萬正瑞，李強強，王 凱，吳黎明

（中國農業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京 100093）

蜂蜜是一種重要的蜂產品，不僅可作為傳統(tǒng)滋補食品和天然甜味劑[1]，也有促進傷口愈合、組織再生以及緩解胃腸道疾病、牙齦炎和其他疾病的作用[2]。不同品種蜂蜜的成分、口感、顏色等取決于其蜜源的類型、地理位置、氣候以及采集蜂蜜的蜂種，同時也受加工工藝和貯藏條件的影響[3]。我國蜜粉源植物種類十分豐富，是世界上最大的蜂蜜生產國，特色蜂產品種類豐富。近年來，開展特色蜂蜜化學成分與營養(yǎng)功能評價研究已經成為國外蜂產品開發(fā)利用的新方向，但針對藥用植物蜂蜜的研究還十分有限[1]。

夏枯草（Prunella vulgaris）為唇形科植物，是我國中部地區(qū)廣泛種植的一種中藥材[4-5]，具有清火明目的功效，其含有多種活性成分，如三萜類、甾體類、黃酮類、香豆素類等[6]。已有研究表明夏枯草具有廣泛的藥理作用，如抗病毒[7]、免疫抑制活性[8]、抗氧化和清除自由基[9]、抗腫瘤[10]等，臨床應用已有很長的歷史。夏枯草蜂蜜是蜜蜂采集夏枯草植物的花蜜并與自身分泌物混合后經充分釀造而成的天然甜物質，是一種特色蜂蜜。本課題組前期研究了夏枯草蜂蜜的理化屬性，在動物實驗中發(fā)現夏枯草蜂蜜具有良好的抗結腸炎作用和對腸道菌群的調節(jié)作用，且多酚類物質在其中發(fā)揮主要作用[11]。由于大孔樹脂提取的夏枯草蜂蜜提取物中包含了蜂蜜中絕大部分的多酚、黃酮類化合物等活性物質，基本能反映夏枯草蜂蜜本身的功效，因而在本實驗中采用大孔樹脂提取物進行相關研究。本實驗擬從細胞、分子層面，建立硫酸葡聚糖（dextran sulfate sodium，DSS）誘導的腸細胞功能屏障損傷模型，以洋槐蜂蜜為對照，進一步研究夏枯草蜂蜜對DSS誘導腸屏障損傷的保護作用，為夏枯草蜂蜜作為預防潰瘍性結腸炎功能食品的潛在應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

夏枯草蜂蜜、洋槐蜂蜜 河南駐馬店意大利蜜蜂場。

醋酸、綠原酸標準品、槲皮素標準品（純度＞98%）、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物、Prime ScriptTMRT Master Mix試劑盒、TB Green?Premix Ex TaqTM生工生物工程（上海）股份有限公司；甲醇、乙酸乙酯（色譜純） 美國MREDA公司；福林-酚試劑、青鏈霉素混合液（100×）、RNA提取試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；Amberlite XAD-2樹脂、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）溶液、2,2’-聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）溶液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國Sigma-Aldrich公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）美國Gibco Laboratories公司；DSS 美國MP Biomedicals公司；特異性抗體（依賴還原型輔酶/醌氧化還原酶（NAD(P)H quinone dehydrogenase，NQO）-1、核因子E2相關因子（nuclear factor-E2-related factor，Nrf）2、硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，Txnrd）1）艾博抗（上海）貿易有限公司；特異性抗體（胞質緊密黏連蛋白（zonula occludens，ZO）-1、β-肌動蛋白（β-actin）） 武漢三鷹生物技術有限公司；BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色劑 上海碧云天生物技術有限公司；一抗稀釋液、二抗稀釋液 武漢賽博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

KQ-500超聲清洗儀 杭州法蘭特超聲波科技有限公司；SY-2000旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；N-EVAP112氮氣吹干儀 美國OA-SYS公司；Spectra Max?I3酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；Nano Drop 2000超微量分光光度計 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PCR儀 東勝創(chuàng)新生物科技（中國）有限公司；熒光定量PCR儀 杭州博中科技有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；激光共聚焦掃描顯微鏡 德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 夏枯草蜂蜜、洋槐蜂蜜前處理

稱取夏枯草蜂蜜1 kg溶解在5 L、pH 2的醋酸中，充分攪拌0.5 h后，將1 kg大孔樹脂（提前用無水乙醇浸泡24 h后，用清水洗凈）和蜂蜜溶液混合攪拌吸附1 h后，靜置分層，過夜，倒掉上清液后，將沉淀物裝入玻璃柱，依次用2 L、pH 2的醋酸和5 L去離子水淋洗，然后用7 L無水乙醇洗脫，收集洗脫液，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至固形物后溶解于10 mL去離子水中，轉移至50 mL離心管中，加入10 mL乙酸乙酯振蕩萃取10 min，收集乙酸乙酯層，重復4 次，合并后氮氣吹干，置于-20 ℃冰箱保存，洋槐蜂蜜操作與夏枯草蜂蜜相同。

1.3.2 總酚酸、總黃酮含量測定

總酚酸含量的測定：采用福林-酚法[12]，在1.5 mL EP管中加入150 μL夏枯草蜂蜜提取液和等體積的福林-酚試劑，混勻后室溫避光反應5 min，加入450 μL質量分數2%的Na2CO3溶液，混勻，室溫避光反應2 h之后，加入96 孔板中，200 μL/孔。設置3 個實驗組和1 個對照組（對照組中加入150 μL純水，其他處理與實驗組相同），在765 nm波長處測定吸光度。以沒食子酸為標準物質，以其質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標制作標準曲線（y＝0.009 6x-0.003 1，R2＝0.993 0）。

總黃酮含量的測定：采用硝酸鋁法[12]，在1.5 mL EP管中加入150 μL夏枯草蜂蜜提取液、10 μL Al(NO3)3溶液（質量濃度100 g/L）和10 μL CH5OOK溶液（質量濃度9.8 g/L），漩渦混勻，加入330 μL去離子水，混勻后室溫靜置避光反應1 h，加入96 孔板中，200 μL/孔。設置3 個實驗組和1 個對照組（對照組中加入150 μL純水，其他處理與實驗組相同），在415 nm波長處測定吸光度。以槲皮素為標準物質，以其質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標制作標準曲線（y＝0.012 3x-0.007 8，R2＝0.998 7）。

1.3.3 抗氧化能力測定

1.3.3.1 ABTS陽離子自由基清除率和半抑制濃度測定

參考Yang Haisha等[13]的方法，在1.5 mL EP管中加入250 μL ABTS工作液和125 μL夏枯草蜂蜜提取物，漩渦混勻后避光反應10 min，加入96 孔板中，150 μL/孔，在734 nm波長處測定實驗組吸光度，記為A1；樣品空白對照組（125 μL DPPH溶液與125 μL無水乙醇溶液混合）記為A2；試劑空白對照組（125 μL無水乙醇溶液與125 μL樣品溶液混合）記為A0，按公式（1）計算ABTS陽離子自由基清除率。以水溶性VE（Trolox）為標準物質，以其質量濃度為橫坐標、自由基清除率為縱坐標制作標準曲線（y＝0.018 5x+0.153 8，R2＝0.995 4），計算蜂蜜半抑制濃度（50% maximum inhibiting concentration，IC50）。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率和半抑制濃度測定

參考Guo Xiali等[14]的方法，配制質量濃度1 mg/mL的DPPH標準液，稀釋合適倍數使其在517 nm波長處的吸光度保持在0.8～0.9。在1.5 mL EP管中加入125 μL夏枯草蜂蜜提取物和125 μL DPPH，室溫避光反應0.5 h后，加入96 孔板中，100 μL/孔，在517 nm波長處測定實驗組吸光度，記為A1；樣品空白對照組（250 μL ABTS工作液與150 μL無水乙醇溶液）記為A2；試劑空白對照組（250 μL ABTS工作液與150 μL無水乙醇溶液）記為A0，按公式（2）計算DPPH自由基清除率。以Trolox為標準物質，以其質量濃度為橫坐標、自由基清除率為縱坐標制作標準曲線（y＝0.008 0x+0.118 3，R2＝0.996 1），計算蜂蜜IC50。

1.3.3.3 鐵離子抗氧化能力和半抑制濃度測定

鐵離子抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）測定參考Guo Xiali等[14]的方法，在1.5 mL EP管中加入75 μL PBS（pH 6.6）、75 μL質量分數2% K3[Fe(CN)6]溶液和300 μL夏枯草蜂蜜提取物，漩渦混勻，50 ℃避光反應20 min，加入75 μL質量分數20% Cl3CCOOH溶液，2 000×g離心10 min，吸取300 μL上清液與300 μL去離子水，和60 μL質量分數0.1% FeCl3溶液充分混勻，于592 nm波長處測定吸光度，記為A1；以去離子水為空白對照，加入到96 孔板中，200 μL/孔，記為A2。以Trolox為標準物質，以其質量濃度和清除率制作標準曲線（y＝0.007 9x+0.386 2，R2＝0.995 2），計算蜂蜜IC50。

1.3.4 夏枯草蜂蜜提取物抗氧化活性及Caco-2細胞屏障功能完整性分析

1.3.4.1 Caco-2細胞相對活力測定

Caco-2細胞培養(yǎng)條件：DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%體積分數的熱滅活胎牛血清、質量濃度100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素）；培養(yǎng)箱（37 ℃、相對濕度100%、體積分數5% CO2）。將10×104個/mL Caco-2接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，邊緣加入100 μL DMEM高糖培養(yǎng)基為空白對照，待細胞完全分化且生長程度達到70%～80%時，進行分組處理：夏枯草蜂蜜組：分別加入質量濃度50、100、150 μg/mL和200 μg/mL的夏枯草蜂蜜提取物溶液；洋槐蜂蜜組：分別加入質量濃度50、100、150 μg/mL和200 μg/mL的洋槐蜂蜜提取物溶液；空白對照組不做任何處理。孵育24 h后，加入CCK-8 10 μL/孔，置于培養(yǎng)箱中反應2 h，在450 nm波長處測定吸光度。蜂蜜處理組吸光度記為A1、空白對照組記為A2，按公式（3）計算細胞相對活力，得出蜂蜜提取物安全質量濃度。之后將10×104個/mL Caco-2接種于24 孔板中，待細胞完全分化且生長程度達到70%～80%時，進行分組處理：夏枯草蜂蜜和洋槐蜂蜜組分別加入上述步驟所得蜂蜜提取物溶液的安全質量濃度。孵育1 h后，夏枯草蜂蜜組、洋槐蜂蜜組和DSS組均加入體積分數2.5% DSS，對照組不做任何處理。孵育24 h后，4 組均加入CCK-8溶液50 μL/孔，置于培養(yǎng)箱中反應2 h，測定450 nm波長處的吸光度。夏枯草蜂蜜處理組記為A1，洋槐蜂蜜處理組記為A2，空白對照組記為A3，DSS處理組記為A4，同樣按公式（3）計算細胞相對活力。

式中：A代表A1或A2或A3。

1.3.4.2 單層Caco-2細胞膜電阻值測定

向6 孔板的小室中加入0.5 mL細胞懸浮液（細胞個數為10×104個），下室加入1.5 mL DMEM培養(yǎng)基，每2 d換一次液，測電阻值，培養(yǎng)到細胞電阻值不再變化，將細胞分為3 組，即空白組、DSS組和夏枯草蜂蜜提取物組?？瞻捉M不做任何處理，DSS組加入體積分數2.5% DSS，夏枯草蜂蜜提取物預處理組加入質量濃度100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物孵育1 h后再加入體積分數2.5% DSS，處理后分別于0.25、0.75、1.75、3、5 h時測定電阻值[15]。

1.3.4.3 Caco-2細胞緊密連接蛋白ZO-1分布觀察

將10×104個/mL Caco-2細胞接種于6 孔板中，每孔中均放入爬片，37 ℃、相對濕度100%，體積分數5% CO2，待細胞完全分化且生長程度達到50%左右時，加入質量濃度100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物預處理1 h后，加入體積分數2.5% DSS，24 h后收樣。用固定液（丙酮∶甲醇體積比為1∶1）固定0.5 h，0.5%聚乙二醇辛基苯基醚透化0.5 h，10%驢血清室溫封閉0.5 h后，體積比1∶200的一抗（ZO-1）稀釋液孵育1 h，體積比1∶500的二抗羊抗兔稀釋液孵育1 h，體積比1∶2 000的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染核5 min，指甲油封片置于墨盒中，用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察并分析。

1.3.4.4 Caco-2細胞中抗氧化及緊密連接基因表達量的測定

檢測夏枯草蜂蜜提取物對DSS誘導的Caco-2細胞中相關抗氧化蛋白基因（NQO-1、Txnrd1和Nrf2）和緊密連接蛋白基因ZO-1在mRNA水平的表達：將10×104個/mL Caco-2細胞接種于6 孔板中，待細胞完全分化且生長程度達到70%～80%后，加入適量不同質量濃度的蜂蜜提取物預處理1 h，加入體積分數2.5% DSS，孵育24 h后收樣。利用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，超微量分光光度計測定RNA濃度，RT Master Mix試劑盒將RNA反轉錄為cDNA后放在-20 ℃冰箱保存待用。利用Premix ExTaqTM試劑盒做熒光定量PCR檢測，10 μL反應體系（上游引物、下游引物和cDNA模板均為0.2 μL，Premix ExTaqTM5.0 μL，無RNA酶水4.4 μL）。以β-actin為管家基因，作靶標基因的標準參照物，結果用2-ΔΔCt表示[16]，引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR實驗中的引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.3.4.5 Caco-2細胞蛋白提取及免疫印跡分析

將10×104個/mL Caco-2細胞接種于6 孔板中，待細胞完全分化且生長程度達到70%～80%之間，加入適量不同質量濃度的蜂蜜提取物預處理1 h后，加入體積分數5% DSS，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后收樣。取出細胞，倒掉培養(yǎng)液，PBS清洗2 遍，每孔中加入80 μL NP-40細胞裂解液，在4 ℃搖床10 min，用細胞刮板刮下板內細胞并轉移至1.5 mL EP管中，15 000×g、4 ℃離心10 min，取上清液。使用標準蛋白濃度檢測法測定蛋白質量濃度，將剩余樣品和4×蛋白上樣緩沖液按體積比3∶1混合，15 000×g、4 ℃離心1 min，95 ℃水浴10 min，將變性后的蛋白放入-80 ℃冰箱待用。以20 μg總蛋白上樣量對不同處理蛋白進行實驗，經過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、抗體雜交、顯色等步驟，得到NQO-1、Nrf2、Txnrd1和β-actin基因的蛋白條帶。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

利用Excel、Origin 2017軟件進行t檢驗和作圖，利用Image J軟件進行免疫印跡結果分析。實驗結果以平均值±標準差表示，采用t檢驗法進行顯著性差異分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 蜂蜜總酚酸、總黃酮含量測定結果

表2 兩種蜂蜜總酚酸、總黃酮含量Table 2 Contents of total flavonoids and total phenols in two honeys

由表2 可知， 夏枯草蜂蜜的總酚酸含量為（52.4±0.4）μg/g，極顯著高于洋槐蜂蜜的總酚酸含量（6.1±0.6）μg/g；夏枯草蜂蜜總黃酮含量為（7.0±0.3）μg/g，極顯著低于洋槐蜂蜜總黃酮含量（15.5±0.2）μg/g（P＜0.01）。

2.2 蜂蜜抗氧化能力測定結果

表3 兩種蜂蜜的抗氧化能力Table 3 Antioxidant activity of two honeys

由表3可知，夏枯草蜂蜜體外抗氧化活性顯著強于洋槐蜂蜜。夏枯草蜂蜜DPPH IC50、ABTS IC50和FRAP的IC50分別為（113.8±1.6）、（56.9±2.1）μg/g和（214.1±2.6）μg/g；而洋槐蜂蜜DPPH IC50、ABTS IC50和FRAP的IC50分別為（8.1±0.5）、（3.1±0.6）μg/g和（13.5±0.8）μg/g。

2.3 蜂蜜提取物對DSS誘導的Caco-2細胞相對活力的影響

為保證蜂蜜提取物對Caco-2細胞生長代謝無明顯的毒性，采用CCK-8法測定質量濃度0～200 μg/mL的夏枯草蜂蜜提取物、洋槐蜂蜜提取物對Caco-2細胞相對活力的影響。由圖1A可知，與空白對照組相比，Caco-2細胞經過不同質量濃度夏枯草蜂蜜提取物處理后，50～100 μg/mL的夏枯草蜂蜜提取物對細胞相對活力無顯著抑制效果（P＞0.05），而質量濃度150～200 μg/mL的夏枯草蜂蜜提取物對Caco-2細胞的相對活力有顯著抑制作用（P＜0.05）。因此，將質量濃度100 μg/mL作為夏枯草蜂蜜提取物的安全質量濃度上限。如圖1B所示，與空白對照組相比，Caco-2細胞經過不同質量濃度洋槐蜂蜜提取物處理后，質量濃度50～100 μg/mL的洋槐蜂蜜提取物對細胞相對活力無顯著抑制效果（P＞0.05），而質量濃度150～200 μg/mL的洋槐蜂蜜提取物對Caco-2細胞相對活力有顯著的抑制作用（P＜0.05）。因此，質量濃度100 μg/mL為洋槐蜂蜜提取物的安全質量濃度上限。由圖1C可知，相比DSS損傷組（僅添加2.5% DSS），用質量濃度50～100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物處理細胞，可以顯著提高Caco-2細胞的相對活力（P＜0.05），并可拮抗DSS對Caco-2細胞的損傷。由圖1D可知，相比DSS損傷組，洋槐蜂蜜處理對Caco-2細胞的相對活力無顯著提升（P＞0.05）。因此選擇夏枯草蜂蜜提取物為研究對象，評價其對DSS誘導Caco-2細胞基因和蛋白表達情況影響。

圖1 夏枯草蜂蜜提取物和洋槐蜂蜜提取物對DSS誘導Caco-2細胞相對活力的影響Fig. 1 Effect of Prunella vulgaris honey extract and acacia honey extract on Caco-2 cell viability with and without DSS induction

2.4 夏枯草蜂蜜提取物對細胞抗氧化及緊密連接基因相對表達量的影響

由圖2 A ～C 可知，與空白組相比，D S S 組顯著上調3 種抗氧化基因的相對表達量，質量濃度50～100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物預處理組與DSS組相比，可顯著顯著上調3 種基因的相對表達量（P＜0.05，P＜0.01）。圖2D中，與空白對照組相比，DSS組下調了ZO-1的相對表達量，質量濃度50～100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物預處理組與DSS組相比，可極顯著上調ZO-1的相對表達量（P＜0.01）。

圖2 夏枯草蜂蜜提取物對DSS誘導的Caco-2細胞中抗氧化和緊密連接基因相對表達量的影響Fig. 2 Effect of PVH extract on the expression of antioxidant genes and tight junction gene in DSS-induced Caco-2 cells

2.5 夏枯草蜂蜜提取物對Caco-2細胞屏障功能的影響

Caco-2 單層細胞旁路中，因有離子流動而產生微弱電流。研究發(fā)現，單層細胞跨膜電阻值（transepithelial electrical resistance，TEER）越大（約500～1 500 Ω·cm2），緊密連接越完整，細胞屏障功能越強[17]。如圖3所示，空白組的電阻值沒有明顯變化，DSS組電阻值明顯降低，加入體積分數2.5% DSS后3 h內，電阻值基本穩(wěn)定，最大下降了12.8%，在5 h時，電阻值最大下調約20.0%；而在添加體積分數2.5% DSS之前加入質量濃度100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物預處理1 h，測得電阻值的下調幅度比DSS組小，加入體積分數2.5% DSS的3 h內，電阻值基本穩(wěn)定，最大下降了9.1%，在5 h時，電阻值最大下調11.1%。說明夏枯草蜂蜜提取物預處理可上調DSS誘導的Caco-2細胞的電阻值，增強腸道屏障功能。

圖3 夏枯草蜂蜜提取物對DSS誘導的Caco-2細胞單層跨膜電阻值的影響Fig. 3 Effect of PVH extract on TEER in DSS-induced Caco-2 cells

2.6 夏枯草蜂蜜提取物對Caco-2細胞ZO-1分布的影響

利用免疫熒光技術檢測Caco-2細胞中緊密連接蛋白的分布，結果如圖4所示，空白組緊密連接蛋白ZO-1分布完整，DSS組明顯破壞了緊密連接蛋白ZO-1的表達，而夏枯草蜂蜜提取物和DSS組緊密連接蛋白ZO-1的完整性明顯高于DSS組，說明夏枯草蜂蜜預處理可在一定程度上拮抗DSS對Caco-2細胞緊密連接蛋白ZO-1的損傷。

圖4 夏枯草蜂蜜提取物對DSS誘導的Caco-2細胞緊密連接蛋白分布的影響Fig. 4 Effect of PVH extract on the distribution of tightly connected protein in DSS-induced Caco-2 cells

2.7 夏枯草蜂蜜提取物對DSS誘導Caco-2細胞抗氧化蛋白表達的影響

利用Western blot技術，檢測Caco-2細胞中抗氧化蛋白的表達，結果如圖5A所示，定量后的結果如圖5B～D所示。與空白組相比，DSS組上調了3 種蛋白的相對表達量。加入質量濃度50～100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物預處理后，與DSS組相比，可顯著上調NQO-1蛋白的相對表達量（圖5B）（P＜0.05，P＜0.01）。加入質量濃度100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物預處理后，與DSS組相比，可極顯著上調Nrf2蛋白的相對表達量（P＜0.01）（圖5C）。加入質量濃度100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物預處理后，與DSS組相比，夏枯草蜂蜜組顯著上調Txnrd1蛋白的相對表達量（P＜0.05）（圖5D）。

圖5 夏枯草蜂蜜提取物對抗氧化蛋白相對表達量的影響Fig. 5 Effect of PVH extract on the expression of antioxidant proteins in DSS-induced Caco-2 cells

3 討 論

本課題組前期研究發(fā)現，夏枯草蜂蜜在動物實驗中具有良好的抗結腸炎作用，而且夏枯草蜂蜜含有豐富的多酚類物質，主要包括迷迭香酸、p-香豆酸、香草酸、反式肉桂酸和咖啡酸等[12]。大量研究表明，多酚類化合物具有良好的生物學活性[18]，如一些多酚類成分可調節(jié)腸道上皮細胞屏障功能，促進ZO-1等相關基因的表達[19]，而多酚類化合物亦可通過釋放一個電子或氫原子中和自由基，發(fā)揮其抗氧化活性[20]。

在以往研究中，Li Qiangqiang等[21]發(fā)現加入質量濃度50～200 μg/mL花粉多酚提取物預處理的細胞活力顯著高于DSS組，說明蜂花粉對DSS誘導的Caco-2細胞損傷有潛在的保護作用。在本研究中，夏枯草蜂蜜提取物在質量濃度50～100 μg/mL處理細胞，相比DSS損傷組，可以顯著提高Caco-2細胞的相對活力（P＜0.05），拮抗DSS對Caco-2細胞的損傷，而洋槐蜂蜜并無顯著作用（P＞0.05），說明夏枯草蜂蜜提取物對DSS誘導的Caco-2細胞損傷有潛在的保護作用。

體外研究表明，酚酸類化合物具有羥基基團，可以有效清除自由基[22]。本研究結果表明，夏枯草蜂蜜的總酚酸含量極顯著高于洋槐蜂蜜，總黃酮含量極顯著低于洋槐蜂蜜（P＜0.01），而梁馨文等[23]研究發(fā)現海南無刺蜂蜂蜜總黃酮含量（16.1±0.3）μg/g高于夏枯草蜂蜜。但3 種蜂蜜的體外抗氧化能力從高到低依次為夏枯草蜂蜜＞無刺蜂蜂蜜＞洋槐蜂蜜。由此看來，盡管多酚類物質對蜂蜜抗氧化能力起主要貢獻，但具有更高含量的酚酸和黃酮類物質的蜂蜜不一定具有更高的抗氧化能力，這也可能與蜂蜜中多酚類物質種類有關[24]。

前人研究證明DSS誘導的單層Caco-2細胞與結腸炎的早期炎癥反應密切相關[25-26]，一定濃度的外源性DSS加入Caco-2單層細胞中，可導致緊密連接蛋白損傷、上皮屏障功能障礙、腸細胞膜通透性增加等炎癥性疾病[27-30]。緊密連接蛋白的表達和分布是決定腸屏障功能穩(wěn)定性及完整性的主要因素。細胞緊密連接蛋白主要是由連接黏附因子、occludin、claudins和閉合小環(huán)蛋白（ZO-1、ZO-2、ZO-3）等組成[31]。當前研究發(fā)現緊密連接功能紊亂會增加細胞膜的滲透性，從而使某些有毒物質（毒素和細菌等）進入腸道黏膜固有層激活免疫細胞，進而引發(fā)胃腸道疾病等疾病[32-33]。Caco-2細胞的結構和功能與人的小腸上皮細胞類似，在緊密連接和細胞極性等方面有共通性，被廣泛應用于研究體內腸轉運模型[34]和腸道上皮細胞的屏障功能[35]。

本實驗利用細胞遷移實驗研究夏枯草蜂蜜對Caco-2細胞的屏障功能的影響（圖3），空白組的電阻值沒有明顯變化，DSS組中，電阻值明顯降低，這與以往研究結果一致[21,36]；而在加入體積分數2.5% DSS前1 h加入質量濃度100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物預處理，電阻值的下調幅度明顯比DSS組小，說明在一定程度上，夏枯草蜂蜜提取物預處理可以上調Caco-2細胞的電阻值，加強腸道屏障功能，改善DSS對Caco-2細胞屏障功能的損傷。為驗證此猜想，本研究進一步從基因及蛋白層面深入探索。DSS組中ZO-1相對表達量降低，而夏枯草蜂蜜提取物預處理組相比于DSS組，ZO-1表達極顯著增強（P＜0.01）（圖2D）。與空白組相比，DSS刺激組明顯破壞了細胞ZO-1蛋白的完整性，而夏枯草蜂蜜提取物預處理組則表現出相對完整的緊密連接結構（圖4）。在以往研究中發(fā)現富含多酚的食物，如綠茶、水果等可以改善腸道屏障功能[37-39]。Li Qiangqiang等[21]發(fā)現經過質量濃度50～100 μg/mL蜂花粉多酚提取物預處理的細胞中，ZO-1表達顯著增強，細胞也表現出相對完整的緊密連接結構。本研究與其結果一致，說明夏枯草蜂蜜提取物可維持Caco-2細胞緊密連接的完整性，增強腸道屏障功能，改善DSS對Caco-2細胞屏障功能的損傷。

Poritz等[40]發(fā)現DSS誘導的小鼠結腸炎最早的癥狀之一就是緊密連接蛋白的損傷，其次是細胞通透性增加，進而導致腸道氧化應激及炎癥反應。氧化應激過程會產生活性氧，活性氧和腸上皮黏膜的巰基反應使相應酶失活和蛋白質變性，與細胞膜內多不飽和脂肪酸反應，促使脂質過氧化，加劇腸道細胞損傷[41]。NQO-1、Txnrd1及Nrf2蛋白參與細胞對氧化應激的防御，且參與增強細胞抗氧化能力的過程[42-44]。Nrf2是轉錄因子的一種，一般情況下，keap1可迅速降解Nrf2，氧化應激條件下，激活Nrf2的表達，抗氧化反應原件和Nrf2結合，促使調控特定抗氧化蛋白的基因和細胞防御酶的表達，從而有效降低活性氧物質對細胞的損傷程度，保護細胞免受氧化應激損傷[45]。NQO-1是啟動抗氧化反應原件相關基因轉錄的關鍵基因，通過催化醌類和其衍生物發(fā)生還原反應，進而有效抑制ROS產生，從而發(fā)揮抗氧化作用[46]。Txnrd1是Nrf2-keap1應答系統(tǒng)有效的調節(jié)器[47]，可在轉錄水平調控NADPH氧化酶的活性，進而調控細胞內活性氧水平。正常狀態(tài)下，胞內為還原態(tài)，胞外為氧化態(tài)，氧化應激改變了細胞的內外狀態(tài)，而過度氧化應激會使細胞產生不可逆轉的損傷，因此細胞會增加Txnrd1水平從而消除H2O2，抑制細胞凋亡，幫助細胞抵御氧化應激。DSS誘導Caco-2細胞中抗氧化基因的表達，觸發(fā)細胞防御保護機制，細胞免疫應答，釋放出更多的抗氧化因子抵抗氧化應激。而夏枯草蜂蜜提取物預處理與DSS組相比，Txnrd1基因表達極顯著增強（P＜0.01），NQO-1和Nrf2基因表達顯著增強（P＜0.05），說明夏枯草蜂蜜提取物使細胞釋放出更多的抗氧化因子來抵抗DSS對Caco-2細胞的氧化損傷，從而能夠有效保護細胞。DSS組促進了3 種蛋白的相對表達量，說明DSS誘導Caco-2細胞中抗氧化蛋白的表達，觸發(fā)了細胞防御保護機制，而在夏枯草蜂蜜提取物預處理組中，尤其是質量濃度為100 μg/mL時，Txnrd1、NQO-1、Nrf2蛋白相對表達顯著增強（P＜0.05，P＜0.01），說明夏枯草蜂蜜提取物促使細胞釋放出更多的抗氧化因子來抵抗DSS對Caco-2細胞的氧化損傷。

綜上，與洋槐蜂蜜相比，夏枯草蜂蜜對DSS損傷的Caco-2細胞有保護作用。夏枯草蜂蜜提取物可以上調抗氧化基因（NQO-1、Txnrd1和Nrf2）和緊密連接蛋白基因（ZO-1）的相對表達量，上調抗氧化蛋白（NQO-1、Txnrd1和Nrf2）的相對表達量，維持Caco-2細胞緊密連接的完整性，增強腸道屏障功能，改善DSS對Caco-2細胞屏障功能的損傷。這些結果為探明夏枯草蜂蜜對腸道健康的有益作用的機制提供了支持，并對潰瘍性結腸炎的預防和治療具有重要參考價值。