王 娜，吳長(zhǎng)玲，陳凡凡，李 楊，滕 飛

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

高壓均質(zhì)是一種非熱能技術(shù)，它不僅能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生變化并改變其理化性質(zhì)，從而導(dǎo)致這些蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)（如溶解性、乳化性、起泡性和凝膠化性）得到改善，還具有開發(fā)食品工業(yè)新產(chǎn)品的潛力，因此得到廣泛的應(yīng)用[1]。李楊等[2]研究了不同處理?xiàng)l件對(duì)大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）-磷脂酰膽堿相互作用的影響，發(fā)現(xiàn)高壓均質(zhì)具有比超聲更為顯著的效果。大豆蛋白作為植物蛋白的主要來(lái)源，可提供良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性。它不僅具有優(yōu)異的凝膠特性、乳化能力、持水性和持油性，還含有一定的益生成分，可以降低患有高膽固醇、高脂血癥和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[3]。大豆異黃酮（soybean isoflavone，SI）作為一種酚類化合物，是大豆的重要食物成分，其已被證明具有降低與年齡相關(guān)激素疾病風(fēng)險(xiǎn)，包括癌癥、更年期癥狀和骨質(zhì)疏松癥的功能[4]。

蛋白質(zhì)和多酚共存于食品基質(zhì)中，主要通過(guò)疏水相互作用以及氫鍵相互作用締合成復(fù)合物[5]。蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的形成一方面影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和營(yíng)養(yǎng)特性；另一方面，又對(duì)食品中酚類化合物的抗氧化能力和生物利用度產(chǎn)生積極的影響。Chen Gang等[6]研究了SPI與茶多酚在不同高壓條件下的相互作用，發(fā)現(xiàn)SPI溶解度從0.258 mg/mL提高到0.5 mg/mL，乳化活性是天然SPI的3 倍。Ren Cong等[7]研究了熱處理對(duì)SPI-多酚（黑大豆種皮提取物）復(fù)合物的影響，結(jié)果表明多酚有助于抑制SPI熱聚集，并且形成的復(fù)合物顯示出強(qiáng)烈的自由基清除能力。研究發(fā)現(xiàn)，SPI和分離的SI用作膳食補(bǔ)充劑有助于緩解骨質(zhì)疏松癥[8]。近幾年，SI對(duì)幾種慢性疾病的治療與預(yù)防已成為研究的焦點(diǎn)。然而，關(guān)于SPI-SI復(fù)合物特有的物理化學(xué)和功能特性的應(yīng)用還有待探索。

因此，本實(shí)驗(yàn)探討不同均質(zhì)壓力（40、80 MPa和120 MPa）對(duì)不同質(zhì)量比的SPI-SI復(fù)合物結(jié)構(gòu)和功能影響，并確定最佳的處理?xiàng)l件，以更好地了解酚類化合物-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，為SPI-SI復(fù)合物在食品開發(fā)中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)89.21%） 黑龍江哈爾濱農(nóng)業(yè)有限責(zé)任公司；SI（異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%） 上海源葉生物科技有限公司；Lowry法測(cè)定溶解度試劑盒上海荔達(dá)生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 北京新光化工試劑廠；其余試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ULTRA-TURRAX UTL2000高壓均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型有限公司；PHS-3C型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器有限公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GL-20G-II高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Mastersizer 2000激光粒度儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；ZetaPALS-Zeta電位儀 美國(guó)布魯克海文儀器公司；F2000熒光光譜儀 日本日立公司；MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）儀 美國(guó)Thermo儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高壓均質(zhì)處理SPI-SI復(fù)合體系

準(zhǔn)確稱取2 g的SPI以及0.04 g和0.4 g的SI樣品分別分散在100 mL去離子水中，使SPI的質(zhì)量濃度為20 mg/mL，S I 的質(zhì)量濃度分別為0.4 m g/m L 和4 m g/m L。2 5 ℃下攪拌2 h 制備S P I 和S I 溶液，4 ℃下過(guò)夜以完全水合。將SPI溶液與SI溶液混合，并加入NaN3（0.2 mg/mL）以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，pH值調(diào)節(jié)至7.0，使最終樣品含有10 mg/mL SPI和0.2 mg/mL或2 mg/mL SI。以單獨(dú)的SPI（10 mg/mL）作為對(duì)照，分別在均質(zhì)壓力40、80、120 MPa下均質(zhì)2 次，制備出不同的復(fù)合物（表1），置于4 ℃條件下貯藏。將部分溶液凍干，凍干后的樣品置于干燥器中保存。

表1 不同處理樣品編號(hào)Table 1 Numbers of SPI:SI mixtures subjected to high pressure homogenization at different pressures

1.3.2 粒徑分布的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9]的方法，使用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)測(cè)定復(fù)合物的粒度分布。在分析之前，將復(fù)合物在磷酸鈉緩沖液中稀釋1 000 倍，以防止多次散射，復(fù)合物顆粒的折射率為1.46，分散介質(zhì)的折射率為1.33，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.3 Zeta電位的測(cè)定

將復(fù)合物溶液在0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中稀釋1 000 倍，之后將其注入ZetaPALS-Zeta電位儀中進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.4 FTIR分析

參照文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行FTIR分析，將1 mg冷凍干燥樣品與150 mg的KBr粉末混合，壓片后在室溫下記錄FTIR。設(shè)定掃描波數(shù)范圍400～4 000 cm-1，分辨率設(shè)定為4 cm-1，掃描32 次。

1.3.5 紫外光譜分析

參照文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行紫外光譜分析，將復(fù)合物分別溶于0.01 mol/L pH 7. 0磷酸鹽緩沖液，使蛋白質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，波長(zhǎng)范圍在200～400 nm之間，分辨率為0.5 nm，掃描速率為50 nm/min，重復(fù)掃描3 次記錄平均值，經(jīng)Origin 8.5軟件微分化獲得紫外吸收曲線。

1.3.6 熒光光譜分析

參照文獻(xiàn)[12]的方法，使用熒光分光光度計(jì)在25 ℃下進(jìn)行分析。激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為300～500 nm。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

1.3.7 熒光猝滅分析

參照文獻(xiàn)[13]的方法，在SI質(zhì)量濃度為0、1、2、3、4、5 μg/mL，恒定的SPI質(zhì)量濃度（0.5 mg/mL）下分別測(cè)定蛋白質(zhì)內(nèi)在熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為300～500 nm。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

1.3.8 溶解性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[14]測(cè)定SPI溶解性，高壓均質(zhì)處理后，將樣品溶液倒入離心管，然后在25 ℃下12 000×g離心20 min。上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，使用Lowry法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)含量，并以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。蛋白質(zhì)溶解度為上清液中蛋白含量與樣品中總蛋白含量的比例。

1.3.9 表面疏水性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]的方法，使用ANS作為熒光探針測(cè)定復(fù)合物的H0。將樣品分散在磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.2）中，稀釋至0.1～1.0 mg/mL。此后，將10.0 μL 8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）（4 mg/mL）加入到4.0 mL稀釋的蛋白質(zhì)溶液中。使用分光光度計(jì)在370 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和470 nm的發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定熒光強(qiáng)度。通過(guò)線性回歸分析計(jì)算熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度的回歸方程，曲線的初始斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行、重復(fù)測(cè)定3 次，采用SPSS 22.0軟件中方差分析法進(jìn)行差異顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著，通過(guò)Origin 9.1軟件作圖，采用Peak fitting 4.12軟件對(duì)紅外吸收曲線進(jìn)行擬合處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓均質(zhì)對(duì)SPI-SI復(fù)合物粒徑的影響

由圖1可知，對(duì)于添加相同質(zhì)量濃度的SI，復(fù)合物粒徑也隨著均質(zhì)壓力的增加而減小，這是由于較高的壓力導(dǎo)致較高的剪切速率，從而造成粒徑減小。在相同均質(zhì)壓力下，對(duì)于SPI-SI復(fù)合物（1∶0.02），具有較小的粒徑且小于單獨(dú)的SPI，可能主要是SPI在高壓均質(zhì)前保持天然狀態(tài)，并且大多數(shù)疏水結(jié)構(gòu)域埋在核心內(nèi)，高壓導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生解折疊，暴露出疏水氨基酸殘基，并且解開多肽鏈[16]，SPI和SI之間的疏水相互作用大大增強(qiáng)，并且產(chǎn)生了更緊湊的復(fù)合物，這可以通過(guò)FTIR結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)；對(duì)于SPI-SI復(fù)合物（1∶0.2），復(fù)合物顆粒尺寸較大，且分布范圍寬，這可能是SI的質(zhì)量濃度過(guò)高，使得兩個(gè)肽分子形成了SI包被的二聚體，形成的聚集體導(dǎo)致顆粒尺寸輕微增大。O’sullivan等[17]研究乳清蛋白與綠茶多酚復(fù)合時(shí)發(fā)現(xiàn)，復(fù)合物顯示尺寸隨著多酚濃度的增加而增加。這種現(xiàn)象可以解釋為多酚可以作為蛋白質(zhì)分子的橋接劑，隨著多酚濃度的增加，導(dǎo)致形成更大的復(fù)合物。

圖1 不同高壓均質(zhì)條件下SPI和SPI-SI復(fù)合物的粒徑分布Fig. 1 Particle size distribution of SPI and SPI-SI complex under different homogenization pressures

圖2為不同高壓均對(duì)體積平均粒徑（D[4,3]）的影響。隨著均質(zhì)壓力的增加，樣品粒徑減小，其中HP-6具有最小的D[4,3]，為182.8 μm。在相同均質(zhì)壓力條件下，SPI-SI（1∶0.02）復(fù)合物顯示出較小的D[4,3]，這與粒徑分布結(jié)果一致。

圖2 不同高壓均質(zhì)條件下SPI和SPI-SI復(fù)合物的D[4,3]Fig. 2 D[4,3] of SPI and SPI-SI complexes under different homogenization pressures

2.2 高壓均質(zhì)對(duì)SPI-SI復(fù)合物Zeta電位的影響

圖3 不同高壓均質(zhì)條件下SPI和SPI-SI復(fù)合物的Zeta電位Fig. 3 Zeta potential of SPI and SPI-SI compounds under different homogeneous pressures

膠體顆粒表面的電荷是評(píng)判懸浮顆粒分散和聚集的重要指標(biāo)。具有低電位絕對(duì)值的聚合物傾向于凝聚或絮凝，而具有高電位絕對(duì)值的溶液是穩(wěn)定的[18]。圖3顯示了不同高壓均質(zhì)條件下處理SPI和SPI-SI復(fù)合物的Zeta電位。對(duì)于單獨(dú)的SPI，經(jīng)40 MPa高壓均質(zhì)處理后，Zeta電位絕對(duì)值約為3.24 mV。當(dāng)壓力增加到120 MPa時(shí)，Zeta電位絕對(duì)值達(dá)到最大值7.51 mV。高壓均質(zhì)處理SPI Zeta電位絕對(duì)值顯著提高，表明具有更大的電負(fù)性。

通過(guò)添加SI進(jìn)一步增加了復(fù)合物的Zeta電位絕對(duì)值。結(jié)果表明，SI可能包圍蛋白質(zhì)分子表面，改變了蛋白質(zhì)的表面電荷分布，進(jìn)一步增強(qiáng)了顆粒間的靜電排斥，導(dǎo)致膠體聚集體破壞，防止進(jìn)一步聚集，提高了分散體的穩(wěn)定性。在120 MPa下，Zeta電位絕對(duì)值降低，可能是由于蛋白質(zhì)溶解度的降低。當(dāng)SI質(zhì)量濃度增加至0.2 mg/mL時(shí)，觀察到Zeta電位絕對(duì)值出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，這種趨勢(shì)可能是由于在均質(zhì)過(guò)程中電荷重排，SPI聚集體的形成引起一些帶電基團(tuán)可能埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部并且對(duì)表面電荷沒(méi)有貢獻(xiàn)[19]。

2.3 復(fù)合物FTIR分析結(jié)果

圖4 不同高壓均質(zhì)條件下SPI和SPI-SI復(fù)合物的FTIR圖Fig. 4 FTIR spectra of SPI and SPI-SI complex under differenthomogenization pressures

表2 不同高壓均質(zhì)下的SPI和SPI-SI二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Table 2 Relative contents of secondary structures in SPI and SPI-SI complex under different homogenization pressures

蛋白質(zhì)的紅外光譜擁有多個(gè)特征吸收譜區(qū)域組成，其中酰胺I區(qū)波數(shù)范圍是1 600～1 700 cm-1。主要由C＝O伸縮振動(dòng)引起，其主要對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)敏感[20]。高壓均質(zhì)處理后，SPI的FTIR光譜圖如圖4所示，F(xiàn)TIR光譜可以靈敏地反映肽鏈結(jié)構(gòu)的變化。根據(jù)FTIR數(shù)據(jù)擬合過(guò)程的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化如表2所示。從40 MPa升高到80 MPa時(shí)，α-螺旋相對(duì)含量降低（HP-7和HP-8除外），β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量顯著下降，β-折疊相對(duì)含量逐漸升高。α-螺旋是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，其含量降低表明適宜的高壓均質(zhì)壓力可以改變蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)變得更加拉伸，可能會(huì)影響SPI與其他物質(zhì)的結(jié)合程度。據(jù)報(bào)道，β-折疊含量的增加表明負(fù)責(zé)疏水相互作用的蛋白質(zhì)位點(diǎn)暴露，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性的增強(qiáng)[21]，這在蛋白質(zhì)表面疏水性分析中得到進(jìn)一步證實(shí)。但在120 MPa下，呈現(xiàn)α-螺旋含量升高（HP-7和HP-8除外），β-轉(zhuǎn)角含量顯著上升。這種現(xiàn)象表明高壓均質(zhì)處理處理改變了SPI的氫鍵，導(dǎo)致不同二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的轉(zhuǎn)化。

2.4 復(fù)合物溶液紫外光譜分析結(jié)果

圖5 不同高壓均質(zhì)條件下SPI和SPI-SI復(fù)合物的紫外光譜（A）和最大吸光度（B）Fig. 5 Ultraviolet spectra (A) and maximum absorbance (B) of SPI and SPI-SI complex under different homogenization pressures

色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和含硫氨基酸在230～310 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有吸收峰。其中，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸由于其不同的顏色組而具有不同的吸收光譜。色氨酸和酪氨酸殘基的共軛雙鍵在280 nm波長(zhǎng)處具有吸收峰[22]。如圖5B所示，隨著均質(zhì)壓力的增加，樣品的最大吸光度下降，這可能是由于高壓均質(zhì)處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生解折疊，使更多的發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)表面，從而降低紫外吸收。隨著SI質(zhì)量濃度的增加，紫外吸收光譜最大吸收峰從254 nm到262 nm，發(fā)生了紅移（圖5A），說(shuō)明蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了變化。這可能是由于SPI和SI的相互作用影響了蛋白質(zhì)分子的微環(huán)境，使更多芳香族氨基酸殘基附近微環(huán)境親水性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致不同高壓均質(zhì)處理SPI-SI復(fù)合物結(jié)構(gòu)的不同。此外，可以推測(cè)SPI-SI的猝滅機(jī)理是靜態(tài)猝滅，因?yàn)閯?dòng)態(tài)猝滅僅影響猝滅分子的激發(fā)態(tài)，而不會(huì)改變猝滅物質(zhì)的吸收光譜[23]。

2.5 復(fù)合物溶液熒光光譜分析結(jié)果

圖6 不同高壓均質(zhì)條件下SPI和SPI-SI復(fù)合物的熒光光譜Fig. 6 Fluorescence spectra of SPI and SPI-SI complex under different homogenization pressures

內(nèi)源性熒光特性是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)內(nèi)部含有不同的發(fā)色基團(tuán)，主要是芳香族氨基酸，常用于監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的變化。當(dāng)在280 nm波長(zhǎng)處激發(fā)時(shí)，蛋白質(zhì)的熒光光譜主要?dú)w因于Tyr和Trp殘基的熒光發(fā)射[24]。圖6為高壓均質(zhì)處理后SPI和SPI-SI復(fù)合物的熒光光譜。與40 MPa相比，均質(zhì)壓力為120 MPa明顯降低了SPI的熒光強(qiáng)度，已有研究已經(jīng)證明Lys、His和Cys殘基具有猝滅Trp和Tyr殘基熒光的能力[25]，高壓均質(zhì)處理可使這些殘基更接近Trp和Tyr殘基。另外本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著壓力增加，導(dǎo)致最大波長(zhǎng)發(fā)生輕微的紅移，這些結(jié)果表明，SPI中Trp和Tyr殘基附近微環(huán)境親水性增強(qiáng)，高壓均質(zhì)也改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象。

蛋白質(zhì)熒光的變化與Trp周圍氨基酸殘基的移動(dòng)有關(guān)。如圖6所示，與單獨(dú)SPI相比，高壓均質(zhì)處理后SPI-SI的熒光強(qiáng)度明顯降低，證實(shí)了SI對(duì)熒光的猝滅作用，可能由于高壓均質(zhì)處理使更多的Try和Tyr殘基暴露，從而增強(qiáng)了與SI的芳香環(huán)的疏水相互作用，這導(dǎo)致Trp和Tyr熒光的更強(qiáng)猝滅。另外，隨著SI質(zhì)量濃度的增加，熒光強(qiáng)度明顯下降，可能是經(jīng)過(guò)高壓均質(zhì)處理產(chǎn)生的松散肽處于熱力學(xué)不穩(wěn)定狀態(tài)并且傾向于通過(guò)疏水相互作用與更多SI締合，從而具有較高的聚集程度，這可以從顆粒尺寸中證實(shí)[26]。很明顯，添加SI后，復(fù)合物的最大峰位置略微紅移，表明Trp和Tyr處于極性更強(qiáng)的環(huán)境，這可能與壓力引起的SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)，或者可能歸因于SI分子中的苯環(huán)[27]。

2.6 熒光猝滅機(jī)理分析

根據(jù)Stern-Volmer方程（式（1））計(jì)算不同溫度條件下的猝滅常數(shù)，從而可以初步判斷該反應(yīng)的熒光猝滅機(jī)制。

式中：F0和F分別是SPI中未加入和加入猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度；[Q]是猝滅劑質(zhì)量濃度/（μg/mL）；KSV是猝滅常數(shù)/（L/mol）；Kq是雙分子猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s））；τ0為不存在猝滅劑時(shí)熒光體的壽命，生物大分子的平均壽命約為10-8s[8]。

因此，可通過(guò)F0/F對(duì)[Q]的線性回歸確定KSV。熒光猝滅可進(jìn)一步分類為動(dòng)態(tài)或靜態(tài)猝滅。對(duì)于靜態(tài)猝滅，猝滅數(shù)據(jù)可以根據(jù)修改的Stern-Volmer方程（式（2））來(lái)分析。

式中：fa是蛋白質(zhì)（熒光基團(tuán)）是可接近熒光的分?jǐn)?shù)；Ka是可獲得熒光基團(tuán)的猝滅常數(shù)/（L/mol），其可作為猝滅劑和受體之間的結(jié)合常數(shù)。

通過(guò)F0/（F0-F）和1/[Q]之間的線性回歸，能夠確定1/faKa（斜率）和1/fa（截距），因此可求得Ka。

圖7 不同均質(zhì)壓力下SI對(duì)SPI的熒光光譜影響Fig. 7 Fluorescence spectra of SPI-SI complex under different homogenization pressures

熒光猝滅法用于進(jìn)一步研究SPI和SI之間的結(jié)合反應(yīng)。蛋白質(zhì)的固有熒光光譜對(duì)疏水性殘基發(fā)色團(tuán)（例如Trp或Tyr）的環(huán)境變化非常敏感，在280 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，蛋白質(zhì)的固有熒光發(fā)射主要來(lái)自其Trp殘基[22]。如圖7所示，可以看出在沒(méi)有SI存在時(shí)，樣品顯示出最強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。隨著SI的質(zhì)量濃度增加，SPI的最大熒光強(qiáng)度逐漸降低，且出現(xiàn)明顯的紅移，表明SPI與SI之間存在明顯的相互作用，SPI空間構(gòu)象發(fā)生改變。紅移表明Trp殘基微環(huán)境親水性增強(qiáng)。在SPI-花青素相互作用和SPI-白藜蘆醇相互作用中也觀察到類似的熒光現(xiàn)象[13,28]。

表3 SPI-SI復(fù)合物的熒光猝滅速率常數(shù)、雙分子猝滅速率常數(shù)、結(jié)合常數(shù)Table 3 Fluorescence quenching constants, bimolecular quenching rate constant and binding constants of SPI-SI complex

根據(jù)Stern-Volmer方程，研究在不同均質(zhì)壓力下，SI猝滅SPI的程度。一般來(lái)說(shuō)，各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)Kq為2×1010L/（mol·s）[8]，本研究中40、80、120 MPa下Kq分別為2.74×1013、2.55×1013、2.34×1013L/（mol·s），均高于最大動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)（表3）。這表明SPI和SI之間的猝滅過(guò)程主要是由于相互作用形成了復(fù)合物而引發(fā)了靜態(tài)猝滅。從圖7中插圖可以觀察到，在不同均質(zhì)壓力下，F(xiàn)0/（F0-F）對(duì)1/[Q]的圖形呈良好的線性關(guān)系（R2＝0.991 2～0.997 6）。圖中曲線呈線性關(guān)系意味著所有猝滅劑分子（如本實(shí)驗(yàn)中SI）均勻地進(jìn)入蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)。此外，通過(guò)修改的Stern-Volmer等式計(jì)算猝滅常數(shù)Ka，其大小反映猝滅劑對(duì)熒光基團(tuán)的接觸程度和反應(yīng)速度[28]。80 MPa下Ka均高于40 MPa和120 MPa下Ka，表明經(jīng)過(guò)均質(zhì)壓力為80 MPa處理的SPI使其與SI接觸程度更高，有利于形成SPI-SI復(fù)合物。

2.7 復(fù)合物溶解性分析結(jié)果

圖8 不同高壓均質(zhì)條件下SPI和SPI-SI復(fù)合物的溶解度Fig. 8 Solubility of SPI and SPI-SI complex under different homogenization pressures

溶解度是蛋白質(zhì)變性和聚集的最實(shí)用的量度，因此是蛋白質(zhì)功能的良好指標(biāo)。高壓均質(zhì)處理后，所有樣品的溶解度均得到改善（天然SPI溶解度約為40%）[29]，并在80 MPa時(shí)達(dá)到最大值。對(duì)這種現(xiàn)象的解釋是高壓均質(zhì)處理可以減小SPI的粒徑，使蛋白質(zhì)分子的表面區(qū)域變大，從而增加蛋白質(zhì)-水相互作用，進(jìn)而提高蛋白質(zhì)的溶解度[30]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)溶解度增加可能是暴露的基團(tuán)通過(guò)氫鍵與水相互作用造成的[20]。然而，SPI在120 MPa下的溶解度略低于在80 MPa下的（圖8），這可能是均質(zhì)過(guò)程中產(chǎn)生的熱量導(dǎo)致蛋白質(zhì)部分變性和聚集體形成。SI質(zhì)量濃度較低時(shí)，溶解度得到改善，當(dāng)質(zhì)量濃度進(jìn)一步增加至2 mg/mL時(shí)，導(dǎo)致溶解度降低。這些結(jié)果表明，SI具有增加蛋白質(zhì)溶解度的能力。高壓處理改變了SPI的性質(zhì)，其與構(gòu)象變化相關(guān)，例如疏水基團(tuán)的暴露，SPI的疏水性明顯增強(qiáng)。因此，帶電基團(tuán)可以在蛋白質(zhì)表面上重新分布，這將影響基團(tuán)電離。同時(shí)，SPI分子部分展開，更容易與SI發(fā)生疏水相互作用和氫鍵作用，這將改變蛋白質(zhì)的電位。高溶解度歸因于疏水殘基的數(shù)量少和電荷升高。因此，SI的添加可以明顯改善高壓均質(zhì)處理的SPI的性質(zhì)。

2.8 復(fù)合物表面疏水性分析結(jié)果

圖9 不同高壓均質(zhì)條件下SPI和SPI-SI復(fù)合物的表面疏水性Fig. 9 Surface hydrophobicity of SPI and SPI-SI complex under different homogenization pressures

蛋白質(zhì)表面疏水性表征與極性溶劑接觸蛋白質(zhì)表面上疏水基團(tuán)數(shù)量，用于評(píng)估蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的結(jié)構(gòu)特征之一，并且與其功能性質(zhì)密切相關(guān)[31]。如圖9所示，高壓均質(zhì)處理后H0明顯增加。H0的增加是由大蛋白質(zhì)聚集體的破壞引起的，其誘導(dǎo)埋藏的疏水基團(tuán)的暴露。H0從40 MPa逐漸增加到80 MPa，并在80 MPa下達(dá)到最大值。當(dāng)壓力升至120 MPa時(shí)，H0與80 MPa相比減弱。這可能是經(jīng)高壓均質(zhì)處理引起的空化現(xiàn)象使SPI分子發(fā)生一定程度的展開，因此增加了疏水基團(tuán)的數(shù)量以及最初在SPI分子內(nèi)暴露于外部環(huán)境的區(qū)域，但其中一些聚集體會(huì)在較高壓力下發(fā)生疏水相互作用而重新聚集。這與文獻(xiàn)[32]所報(bào)道高壓處理后乳清蛋白的疏水性增加相似。對(duì)于低質(zhì)量濃度SI樣品的H0高于無(wú)SI樣品，表明SI促進(jìn)ANS與蛋白質(zhì)表面的疏水位點(diǎn)的結(jié)合。SI質(zhì)量濃度增大，表面疏水性的降低可能是SPI構(gòu)象發(fā)生變化造成的，SPI與SI形成分子間相互作用和聚集，會(huì)使疏水基團(tuán)逐漸埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部[24]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究不同均質(zhì)壓力對(duì)不同比例SPI-SI復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能的影響。均質(zhì)壓力為80 MPa、SI質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)，Zeta電位絕對(duì)值、蛋白質(zhì)溶解度和表面疏水性分別增加了6.18 mV、28%和33%。同時(shí)，提高均質(zhì)壓力顯著降低了復(fù)合物的粒徑。通過(guò)分析FTIR、紫外光譜、熒光光譜變化發(fā)現(xiàn)，SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，隨著壓力的增加，α-螺旋相對(duì)含量先減少后增加，β-折疊相對(duì)含量先增加后減少，芳香族氨基酸殘基附近微環(huán)境親水性增強(qiáng)。這表明高壓均質(zhì)會(huì)影響SPI-SI之間相互作用，適度的壓力和低質(zhì)量濃度的SI有利于提高復(fù)合物的功能特性。功能特性的變化可以滿足食品工業(yè)中制成復(fù)雜食品的需求，但需要進(jìn)一步研究以了解其具體機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供一定的指導(dǎo)。