張秋月，王 剛，陳坤朋，潘道東,,*，曾小群，吳 振，郭宇星

（1.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211；2.南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210097）

益生菌被定義為當(dāng)宿主攝入一定的量時(shí)，能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡來(lái)維持宿主消化系統(tǒng)和腸道健康的一類活的微生物[1-2]。近年來(lái)，有關(guān)益生菌的特性、功能和對(duì)人體益生作用的研究和應(yīng)用逐漸增多[3]。乳酸菌作為一種益生菌，對(duì)一些人類疾病如腸功能障礙、炎癥性腸病和結(jié)腸癌等起到預(yù)防和治療效果[4]，其對(duì)人體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用也備受關(guān)注。

乳酸菌通過(guò)對(duì)宿主黏膜和腸上皮細(xì)胞的黏附定植在腸道中，并刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)[5]，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生來(lái)增強(qiáng)宿主的免疫能力[6]。目前體外實(shí)驗(yàn)用腸道細(xì)胞模型來(lái)模擬人體腸上皮細(xì)胞的免疫效應(yīng)，是一種有效的實(shí)驗(yàn)方法，常用的細(xì)胞有人結(jié)腸癌HT-29、Caco-2、Lovo等。黃怡等[7]用乳酸乳球菌和屎腸球菌分別與Caco-2細(xì)胞共同培養(yǎng)1 h，再分別與大腸桿菌K882孵育培養(yǎng)2 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩株乳酸菌可以通過(guò)抑制促炎因子增殖誘導(dǎo)配體的分泌，促進(jìn)抗炎因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-10的產(chǎn)生，來(lái)減弱Caco-2細(xì)胞對(duì)大腸桿菌的炎癥應(yīng)答，表現(xiàn)出抗炎作用。Lin Qiuye等[8]先用瑞士乳桿菌R0052和嗜熱鏈球菌R0083發(fā)酵的大豆發(fā)酵液處理HT-29細(xì)胞16 h，再加入腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）孵育培養(yǎng)3 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)40 個(gè)促炎基因中有33 個(gè)基因下調(diào)，該發(fā)酵液可以通過(guò)減弱編碼多種促炎因子基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用。對(duì)腸上皮細(xì)胞黏附能力強(qiáng)的乳酸菌，延長(zhǎng)了其在胃腸道的駐留時(shí)間，促進(jìn)了其與宿主的相互作用，使其在胃腸道環(huán)境中擁有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[9]，有利于其發(fā)揮益生特性。Garriga等[10]發(fā)現(xiàn)腸道菌株鼠李糖乳桿菌CTC1679能通過(guò)置換作用抑制單核增生李斯特菌對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附，維持腸道的健康。丙酸桿菌Q4能抑制大腸桿菌C3和腸炎沙門氏菌90/390對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附，可用于開(kāi)發(fā)含有丙酸桿菌的功能性食品，有助于抵抗腸道病原體的感染[11]。

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）作為一種具有良好特性的益生菌，已被報(bào)道具有提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和增強(qiáng)免疫反應(yīng)的作用[12-14]。Fallingborg[15]研究了健康人體的胃腸道pH值，小腸和大腸的pH值分別在4.92～7.52和5.60～8.66之間，證明L. acidophilus可以通過(guò)胃部酸性環(huán)境進(jìn)入小腸[16]，同時(shí)王剛等[17]報(bào)道了pH 5.5～7.5培養(yǎng)條件下L. acidophilus的黏附特性，結(jié)果表明pH 5.5和pH 7.5條件下培養(yǎng)的L. acidophilus的黏蛋白黏附特性和細(xì)胞黏附特性均存在顯著性差異。在pH 5.5和pH 7.5的弱酸、弱堿性腸道環(huán)境中，L. acidophilus能否促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的免疫效應(yīng)還是未知，哪種腸道環(huán)境對(duì)L. acidophilus調(diào)節(jié)腸道免疫更有利，其調(diào)節(jié)機(jī)制還有待研究?；谏鲜鰡?wèn)題，本實(shí)驗(yàn)將pH 5.5和pH 7.5培養(yǎng)條件下的L. acidophilus與HT-29細(xì)胞共同培養(yǎng)，初步探討在類似腸道的弱酸、弱堿性條件下，具有顯著性黏附差異的L. acidophilus對(duì)腸道細(xì)胞的免疫影響，以期為今后研究L. acidophilus和不同黏附特性的乳酸菌對(duì)腸道細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)及維持腸道健康機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Lactobacillus acidophilusATCC 4356購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院菌種保藏中心；HT-29細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

McCoy’s 5A培養(yǎng)基 上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清 上海依科賽生物制品有限公司；青鏈霉素混合液 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶溶液-乙二胺四乙酸 美國(guó)Life Technologies公司；pH 7.2～7.4、10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 北京酷來(lái)搏科技有限公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒 美國(guó)Omega公司；目的基因及內(nèi)參基因引物 上海英濰捷基貿(mào)易有限公司；DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒、反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-quantitative real-time PCR，RT-qPCR）試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；IL-8、IL-10、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

M200 Pro型酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；IX53型倒置式熒光顯微鏡 日本Olympus公司；MCO-18AIC型CO2培養(yǎng)箱 日本Sanyo電機(jī)株式會(huì)社；Thermal Cycler型PCR儀 美國(guó)萊伯特公司；Universal Hood II型凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；超微量分光光度計(jì)上海依科賽生物制品有限公司；Light Cycler 96型熒光定量PCR儀 瑞士Roche公司；5415R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 HT-29細(xì)胞的培養(yǎng)

將在液氮中保存的HT-29細(xì)胞取出，37 ℃水浴迅速解凍復(fù)蘇，在培養(yǎng)皿中加入現(xiàn)配的含有雙抗（青鏈霉素混合液1×）和胎牛血清的McCoy’s 5A細(xì)胞培養(yǎng)基，5%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)4 h，觀察細(xì)胞貼壁狀況，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底面積的80%后，將細(xì)胞用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰酶消化處理，并轉(zhuǎn)移到6 孔培養(yǎng)板中，連續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板底面積的90%以上時(shí)進(jìn)行L. acidophilus的干預(yù)實(shí)驗(yàn)，干預(yù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用生長(zhǎng)活力較好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞。

1.3.2L. acidophilus的培養(yǎng)

將L. acidophilus在50 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)7 h后，按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量分別接種到初始pH值為5.5和7.5的100 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)10 h，6 000 r/min離心10 min，棄上清液。菌體用無(wú)菌PBS清洗3 次，最終調(diào)整菌液OD600nm＝1.0（約109CFU/mL）。取2 mL均勻后的菌液，10 000 r/min離心1 min，棄上清液，加入等體積的無(wú)雙抗細(xì)胞培養(yǎng)液，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3L. acidophilus與HT-29細(xì)胞的共培養(yǎng)

空白對(duì)照組：在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入2 mL無(wú)雙抗細(xì)胞培養(yǎng)液。

實(shí)驗(yàn)處理組：在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中分別加入2 mL含有pH 5.5和pH 7.5的L. acidophilus細(xì)胞培養(yǎng)液。均置于5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)3 h。

1.3.4 HT-29細(xì)胞總RNA的提取與瓊脂糖凝膠電泳的測(cè)定

用無(wú)菌PBS多次洗滌6 孔培養(yǎng)板中的HT-29細(xì)胞，去除L. acidophilus，按照細(xì)胞總RNA提取試劑盒的操作說(shuō)明，向6 孔培養(yǎng)板中加入裂解液，吹打，以充分裂解細(xì)胞，隨后加入等體積的70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇，將混合物轉(zhuǎn)移到離心柱中，室溫10 000×g離心60 s，棄掉流出液，向離心柱中加入RNA緩沖液I，10 000×g離心60 s，棄掉流出液。向離心柱中央加入無(wú)RNA的核酸內(nèi)切酶消化液，室溫（25～30 ℃）放置15 min，重復(fù)加入RNA緩沖液I，10 000×g離心60 s，棄掉流出液。向離心柱中央加入RNA緩沖液II，10 000×g離心60 s，棄掉流出液，并重復(fù)一次。將離心柱轉(zhuǎn)入一個(gè)新的1.5 mL無(wú)RNA酶的離心管中，并向離心柱中央加入預(yù)熱的DEPC水10 000×g離心60 s，洗脫RNA。在-80 ℃保存?zhèn)溆谩⑻崛〉募?xì)胞總RNA進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)測(cè)定提取的細(xì)胞總RNA的濃度，確定RNA的純度是否符合下一步的實(shí)驗(yàn)要求（具有清晰且單一的條帶）。

1.3.5 ELISA實(shí)驗(yàn)

將6 孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)上清液10 000×g離心1 min，取上清液分裝到無(wú)酶PE管中，液氮淬滅后于-80 ℃下貯存待測(cè)樣品。樣品檢測(cè)前于4 ℃解凍，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)避免樣品反復(fù)凍融。

1.3.6 HT-29細(xì)胞免疫因子的基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

反轉(zhuǎn)錄按照RT-PCR說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞總RNA為1 000 ng，反轉(zhuǎn)錄體系組分包括5×TransScript?All-in-One SuperMix for qPCR 10 μL、gDNA去除劑2.5 μL，以無(wú)RNA酶水補(bǔ)足50 μL。

將各組分混勻置于PCR儀中，參數(shù)設(shè)置為：42 ℃、15 min，85 ℃、5 s，使TransScript?RT/RI和gDNA去除劑失活，迅速將cDNA于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在NCBI及UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得目的基因和內(nèi)參基因的基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，RT-PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

加入1 μL cDNA模板，將各目的基因和內(nèi)參基因GAPDH同時(shí)擴(kuò)增，使用qPCR儀，RT-qPCR體系組分包括模板cDNA 1 μL、10 μmol/μL正向及反向引物各0.4 μL、2×TransStart?Top/Tip Green qPCR Super Mix 10 μL，以ddH2O補(bǔ)足20 μL。加樣后進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增參數(shù)為：預(yù)變性94 ℃、30 s，循環(huán)一次；變性94 ℃、5 s，退火60 ℃、30 s，循環(huán)45 次。在60 ℃退火30 s時(shí)采集熒光值，熔解曲線分析步驟為：變性95 ℃、10 s，退火65 ℃、60 s，變性97 ℃、1 s，循環(huán)一次。冷卻階段參數(shù)為：37 ℃保溫600 s，不采集熒光值。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算實(shí)驗(yàn)處理組相對(duì)于空白對(duì)照組HT-29細(xì)胞各免疫因子基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.7 HT-29細(xì)胞免疫因子質(zhì)量濃度測(cè)定

將IL-8、IL-10、TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品按免疫因子標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明書(shū)梯度稀釋，細(xì)胞培養(yǎng)基作為各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的零濃度。具體步驟按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，反應(yīng)結(jié)束后迅速用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm和570 nm波長(zhǎng)處的OD值，OD值的校準(zhǔn)用OD450nm-OD570nm表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 組平行，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SAS V8軟件完成統(tǒng)計(jì)分析，并利用Origin 8.5軟件繪圖。差異顯著性比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 HT-29細(xì)胞RNA瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果

為確定提取的HT-29細(xì)胞總RNA的質(zhì)量，對(duì)提取的RNA進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳（圖1），HT-29細(xì)胞的28S RNA和18S RNA條帶較為清晰且單一，表明提取的RNA純度較高，可用于后期實(shí)驗(yàn)。

圖1 HT-29細(xì)胞RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis analysis of total RNA extracted from HT-29 cells

2.2 HT-29細(xì)胞免疫因子基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定結(jié)果

圖2 3 組HT-29細(xì)胞免疫因子基因相對(duì)表達(dá)量Fig. 2 Relative gene expression levels of immune factors in HT-29 cells from three groups

如圖2 所示，與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)處理組H s p 7 0 和T N F-α 基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著上調(diào)（P＜0.01），IL-8、NF-κB和TLR-4基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著下調(diào)（P＜0.01），表明在共培養(yǎng)過(guò)程中L. acidophilus的加入對(duì)HT-29細(xì)胞產(chǎn)生了顯著的免疫刺激，通過(guò)產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，引起腸黏膜系統(tǒng)的先天性免疫和獲得性免疫反應(yīng)。IL-8是一種促炎趨化因子，在正常生理?xiàng)l件下，上皮細(xì)胞在受到感染或組織損傷時(shí)會(huì)產(chǎn)生IL-8，IL-8可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞向受感染部位趨化，通過(guò)誘導(dǎo)吞噬作用、氧化爆發(fā)來(lái)降低感染的幾率[18]。處理組中HT-29細(xì)胞IL-8基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著下調(diào)（P＜0.01），表明L. acidophilus能降低HT-29細(xì)胞感染和組織損傷的程度，對(duì)腸上皮細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。

與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)處理組在p H 5.5 條件下Hsp70和TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著上調(diào)（P＜0.01），分別是空白對(duì)照組的1.54 倍和11.9 倍，IL-8、NF-κB和TLR-4基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著下調(diào)（P＜0.01），分別是空白對(duì)照組的0.11、0.33 倍和0.86 倍，IL-10基因的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)，但與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。大量研究表明Hsp，特別是保守的Hsp70，能夠激活免疫反應(yīng)，在調(diào)節(jié)先天免疫應(yīng)答中起著重要作用。Lan Cheng等[19]研究表明Hsp70可以改善小鼠感染性腸易激綜合征的副反應(yīng)和腸蠕動(dòng)異常，通過(guò)促進(jìn)抑炎因子IL-10的產(chǎn)生提高小鼠的腸道免疫力。本實(shí)驗(yàn)也得到了相似的結(jié)果，HT-29細(xì)胞經(jīng)pH 5.5培養(yǎng)的L. acidophilus刺激后，Hsp70基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著上調(diào)（P＜0.01），同時(shí)IL-10基因的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，表明弱酸條件下的L. acidophilus能提高腸道細(xì)胞抵抗外界不良環(huán)境的能力，維護(hù)腸道健康。

用pH 7.5條件下培養(yǎng)的L. acidophilus和HT-29細(xì)胞共同培養(yǎng)，Hsp70、IL-8、IL-10、NF-κB、TLR-4和TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)量分別是空白對(duì)照組細(xì)胞的2.02、0.06、14.70、0.19、0.46 倍和24.9 倍，均與空白對(duì)照組存在顯著性差異（P＜0.05）。NF-κB通路是一個(gè)典型的炎癥信號(hào)通路，可被TLR-4激活，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，引發(fā)強(qiáng)直性脊柱炎等多種疾病[20]。TLRs是對(duì)抗病原體的第一道防線，可誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)受損組織自身產(chǎn)生的抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致許多自身免疫性和炎性疾病[21]。目前主要利用小分子的拮抗劑選擇性地與TLRs結(jié)合，抑制TLRs信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，逆轉(zhuǎn)TLRs在自身免疫性和炎性疾病中的破壞作用[22]。T L R-N F-κ B 是一個(gè)典型的炎癥通路，T L R 可通過(guò)下游的信號(hào)分子如髓樣分化因子8 8（m y e l o i d differentiation factor 88，MyD88）激活NF-κB通路，本研究表明HT-29細(xì)胞與pH 7.5條件下的L. acidophilus共同培養(yǎng)后，NF-κB和TLR4基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01），減少了整個(gè)TLR-NF-κB炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的產(chǎn)物，有利于保護(hù)腸道細(xì)胞免受自身免疫反應(yīng)和炎癥性疾病的影響[21]。

HT-29細(xì)胞與pH 7.5實(shí)驗(yàn)處理組的L. acidophilus共同培養(yǎng)后，Hsp70、IL-10和TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于p H 5.5 實(shí)驗(yàn)處理組（P＜0.01），同時(shí)N F-κ B 和T L R 4 基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著下調(diào)（P＜0.01）。對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附能力是評(píng)價(jià)菌株益生性的重要指標(biāo)，有研究表明Lactobacillus casei CRL431與Lactobacillus paracasei CNCMI-1518可通過(guò)TLRs黏附于腸上皮細(xì)胞，并刺激相關(guān)免疫細(xì)胞引起細(xì)胞因子IL-6和巨噬細(xì)胞趨化蛋白1增加，從而引起機(jī)體的先天免疫應(yīng)答[23]。Zhou Mingxu等[24]用甲基-β-環(huán)糊精去除Caco-2和IPEC細(xì)胞的膽固醇，可明顯減少大腸桿菌和沙門氏菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附和侵襲，并且降低了純化重組大腸桿菌鞭毛蛋白激活腸上皮細(xì)胞TLR-5信號(hào)的能力。Reti等[25]研究表明空腸彎曲桿菌可顯著提高大腸桿菌HB101對(duì)T84細(xì)胞的黏附，同時(shí)下調(diào)T84細(xì)胞TLR-4基因的表達(dá)，上調(diào)IL-8基因的表達(dá)。Wu Zhen等[26]對(duì)L. acidophilus在類似腸道的pH值環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)的黏附活性進(jìn)行了蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)pH 5.5和pH 7.5組的黏附相關(guān)表面蛋白PrtP和FmtB的表達(dá)上調(diào)，且差異蛋白數(shù)高達(dá)207 個(gè)。在以上研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明弱堿條件下黏附能力強(qiáng)的L. acidophilus對(duì)上皮細(xì)胞免疫因子的產(chǎn)生具有顯著性的影響，通過(guò)減少TLR-NF-κB炎癥信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)抗炎因子IL-10的產(chǎn)生，更利于L. acidophilus發(fā)揮腸道益生作用，提高腸道的免疫力。

2.3 HT-29細(xì)胞免疫因子的質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果

如表2所示，IL-8在空白對(duì)照組中質(zhì)量濃度極顯著高于實(shí)驗(yàn)處理組（P＜0.01）。在實(shí)驗(yàn)處理組中，pH 5.5處理組IL-8的質(zhì)量濃度低于pH 7.5處理組，但兩組之間并無(wú)顯著性差異（P＞0.05），其差異分析的結(jié)果與IL-8基因轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定結(jié)果具有一致性。研究表明IL-8與多種炎癥性疾病和腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，目前臨床上開(kāi)發(fā)的相關(guān)受體抑制劑對(duì)相關(guān)疾病有明顯的治療作用[27]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明L. acidophilus的加入，可極顯著提高腸道細(xì)胞抵抗炎癥性疾病和腫瘤的免疫能力（P＜0.01）。

表2 不同處理組HT-29細(xì)胞免疫因子的質(zhì)量濃度Table 2 Concentrations of immune factors in HT-29 cells

IL-10在實(shí)驗(yàn)處理組中的質(zhì)量濃度極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01）且pH 7.5處理組相對(duì)于pH 5.5處理組，IL-10的質(zhì)量濃度極顯著增加（P＜0.01），和IL-10基因轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果一致。IL-10是一種有效的抗炎細(xì)胞因子，對(duì)保護(hù)宿主免受過(guò)度炎癥和免疫反應(yīng)至關(guān)重要。人類遺傳學(xué)研究也證實(shí)了IL-10對(duì)預(yù)防腸道內(nèi)的有害炎癥發(fā)揮著重要的作用[28]。Xiao Zuoxiang等[29]研究表明IL-10可保護(hù)小鼠胰島細(xì)胞免受致糖尿病T細(xì)胞的侵襲。動(dòng)物腸道中巨噬細(xì)胞IL-10受體（IL-10Rα）的表達(dá)缺失后，易引發(fā)自發(fā)性的潰瘍性結(jié)腸炎[30]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明弱堿條件下（pH 7.5）培養(yǎng)的L. acidophilus能極顯著提高HT-29細(xì)胞抗炎因子IL-10的質(zhì)量濃度（P＜0.01），降低機(jī)體的腸道炎癥。

實(shí)驗(yàn)處理組中TNF-α的質(zhì)量濃度極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），pH 7.5實(shí)驗(yàn)組和pH 5.5實(shí)驗(yàn)組TNF-α的質(zhì)量濃度無(wú)顯著性差異（P＞0.05），與TNF-α基因轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定結(jié)果有一定偏差，可能的原因是基因的表達(dá)和翻譯過(guò)程存在時(shí)間差，或者是TNF-αmRNA水平的提高，激活了TNF-α基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因素，從而抑制了TNF-α的表達(dá)。TNF-α是具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，適量的TNF-α在抵抗病原菌和腫瘤預(yù)防中起著重要的作用，當(dāng)其超過(guò)一定量時(shí)可與其他炎癥因子一起促進(jìn)癌癥的發(fā)生及多種病理性損傷[31]。董雨龍[32]報(bào)道，TNF-α可通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路和抗凋亡基因的高表達(dá)參與大鼠急性肝損傷的調(diào)節(jié)，適量質(zhì)量濃度的TNF-α對(duì)急性肝損傷具有保護(hù)作用。同時(shí)Djaldetti等[33]研究發(fā)現(xiàn)益生菌能促進(jìn)人類外周血單核細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和干擾素γ，其中TNF-α質(zhì)量濃度達(dá)1.81 ng/mL，同時(shí)降低脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對(duì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。Hu Naihua等[34]利用LPS建立人肝星狀細(xì)胞炎癥模型，研究連翹脂素的炎癥干預(yù)效果，結(jié)果表明連翹脂素能通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路降低LPS的促炎反應(yīng)，TNF-α的質(zhì)量濃度降至約為80 pg/mL。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在添加L. acidophilus以后，細(xì)胞因子TNF-α在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均極顯著提高（P＜0.01），質(zhì)量濃度達(dá)47.21 pg/mL。TNF-α能通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，引發(fā)腸道炎癥，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TNF-α、TLR-4和NF-κB的基因相對(duì)表達(dá)量未出現(xiàn)同步變化，可能的原因是L. acidophilus對(duì)腸道細(xì)胞TNF-α質(zhì)量濃度的提高主要是增強(qiáng)腸道細(xì)胞的免疫活性，不會(huì)引起腸道的炎癥疾病。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)具有黏附性差異的L. acidophilus對(duì)腸道細(xì)胞免疫因子的影響做了初步分析，表明L. acidophilus在正常腸道弱堿性環(huán)境（pH 7.5）中黏附性較強(qiáng)，能夠抑制腸道細(xì)胞炎癥因子IL-8的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)抗炎因子IL-10的表達(dá)，顯著降低腸道細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。此外NF-κB、TLR-4、Hsp70基因相對(duì)表達(dá)量的改變也均會(huì)對(duì)腸道產(chǎn)生有利的影響。整體來(lái)看，在正常的弱堿性腸道環(huán)境中L. acidophilus可提高腸道細(xì)胞的抗炎能力。