2 個對數(shù)值和7 個對數(shù)值，實驗還觀察到明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。因此Xu Chuanshan等認(rèn)為二氫卟吩e6可能是控制致病菌的極具前景的替代選擇。2018年，Xu Chuanshan等[19]通過姜黃素介導(dǎo)的聲動力治療實驗再次證實了聲動力技術(shù)具有顯著的微生物滅活作用。與革蘭氏陽性菌相比，革蘭氏陰性菌由于其特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致聲動力技術(shù)對其抗殺傷力更強。Costley等[20]于2017年通過偶聯(lián)RB與抗菌肽C(KLAKLAK)2，制備了一種RB-C(KLAKLAK)2聲敏復(fù)合物用于靶向聲動力治療，發(fā)現(xiàn)由該復(fù)合物介導(dǎo)的聲動力對革蘭氏陰性菌表現(xiàn)出更好的滅菌效果。

2019年，Bhavya等[21]以姜黃素作為聲敏劑，將感染大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的橙汁進(jìn)行聲動力殺菌，研究發(fā)現(xiàn)殺菌后橙汁中的大腸桿菌菌落總數(shù)降低了3.0 個數(shù)量級，但金黃色葡萄球菌對聲動力技術(shù)的敏感性較低，其數(shù)量僅降低0.8 個數(shù)量級。總體而言，菌落總數(shù)的減少有效延長了橙汁的保質(zhì)期。值得一提的是，聲動力技術(shù)在殺菌的同時，其產(chǎn)生的超聲空化作用還可以對果汁、牛奶、果醬及色拉油等被加工物料起到一定的均質(zhì)作用。

2 聲動力技術(shù)殺菌作用機理

關(guān)于聲動力技術(shù)殺菌的作用機理至今依舊是許多科研人員的研究熱點，對其確切機理仍尚存爭議。但可以肯定的是，聲動力技術(shù)能夠發(fā)揮其滅菌作用與超聲波、聲敏劑和氧氣三者密不可分。

目前普遍認(rèn)可的聲動力殺菌機制為超聲的空化作用與聲敏劑激活釋放氧自由基。與超聲波殺菌相似，聲動力技術(shù)利用超聲波在液體中傳播，與液體發(fā)生劇烈的相互作用，使液體內(nèi)產(chǎn)生壓力起伏，導(dǎo)致出現(xiàn)負(fù)壓現(xiàn)象。在負(fù)壓區(qū)域，液體中的結(jié)構(gòu)缺陷即空化核會逐漸長大，形成肉眼可見的微米級氣泡[22]。微小氣泡在低頻聲場稀疏相和壓縮相的交互作用下[23]，發(fā)生交替壓縮和膨脹直至微泡塌陷，在微泡塌陷破裂的瞬間，會在極小的區(qū)域內(nèi)釋放能量。有研究表明在超聲的作用下，聲空化溫度可以達(dá)到5 000 K左右，并產(chǎn)生約250 MPa的壓力[24]。超聲波產(chǎn)生的空化作用一方面作用于細(xì)菌，改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)聲敏劑進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用[25-26]。另一方面，空化作用產(chǎn)生的強沖擊波、局部高溫和高液體剪切力作用于聲敏劑[27-28]，刺激聲敏劑活化熱解產(chǎn)生自由基。這些自由基與氧發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞毒性[29]，但只有富集聲敏劑的區(qū)域才會產(chǎn)生強殺傷力[30]。而從能量角度來看，聲動力技術(shù)是一個能量吸收與釋放的電子躍遷過程。超聲作用下，聲敏劑吸收能量由基態(tài)轉(zhuǎn)化為激發(fā)態(tài)，當(dāng)躍遷電子回歸基態(tài)時，釋放大量能量并作用于周圍的氧分子，產(chǎn)生單線態(tài)氧以及羥自由基等一系列ROS物質(zhì)（圖1）。超聲波激活聲敏劑產(chǎn)生ROS的假設(shè)現(xiàn)已通過電子自旋共振檢測技術(shù)所證實[31]。聲動力作用過程中產(chǎn)生的單線態(tài)氧與自由基等ROS物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)非?；顫?，能夠與目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、氨基酸、核酸等生物大分子發(fā)生作用，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或死亡[32-33]。

圖1 聲動力技術(shù)殺菌機理Fig. 1 Bactericidal mechanism of sonodynamic sterilization technology

3 聲敏劑概述

聲敏劑是指一種選擇性作用于目標(biāo)細(xì)胞的化學(xué)物質(zhì)，其在一定頻率與強度的超聲波作用下可產(chǎn)生聲動力效應(yīng)破壞目標(biāo)細(xì)胞。聲敏劑是聲動力技術(shù)的核心要素，聲敏劑的研發(fā)也是聲動力研究的核心問題[34]。

基于聲動力技術(shù)的作用機制，理想的聲敏劑應(yīng)該符合以下特點：1）對正常細(xì)胞不會產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性，本身安全、有效、無毒，且副作用少；2）對超聲波敏感且具有穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)[35]；3）具有特異富集特性，能夠作用于目標(biāo)細(xì)胞，且僅在暴露于超聲刺激后才具有生物活性；4）在超聲刺激下能產(chǎn)生引起細(xì)胞損傷的自由基中間體，這些物質(zhì)具有熱不穩(wěn)定分子，能夠通過塌陷的空化氣泡內(nèi)部或者緊鄰的熱解氣化而被熱激活（如偶氮化合物），亦或是具有表面活性，能夠聚集在空化氣泡的氣液相界面的物質(zhì)[29]。通常，大多數(shù)光敏化合物可用作超聲敏化劑，目前廣泛應(yīng)用的聲敏劑主要有以下幾類。

3.1 卟啉類化合物

卟啉是一類由4 個吡咯類亞基的α-碳原子通過次甲基橋（＝CH—）互聯(lián)而形成的大分子雜環(huán)化合物（圖2），其母體化合物為卟吩，卟吩結(jié)構(gòu)中C1～C8上的H被其他基團取代后的衍生物即被稱為卟啉[36-37]。卟啉類聲敏劑根據(jù)來源不同，可以分為從血液中提取的血卟啉及其衍生物，以及從綠色植物與蠶糞中提取的葉綠素類化合物。

圖2 卟啉結(jié)構(gòu)式Fig. 2 Structural formula of porphyrin

3.1.1 血卟啉及其衍生物

血卟啉是一種紅色卟啉類天然產(chǎn)物，以血卟啉為基礎(chǔ)，科學(xué)家們相繼研發(fā)出了一系列性能更加優(yōu)異的血卟啉衍生物，主要包括原卟啉IX[38]、血卟啉單甲醚（hematoporphyrin monomethyl ether，HMME）、ATX-70[39]等。相對于其他血卟啉衍生物，血卟啉單甲醚具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對目標(biāo)細(xì)胞選擇性高，對正常組織無毒或低毒[40]，且能夠快速從組織清除等優(yōu)異特質(zhì)，是目前血卟啉衍生物介導(dǎo)的聲動力抗菌技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的聲敏劑。2014年，莊德舒等[41]使用HMME聯(lián)合1 MHz超聲對金黃色葡萄球菌進(jìn)行聲動力殺菌發(fā)現(xiàn)，超過95%的細(xì)菌菌落被有效殺死，而無HMME組的殺菌率僅為38%，即在一定濃度范圍內(nèi)，單純使用血卟啉單甲醚不會明顯影響金黃色葡萄球菌的存活率，在血卟啉單甲醚介導(dǎo)的聲動力技術(shù)中，隨著HMME的濃度提高與超聲強度的增強，金黃色葡萄球菌的存活率逐漸降低，這意味著聲動力技術(shù)有可能成為一項應(yīng)用于食品殺菌領(lǐng)域的新技術(shù)。

3.1.2 葉綠素類

葉綠素是一種親脂性鎂卟啉色素，具有良好的生物相容性。主要由卟啉環(huán)和脂肪烴側(cè)鏈兩部分組成，其中在卟啉環(huán)內(nèi)還含有一個鎂離子。葉綠素主要分布于植物葉綠體的類囊體膜中，通常可以從綠色植物中直接提取葉綠素或者從蠶沙中分離得到。相較于葉綠素，葉綠素衍生物在聲動力技術(shù)中表現(xiàn)出更優(yōu)異的細(xì)菌滅活效果。在聲動力抗菌技術(shù)中應(yīng)用較多的葉綠素衍生物為葉綠酸-金屬絡(luò)合物（chlorophyll-metal，Chl-M）（Chl-Fe、Chl-Cu、Chl-Mg、Chl-Zn）和二氫卟吩e6。

葉綠素在酸性條件下不穩(wěn)定，卟啉環(huán)中的鎂離子容易被氫離子置換，形成去鎂葉綠素，即葉綠酸。將葉綠酸與其他金屬離子結(jié)合，將形成結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定的化合物——Chl-M。葉綠酸-金屬絡(luò)合物水溶性好且對生物分子具有強親和力。2012年，Jin Xudong等[42]研究發(fā)現(xiàn)，Chl-M聯(lián)合超聲能夠明顯提高ROS的產(chǎn)率，且Chl-Fe的作用效果最為明顯。通過進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，ROS種類主要為單線態(tài)氧和羥自由基。ROS是破壞目標(biāo)細(xì)胞的關(guān)鍵因素，ROS的產(chǎn)生表明Chl-M具有作為聲敏劑的潛能。

二氫卟吩e6是從蠶沙粗品中提取分離的一種含二氫卟吩的單體四吡咯化合物，二氫卟吩e6屬于葉綠素a的降解產(chǎn)物[43]，對正常組織無毒。Xu Chuanshan等[18]考察了二氫卟吩e6作為聲敏劑的聲動力技術(shù)的滅菌效果，實驗結(jié)果證明單獨使用超聲波或者二氫卟吩e6對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長均無明顯影響，但二氫卟吩e6聯(lián)合超聲波以聲敏劑濃度依賴的方式有效抑制了微生物的活性。

3.2 黃原酮類

一些染料類化合物也被應(yīng)用于聲動力技術(shù)。黃原酮類是一系列著色劑的統(tǒng)稱，其中包括姜黃素[44]、RB、竹紅菌乙素[45]等。RB是一種熒光染料，曾被用作食品添加劑，但RB會在一定程度上加重肝臟負(fù)擔(dān)[46]。竹紅菌乙素則是從中草藥竹紅菌中重結(jié)晶后用堿催化脫水形成的化合物，但其對革蘭氏陰性菌的作用較不明顯。故從安全性以及滅菌能力等方面考慮，天然植物提取成分姜黃素是黃原酮類中最具應(yīng)用前景的聲敏劑。姜黃素主要來源于郁金、姜黃等姜科植物的塊莖或者根莖，是全球銷量最大的天然食用色素之一。它是世界衛(wèi)生組織以及美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)使用的食品添加劑，也是我國GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中允許添加于食品中的9 種天然色素之一。姜黃素屬于天然成分，相對于化學(xué)合成聲敏劑，姜黃素因其分子多樣性與成分復(fù)雜性，對人體無毒無害、環(huán)?？山到猓瑫r兼具抗微生物與抗氧化、抗病毒等功效；此外，基于其有多種信號傳導(dǎo)途徑而觸發(fā)的特異性生物活性與高選擇性[47-48]，引起了科學(xué)家們的廣泛關(guān)注。Wang Xinna[15-16]以及Xu Chuanshan[19]等曾先后研究了姜黃素的滅菌效果，并證實姜黃素介導(dǎo)的聲動力技術(shù)具有顯著的聲動力殺菌效果。

4 聲敏劑改造

傳統(tǒng)的聲敏劑大多為有機聲敏劑，聲敏劑內(nèi)存在的疏水相互作用力導(dǎo)致聲敏劑出現(xiàn)水溶性低、靶向性與穩(wěn)定性差、利用率低等問題，嚴(yán)重限制了聲動力技術(shù)的應(yīng)用研究。為了改善聲敏劑的水溶性與穩(wěn)定性，提高聲敏劑的靶向性，學(xué)者們對聲敏劑進(jìn)行了一系列的改造研究，聲敏劑改造途徑主要包括以下幾種。

4.1 納米化

納米技術(shù)是近年來的熱門研究課題，有研究表明納米聲敏劑不僅結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，易于進(jìn)行表面修飾，還具有主動靶向等特性[49-51]。目前聲敏劑的納米改造主要包括兩方面，一方面是在不改變聲敏劑理化性質(zhì)的情況下，通過直接改變聲敏粒子的粒徑，從而提高聲敏劑在溶劑中的分散度，使其更容易通過細(xì)菌細(xì)胞膜。納米化有效提高了聲敏劑的比表面積，使聲敏劑與微生物的接觸面積顯著增大。目前主要是通過溶液-凝膠法、液相沉淀法等途徑對聲敏劑進(jìn)行納米化改造。其中無機納米二氧化鈦因具備良好的聲敏特性，在聲動力技術(shù)中應(yīng)用廣泛，如利用納米二氧化鈦介導(dǎo)的聲動力進(jìn)行污水處理等[52]；另一方面是通過化學(xué)鍵合或者物理包埋等方式，將傳統(tǒng)聲敏劑與表面具有多種功能基團的親水性納米材料復(fù)合，使聲敏劑的理化性質(zhì)改變，進(jìn)而改善聲敏劑的水溶性與靶向性[53]。Guo Yanyan等[54]利用二氧化硅納米粒子作為載體，將納米二氧化硅表面胺基官能化后，將RB分子共價結(jié)合至其表面。制備得到由RB修飾的二氧化硅納米粒子（圖3），并對其殺菌性能進(jìn)行了研究，實驗表明該納米粒子可使革蘭氏陽性菌金黃色假單胞菌與表皮葡萄球菌均減少近8（lg（CFU/mL）），具有十分顯著的殺菌效果。

圖3 SiO-N-RB納米粒子的設(shè)計原理圖[54]22Fig. 3 Schematic diagram for the design of SiO2-NH2-RB nanoparticles[54]

4.2 聲敏劑-抗菌肽復(fù)合物

抗菌肽是由細(xì)菌、真菌、動植物產(chǎn)生的一類具有抗菌功能的多肽，通常由12～50 個氨基酸組成，其安全性能好且對人體無害[55]。聲敏劑-抗菌肽復(fù)合物提高聲敏劑性能的機理主要在于抗菌肽在氨基酸側(cè)鏈上攜帶的正電荷基團可以對細(xì)菌細(xì)胞與其他細(xì)胞差異性結(jié)合。即抗菌肽所攜帶的正電荷可以與帶負(fù)電荷的細(xì)菌通過靜電作用相互吸引，二者相互作用形成細(xì)胞內(nèi)外電位差，從而破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使聲敏劑更容易進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。此外，抗菌肽不容易引起靶細(xì)胞產(chǎn)生抗性突變，且兼具廣譜抗菌性，可以起到協(xié)同滅菌作用[56-57]。因此聲敏劑與抗菌肽結(jié)合能夠有效提高聲敏劑的靶向性。2017年，Costley等[20]利用陽離子抗菌肽能夠與帶負(fù)電的細(xì)菌特異性結(jié)合的特性，將聲敏劑RB與抗菌肽(KLAKLAK)2通過偶聯(lián)反應(yīng)制備了RB-C(KLAKLAK)2復(fù)合物，并使用該復(fù)合物對銅綠假單胞菌與金黃色葡萄球菌進(jìn)行聲動力滅菌。經(jīng)實驗驗證，相較于單純使用RB進(jìn)行聲動力滅菌，RB-C(KLAKLAK)2復(fù)合物介導(dǎo)的聲動力滅菌對兩種細(xì)菌均具有更為明顯的殺菌效果。為了驗證該聲敏劑優(yōu)先靶向細(xì)菌的能力，Costley等將RB-C(KLAKLAK)2、RB分別與人成纖維細(xì)胞、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌一起孵育，并通過測定其紫外分光光度來觀察靶向效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗菌肽的加入使聲敏劑對細(xì)菌的靶向性得到了明顯提高。ε-聚賴氨酸是一種應(yīng)用較多的抗菌肽類。因為ε-聚賴氨酸是一種富含陽離子的聚合多肽，不僅具有廣譜抗菌性，還能在人體產(chǎn)生人體必需氨基酸——賴氨酸，因此ε-聚賴氨酸被批準(zhǔn)作為一種營養(yǎng)型生物防腐劑添加至食品中?；谄浔砻娓缓年栯x子活性物質(zhì)以及其抗菌性，Soukos等[58]將ε-聚賴氨酸與聲敏劑二氫卟酚e6偶聯(lián)進(jìn)行聲動力滅菌，發(fā)現(xiàn)ε-聚賴氨酸-二氫卟酚e6復(fù)合物的聲動力作用效果比單獨使用聲敏劑進(jìn)行聲動力滅菌體現(xiàn)出更高的細(xì)菌靶向性。此外，Liu Dafeng[59-60]、Zhang Yaxin[61]等通過化學(xué)鍵偶聯(lián)聚賴氨酸的方式制備了寡聚賴氨酸酞菁鋅，實驗發(fā)現(xiàn)聚賴氨酸的加入有效改善了酞菁鋅水溶性差的問題，且隨著聚賴氨酸酞菁鋅濃度的增加，菌體表面的電荷數(shù)增大、菌體壁的損傷程度增加。

4.3 聲敏劑-包合物

聲敏劑-包合物是指將聲敏劑作為客體分子，包合嵌于另一種具備空穴結(jié)構(gòu)的分子中的技術(shù)。常用的包合技術(shù)主要包括飽和水溶液法、研磨法、冷凍干燥法以及噴霧干燥法等。目前應(yīng)用較多的包合材料為β-環(huán)糊精。β-環(huán)糊精是由淀粉生產(chǎn)的環(huán)狀低聚糖，它具有環(huán)狀三維結(jié)構(gòu)，其疏水性內(nèi)腔能夠容納親脂性客體分子，而親水性外殼則確保了其能夠與水性體系相容[62]。Athanassiou等[63]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)甲基-β-環(huán)糊精能有效提高β-內(nèi)酰胺類抗生素對多種革蘭氏陰性菌的釋放效果和抗菌活性。Shlar等[64]分別制備了姜黃素水分散液、姜黃素納米粒子水分散液（curcumin nanoparticles，CNP）與姜黃素-環(huán)糊精水分散液（curcumin-cyclodextrin inclusion complex，CCD）（圖4），發(fā)現(xiàn)環(huán)糊精可以使姜黃素形成穩(wěn)定的水分散體，并在增強姜黃素的溶解性的同時保留姜黃素的活性。Shlar等通過共焦顯微鏡還發(fā)現(xiàn)，相較于姜黃素處理的細(xì)菌，CCD處理的細(xì)菌在處理后幾分鐘內(nèi)即可檢測到較高的熒光強度。并通過熒光顯微鏡進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，姜黃素位于環(huán)糊精的疏水性內(nèi)腔，整個包合物可以直接被細(xì)胞攝取進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)發(fā)揮作用，CCD對微生物的抗菌能力最高。實驗結(jié)果表明環(huán)糊精與姜黃素絡(luò)合促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)姜黃素的傳遞。

圖4 姜黃素水分散體制備后的照片（A）以及環(huán)糊精與客體分子結(jié)合與釋放的可逆過程（B）Fig. 4 Photographs of aqueous curcumin dispersions (A) and reversible process of cyclodextrin binding to and release from guest molecules (B)

4.4 聲敏劑-脂質(zhì)體

聲敏劑-脂質(zhì)體復(fù)合物是指利用薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法、復(fù)乳法等方法將聲敏劑包被于空心脂質(zhì)體內(nèi)得到的一種復(fù)合物。脂質(zhì)體是由一種或多種磷脂雙分子層組成的封閉微型囊泡，其主要組成成分磷脂是一種兩親分子，在磷脂與水分子發(fā)生相互作用時，其極性頭部暴露于水相中，而疏水性尾部則被迫朝向磷脂雙分子層之間，形成囊泡內(nèi)外部親水，磷脂雙分子層內(nèi)疏水的閉合結(jié)構(gòu)[65]。由于囊泡水相與脂質(zhì)并存，故其既可以包埋、遞送水溶性物質(zhì)，也可以遞送脂溶性物質(zhì)[66]。聲敏劑-脂質(zhì)體能夠提高水溶性也正是利用了脂質(zhì)體的兩親性質(zhì)。根據(jù)不同種類磷脂所帶電荷不同，脂質(zhì)體又分為中性脂質(zhì)體、負(fù)電荷脂質(zhì)體、正電荷脂質(zhì)體。細(xì)菌的細(xì)胞膜因含有酸性磷脂成分而帶負(fù)電荷，若使用帶正電荷的聲敏劑脂質(zhì)體復(fù)合物，即可利用靜電作用（正負(fù)電荷相互吸引）實現(xiàn)聲敏劑-脂質(zhì)體復(fù)合物與細(xì)菌的特異性識別。Wang Xiaobing等[67]通過薄膜水合的方法，利用小比例的焦脫鎂葉綠酸與磷脂復(fù)合制備了卟啉-磷脂脂質(zhì)體復(fù)合物，并用該復(fù)合聲敏劑聯(lián)合超聲波對腫瘤進(jìn)行聲動力治療，結(jié)果證實卟啉脂質(zhì)體對腫瘤細(xì)胞實現(xiàn)了有效的靶向性與聲動力學(xué)損傷。據(jù)此可推測相較于傳統(tǒng)聲敏劑，聲敏劑脂質(zhì)體復(fù)合物在聲動力滅菌應(yīng)用中也能取得更加良好的聲動力效果。Dogra等[68]使用新型載體材料聚二乙炔作為聲敏劑載體，將姜黃素包裹在含有脂質(zhì)雙層的聚二乙炔-磷脂納米囊中，制備了姜黃素功能性納米囊（curcumin-functionalized nanovesicles，CFN）。自由懸浮的CFN優(yōu)先與大腸桿菌與金黃色葡萄球菌結(jié)合，并將菌落總數(shù)從5（lg（CFU/mL））降低至不可檢測水平。Pang Xin等[69]通過薄膜分散法，利用經(jīng)過麥芽六糖改性的膽固醇與二硬脂酰磷脂酰甘油制備了智能納米脂質(zhì)體平臺（圖5），用于紫紅素18（purpurin 18，P18）的精確遞送。脂質(zhì)體可以改善水溶性，而麥芽六糖則可以通過細(xì)菌特異性麥芽糊精轉(zhuǎn)運蛋白途徑來特異性識別細(xì)菌，其結(jié)構(gòu)內(nèi)所含的羥基又可與周圍的水分子相互作用形成具有穩(wěn)定和分散粒子作用的水化殼。Pang Xin等利用動態(tài)光散射測定發(fā)現(xiàn)未使用麥芽六糖修飾的P18納米脂質(zhì)體尺寸分布均勻性明顯下降。游離P18在小鼠細(xì)菌感染部位分布較少但在別的正常部位快速分布，而P18麥芽六糖納米脂質(zhì)體在小鼠細(xì)菌感染部位觀察到時間依賴性熒光積累，正常組織中的熒光逐漸減弱。對其進(jìn)行抗菌聲動力治療，發(fā)現(xiàn)P18麥芽六糖納米脂質(zhì)體相比于單純P18組與P18納米脂質(zhì)體組表現(xiàn)出了更加優(yōu)異的殺菌效果。實驗結(jié)果證明麥芽六糖修飾的P18脂質(zhì)體能夠有效提高聲敏劑的靶向性與聲動力技術(shù)的殺菌效果。

圖5 P18-麥芽六糖納米脂質(zhì)體合成示意圖（A）以及P18-麥芽六糖納米脂質(zhì)體介導(dǎo)的聲動力滅菌作用機制示意圖（B）[69]Fig. 5 Synthesis of purpurin 18-maltohexaose nanoliposome (A) and schematic illustration for the mechanism of action ofpurpurin 18-maltohexaose nanoliposomes-mediated antimicrobial sonodynamic sterilization technology (B)[69]

5 超聲波強度與頻率

超聲波是指頻率高于20 kHz，能在周圍環(huán)境中發(fā)生壓縮與膨脹交替的彈性機械波[70]。通常情況下，超聲波的頻率越高，強度越大，產(chǎn)生的能量越多，其聲動力滅菌作用效果也會越明顯，但超聲波頻率增大的同時也會伴隨著超聲傳播的衰減[71]，故在進(jìn)行聲動力滅菌時要注意選擇合適的超聲強度與頻率，以便提高滅菌效率與質(zhì)量，節(jié)約滅菌成本。而超聲波根據(jù)頻率又可以分為低頻超聲與高頻超聲，但由于作用的對象不同，各個領(lǐng)域?qū)Τ暤皖l與高頻的界定標(biāo)準(zhǔn)還比較模糊。低頻超聲可以暫時改變細(xì)胞膜的通透性。同時產(chǎn)生適量的ROS，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生破壞。而高強度超聲則會直接導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生物理破壞，是一種不可逆的非熱力滅活過程[72]。雖然高頻率超聲可以不可逆地破壞細(xì)菌，但同時也會產(chǎn)生大量的ROS，對周圍正常的組織或細(xì)胞造成一定的損傷；因此為了保護正常組織，各領(lǐng)域研究主要還是以使用低頻、低強度的超聲進(jìn)行聲動力滅菌處理。Ninomiya等[73]用超聲強度為8 0 0 W/c m2、超聲頻率為0.5 M H z 與超聲強度為0.4 W/cm2、超聲頻率為1 MHz的兩種超聲波同時處理TiO2，發(fā)現(xiàn)兩種超聲波聯(lián)用產(chǎn)生的活性羥自由基比單一超聲波處理更多，因此通過該實驗也表明了使用不同頻率與強度的超聲波進(jìn)行交替組合超聲，其治療效果會優(yōu)于單一超聲作用。

6 結(jié) 語

綜上所述，現(xiàn)今已有較多關(guān)于聲動力技術(shù)滅活食源性致病菌的基礎(chǔ)理論研究。一些學(xué)者也開始逐步將聲動力技術(shù)應(yīng)用于食品滅菌領(lǐng)域，聲動力技術(shù)穿透力強、靶向性好、滅菌效果佳，今后必定可以在各類食品加工中展現(xiàn)出優(yōu)異的滅菌性能。此外利用聲敏劑的廣譜抗菌性，還可以開發(fā)一系列由聲敏劑制備的活性抗菌食品包裝材料或可食用薄膜等，取代傳統(tǒng)包裝材料，達(dá)到有效延長食品貨架期的目的。基于聲動力技術(shù)在食源性致病菌滅活方面取得的良好研究成果，以及聲動力技術(shù)在食品應(yīng)用領(lǐng)域的初步探索成效，可以看到聲動力技術(shù)作為一項新興技術(shù)在食品滅菌領(lǐng)域具有良好的發(fā)展優(yōu)勢與前景。但若要將聲動力技術(shù)作為食品、醫(yī)學(xué)、環(huán)境等各個領(lǐng)域?qū)嶋H應(yīng)用的抗菌工具，還需要對聲敏劑的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步改良，滅菌的超聲參數(shù)（頻率、強度）等需要進(jìn)一步研究，作用機制需要進(jìn)一步探索。相信隨著聲動力抗菌技術(shù)研究的逐漸深入，聲動力技術(shù)將作為對抗微生物污染的一種新手段，成為未來的一線抗菌策略。