張舒晴，劉圣勇,，馬 鵬

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)村可再生能源新材料與裝備重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；3.鄭州工程技術(shù)學(xué)院生物質(zhì)高值利用研發(fā)中心，河南 鄭州 450044）

我國(guó)是畜禽養(yǎng)殖大國(guó)，2018年全年肉類總產(chǎn)量8 517萬(wàn) t[1]，約產(chǎn)生2 668.75萬(wàn) t的畜禽骨副產(chǎn)品，除去可直接食用的部分，如排骨、腔骨，剩余的絕大部分骨頭若無(wú)法充分利用，則會(huì)造成巨大的骨骼資源浪費(fèi)[2-3]。畜禽骨主要由水分、無(wú)機(jī)鹽（鈣和磷等）、蛋白質(zhì)以及脂肪組成。其中蛋白質(zhì)與鈣、磷等無(wú)機(jī)鹽含量較高，包含多種人體所需氨基酸及微量元素，而軟骨素及骨膠原等營(yíng)養(yǎng)組分則多存在于骨髓中[3-5]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)畜禽骨的利用主要分為兩個(gè)方面：一是作為骨類食品的原料，如骨素[6-7]、骨粉[8-9]、骨油[9-10]、骨湯[11-12]等；二是制備羥基磷灰石[13-15]。在對(duì)畜禽骨進(jìn)行深加工和利用之前，通常需要將其粉碎或軟化，而這一步驟很大程度上增加了成本，從而阻礙了畜禽骨加工利用的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。若能有某種方法或工藝使畜禽骨硬度降低，甚至直接變?yōu)榉勰┗蛞后w，方便下一步的深加工，則畜禽骨的利用率應(yīng)會(huì)上升。邱志超[16]、王陽(yáng)光[17]、吳克剛[18]等研究了高壓和酸處理對(duì)魚骨硬度的影響，結(jié)果表明高壓和酸處理使魚骨的硬度顯著下降；柴向華等[19]研究了高溫蒸煮對(duì)雞骨的影響，結(jié)果表明在0.12 MPa下蒸煮45 min最佳；劉建華等[20]研究了高溫水煮和酸煮對(duì)豬骨硬度及化學(xué)成分的影響，結(jié)果表明豬骨硬度的顯著下降出現(xiàn)在高溫水煮或酸煮40 min后；張崟[21]、張婷[22]、陳麗堯[23]等研究了豬骨超微粉碎工藝，提高了粉碎率，而處理時(shí)間則在60 min左右；Boutinguiza等[13]將魚骨在600 ℃的高溫下煅燒12 h后得到了羥基磷灰石；Ooi等[14]的研究結(jié)果表明，2 h的600 ℃退火處理可將牛骨中的有機(jī)物完全去除；Barakat等[15]對(duì)比了3 種從牛骨中提取羥基磷灰石的方法：亞臨界水法需要將反應(yīng)器在250 ℃的硅油中加熱1 h；堿熱水解法需要在250 ℃的環(huán)境下持續(xù)5 h；熱分解法則需要持續(xù)加熱1 h。上述的處理方法雖然能有效地使畜禽骨軟化、粉碎或改變其成分，但都存在對(duì)溫度要求過(guò)高及耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)的缺點(diǎn)。

蒸汽爆破技術(shù)因其粉碎效果好、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)多作為預(yù)處理技術(shù)應(yīng)用于以植物為原料的研究。隋文杰等[24]對(duì)汽爆過(guò)程進(jìn)行了解析，汽爆以水作為介質(zhì)，充滿物料的孔隙，而在泄壓瞬間，物料孔隙內(nèi)液態(tài)水發(fā)生閃蒸而高壓蒸氣體積急劇膨脹對(duì)外做功，對(duì)物料起到物理撕裂作用從而破壞物料結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)將蒸汽爆破技術(shù)應(yīng)用于牛骨處理研究，研究在不同的參數(shù)條件下，蒸汽爆破對(duì)于畜禽骨的理化特性的影響，為制備牛骨類食品及羥基磷灰石提供新的前處理技術(shù)與理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛腿骨由河南伊賽牛肉有限公司提供。

六偏磷酸鈉、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、亞甲基藍(lán)指示劑、氫氧化鈉、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、高氯酸、氧化鑭、對(duì)苯二酚、無(wú)水亞硫酸鈉、鉬酸銨、氯化亞錫、硫酸肼（均為分析純）、硫酸、硝酸、鹽酸、高氯酸（均為優(yōu)級(jí)純） 阿法埃莎（中國(guó)）化學(xué)有限公司；溴化鉀（光譜純） 德國(guó)Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QBS-80B蒸汽爆破裝置 鶴壁正道生物能源有限公司；101-3AS鼓風(fēng)干燥箱 鄭州安晟科學(xué)儀器有限公司；Mastersize 2000激光粒徑分析儀 英國(guó)馬爾文公司；TA.XT.Plus物性測(cè)試儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；K130全自動(dòng)凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司；Nicoleti S10傅里葉變換紅外光譜儀美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；AA-6300C原子吸收分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)前處理

將牛腿骨剔除骨髓及表面殘留的碎肉、筋、膜等組織后，切成長(zhǎng)、寬約為5 cm的塊狀，隨機(jī)分為25 組后，放入蒸汽爆破裝置，分別在不同的壓強(qiáng)（1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 MPa）和保壓時(shí)間（100、300、500、700、900 s）下進(jìn)行爆破處理。

根據(jù)汽爆后樣品的形態(tài)，將其分為全固態(tài)（即樣品維持原本的尺寸與形狀或破碎的樣品，質(zhì)量不超過(guò)樣品總質(zhì)量的10%）、半固態(tài)、全液態(tài)（指未有直徑大于1 mm的固體顆粒，即可通過(guò)18 目的篩網(wǎng)）。

將全固態(tài)及半固態(tài)樣品中的未完全破碎的塊狀物進(jìn)行硬度、鈣、磷及粗蛋白含量的測(cè)定，以及傅里葉變換紅外光譜分析，探究蒸汽爆破前后牛骨硬度、鈣、磷、粗蛋白含量及官能團(tuán)的變化。液態(tài)樣品與半固態(tài)樣品（破碎的樣品質(zhì)量＞處理前總質(zhì)量的60%）在測(cè)定粒徑后，分別使用紗布進(jìn)行過(guò)濾，分析不同爆破參數(shù)對(duì)樣品粒徑的影響。對(duì)過(guò)濾后的固體顆粒進(jìn)行鈣、磷及粗蛋白含量的測(cè)定，以及傅里葉變換紅外光譜分析；液體用于鈣釋放率的測(cè)定，分析不同爆破參數(shù)對(duì)鈣釋放率的影響。所有指標(biāo)的檢測(cè)均重復(fù)3 次，鈣、磷及蛋白質(zhì)含量均為干基含量。

1.3.2 粒度的測(cè)定

使用激光粒徑分析儀進(jìn)行濕法測(cè)定樣品的粒度（假設(shè)樣品顆粒為球形）。參考Yin Tao等[25]的方法并略作改動(dòng)。使用離子水將樣品中固體的質(zhì)量濃度調(diào)整至1 g/100 mL，使用質(zhì)量濃度為0.2 g/100 mL的六偏磷酸鈉為分散劑。

1.3.3 硬度的測(cè)定

采用TA.XT.Plus物性測(cè)試儀進(jìn)行樣品的硬度測(cè)定。參考丘志超[16]與劉建華[20]等的方法，探頭：HDP/BS，測(cè)試前速率：1.5 mm/s；測(cè)試速率：2.0 mm/s；測(cè)試后速率：10.0 mm/s；下壓距離：strain 90%。記錄峰值讀數(shù)，單位為g。

1.3.4 粗蛋白含量的測(cè)定

按照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[26]中的凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，其中蛋白質(zhì)的換算系數(shù)為6.25。

1.3.5 鈣及磷含量的測(cè)定

鈣含量的測(cè)定：按照GB 5009.92—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鈣的測(cè)定》[27]中火焰原子吸收光譜法測(cè)定鈣含量。

磷含量的測(cè)定：按照GB 5009.87—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中磷的測(cè)定》[28]中鉬藍(lán)分光光度法測(cè)定磷含量。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

采用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定牛骨紅外吸收?qǐng)D譜，采用溴化鉀壓片法進(jìn)行壓片，將經(jīng)過(guò)干燥的試樣與溴化鉀在瑪瑙研缽中研細(xì)，置于模具中并在壓片機(jī)上壓成透明薄膜進(jìn)行測(cè)定，具體參數(shù)為：測(cè)試分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為40 次，測(cè)試范圍為400～4 000 cm-1。

1.3.7 鈣釋放率的測(cè)定

取過(guò)濾后的液體樣品加入離子水定容后，過(guò)0.45 μm濾膜并進(jìn)行稀釋。將稀釋液放入原子吸收分光光度計(jì)進(jìn)行鈣含量的測(cè)定。鈣的釋放率為可溶性鈣含量占樣品中鈣的總含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用Origin 2018軟件進(jìn)行匯總與作圖，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析（單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著）。所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒸汽爆破條件對(duì)牛骨粒度的影響

蒸汽爆破后液態(tài)樣品與部分半固態(tài)樣品的平均粒徑如表1所示。當(dāng)壓強(qiáng)一定時(shí)，牛骨的平均粒徑隨著蒸汽爆破時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著減?。≒＜0.05）。骨皮質(zhì)由無(wú)機(jī)相、有機(jī)相及水組成，其中有機(jī)物組成排列緊密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使骨骼具有韌性，而無(wú)機(jī)物則填充進(jìn)入有機(jī)物形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，保證了骨骼硬度的同時(shí)也使骨骼具有抵抗外力破壞的能力[29]。蒸汽爆破技術(shù)通過(guò)加壓的方式提升物料箱內(nèi)溫度，通過(guò)骨膠原蛋白的變性與降解，破壞其形成的致密的有序網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而使骨骼易碎。氣體在保壓期間滲入骨骼的孔隙，在泄壓的瞬間爆破，從而達(dá)到粉碎骨骼的目的。

表1 不同蒸汽爆破條件下的牛骨平均粒徑Table 1 Average particle size of bovine bones subjected to steam explosion with different processing parameters

圖1 不同蒸汽爆破條件下牛骨的粒徑分布Fig. 1 Particle size distribution of bovine bones subjected to steam explosion with different processing parameters

圖1表示不同蒸汽爆破條件下牛骨的粒徑分布。隨著壓強(qiáng)的增大與時(shí)間的延長(zhǎng)，氣體更加充分地滲入骨骼，使爆破的牛骨粒徑縮小并且分布的范圍集中。

2.2 蒸汽爆破條件對(duì)牛骨硬度的影響

不同壓強(qiáng)與時(shí)間下，蒸汽爆破對(duì)牛骨硬度的影響及變化趨勢(shì)如圖2所示。就整體趨勢(shì)而言，牛骨硬度隨壓強(qiáng)的增大與時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，牛骨硬度顯著下降（P＜0.05）；隨著壓強(qiáng)的上升，牛骨硬度顯著下降（P＜0.05）。相較于壓強(qiáng)變化帶來(lái)的影響而言，時(shí)間對(duì)牛骨硬度的變化更為敏感。同時(shí)增加壓強(qiáng)并延長(zhǎng)時(shí)間，有助于加速牛骨的軟化，二者有協(xié)同作用。牛骨由蛋白質(zhì)等有機(jī)質(zhì)及碳酸鈣等無(wú)機(jī)質(zhì)組成，二者相互支撐共同維持骨的結(jié)構(gòu)。其中羥基磷灰石及無(wú)定形的碳酸鈣及磷酸鈣作為無(wú)機(jī)質(zhì)的主要存在形式，為牛骨提供硬度，使其質(zhì)地堅(jiān)硬[26]。因此，牛骨中有機(jī)物的變性以及無(wú)機(jī)物的析出導(dǎo)致牛骨成分及結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響牛骨的機(jī)械強(qiáng)度與形態(tài)。

圖2 不同蒸汽爆破條件對(duì)牛骨硬度的影響Fig. 2 Effect of pressure and holding time for steam explosion on hardness of bovine bones

2.3 蒸汽爆破條件對(duì)牛骨中蛋白質(zhì)含量的影響

圖3 不同蒸汽爆破條件下牛骨蛋白質(zhì)含量隨保壓時(shí)間（A）及壓強(qiáng)（B）的變化Fig. 3 Effect of holding time (A) and pressure (B) for steam explosion on protein content of bovine bones

選取在壓強(qiáng)1.6 MPa、時(shí)間500 s的牛骨與新鮮牛骨（對(duì)照組）進(jìn)行對(duì)比，其蛋白質(zhì)含量（20.7±1.5）g/100 g明顯低于新鮮牛骨（26.1±0.1）g/100 g。

不同壓強(qiáng)條件與時(shí)間對(duì)牛骨蛋白質(zhì)含量的影響如圖3所示，總體來(lái)看，蛋白質(zhì)含量隨著壓強(qiáng)的增加與時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。其中，圖3A以1.6 MPa為分界線，1.2 MPa與1.4 MPa的趨勢(shì)相近，1.8 MPa與2.0 MPa的趨勢(shì)相近。在1.2 MPa與1.4 MPa壓強(qiáng)下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)含量分別呈下降趨勢(shì)；而在1.8 MPa與2.0 MPa壓強(qiáng)下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)至500 s，蛋白質(zhì)含量急速下降，而時(shí)間大于500 s時(shí)，蛋白質(zhì)含量下降速率減緩并逐漸趨于平緩。在不同的時(shí)間條件下，蛋白質(zhì)含量隨壓強(qiáng)增大而降低（圖3B）。

2.4 蒸汽爆破條件對(duì)牛骨中鈣、磷含量的影響

不同壓強(qiáng)條件與時(shí)間對(duì)牛骨鈣、磷含量的影響如圖4所示，總體來(lái)看，蒸汽爆破對(duì)牛骨固體中鈣、磷含量影響相似，呈現(xiàn)出的趨勢(shì)均為隨著壓強(qiáng)的增大與時(shí)間的延長(zhǎng)而減小。相較于蛋白質(zhì)含量的減少量（g/100 g），鈣、磷含量的減少量（mg/g）小了一個(gè)量級(jí)，說(shuō)明蒸汽爆破對(duì)牛骨中有機(jī)物含量的影響遠(yuǎn)大于對(duì)無(wú)機(jī)物的影響[29]。

圖4 不同蒸汽爆破條件下牛骨鈣含量（A）及磷含量（B）的變化Fig. 4 Effect of pressure and holding time for steam explosion on calcium (A) and phosphorus (B) contents of bovine bones

牛骨中的鈣大多存在于組成牛骨的無(wú)機(jī)物中，而無(wú)機(jī)物則與形成致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的有機(jī)物有機(jī)結(jié)合，通常難以溶出[30]。由圖5可知，隨著壓強(qiáng)的增大與時(shí)間的延長(zhǎng)，鈣離子的釋放率顯著增加（P＜0.05），這與牛骨中有機(jī)物形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞、無(wú)機(jī)物被裸露釋放有關(guān)[25]。900 s后，5 種蒸汽爆破壓強(qiáng)下產(chǎn)生的骨液中鈣的釋放率與100 s后鈣的釋放率相比提高了近3 倍。骨液的鈣釋放率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加，這與李亞杰等[31]在研究納米骨液制品性質(zhì)中的結(jié)果相似，其原因可能與蒸汽爆破過(guò)程中也產(chǎn)生了可溶性的氨基酸有關(guān)，但還需進(jìn)一步研究。

圖5 不同的蒸汽爆破條件下牛骨鈣釋放率隨保壓時(shí)間（A）及保壓時(shí)間與壓強(qiáng)共同作用（B）的變化Fig. 5 Effect of holding time (A) and its interaction with pressure (B)for steam explosion on calcium release from bovine bones

2.5 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

圖6 不同壓強(qiáng)條件與保壓時(shí)間下牛骨的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 6 FTIR spectra of bovine bones subjected to steam explosion under different pressures and holding times

不同壓強(qiáng)與時(shí)間下的牛骨紅外吸收光譜與羥基磷灰石的傅里葉變換紅外光譜如圖6所示，與美國(guó)自然博物館收藏的天然羥基磷灰石[32]的傅里葉變換紅外圖譜相似。以壓強(qiáng)1.2 MPa、時(shí)間100 s為例，相對(duì)于羥基磷灰石，牛骨的傅里葉變換紅外光譜圖上的峰較多，因?yàn)榕９侵胁坏袩o(wú)機(jī)物，還含有有機(jī)物。單就牛骨而言，隨著壓強(qiáng)的增大和時(shí)間的延長(zhǎng)，牛骨內(nèi)物質(zhì)隨著蒸汽爆破而流失，因此傅里葉變換紅外光譜圖的峰逐漸清晰。在1 034 cm-1處的峰位屬于v3 PO43-反對(duì)稱拉伸振動(dòng)峰，在960 cm-1處的峰位屬于v1 PO43-對(duì)稱拉伸振動(dòng)峰，在603 cm-1處的峰位屬于v4 PO43-反對(duì)稱彎曲振動(dòng)峰，在563 cm-1處的峰位屬于v2 PO43-對(duì)稱彎曲振動(dòng)峰[33-34]；在1 456、1 416 cm-1處及871 cm-1處的峰位屬于v2 CO32-振動(dòng)峰，是B型碳酸磷灰石（被取代）的特征[35]；的3 個(gè)特征吸收峰與的2 個(gè)特征吸收峰在圖中的位置無(wú)明顯差異，說(shuō)明蒸汽爆破對(duì)牛骨中的羥基磷灰石及其官能團(tuán)無(wú)明顯影響。在2 961 cm-1處的峰位屬于C—H基團(tuán)伸縮振動(dòng)峰，代表牛骨中有機(jī)物[36]。在1 659 cm-1處的峰位屬于C＝O基團(tuán)的伸縮振動(dòng)峰，與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化相關(guān)[37]。在未處理牛骨的紅外光譜圖中1 544 cm-1處的峰位處于酰胺II帶，是N—H彎曲振動(dòng)和C—N伸縮振動(dòng)引起的吸收峰[36]，代表骨膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)中氫鍵結(jié)構(gòu)的存在，而在處理后的牛骨中未見此峰位，因此可判斷蒸汽爆破對(duì)骨膠原蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)有破壞作用。對(duì)比不同壓強(qiáng)和時(shí)間下的牛骨紅外光譜圖還可以發(fā)現(xiàn)，高壓強(qiáng)和長(zhǎng)時(shí)間下的牛骨紅外吸收峰強(qiáng)度明顯小于低壓強(qiáng)和短時(shí)間下的牛骨，說(shuō)明汽爆過(guò)程中增壓或延長(zhǎng)時(shí)間可以降低牛骨中有機(jī)物含量。此外，隨著壓強(qiáng)的增大及時(shí)間的延長(zhǎng)，有機(jī)物及水的吸收強(qiáng)度降低，蒸汽爆破后固態(tài)牛骨的紅外光譜圖趨近于羥基磷灰石，說(shuō)明汽爆可以有效地破壞骨蛋白螺旋結(jié)構(gòu)，改變牛骨成分，使牛骨內(nèi)有機(jī)物質(zhì)流失析出，并可作為利用畜禽骨制備羥基磷灰石的一種手段。

3 結(jié) 論

蒸汽爆破對(duì)牛骨硬度及化學(xué)成分的影響結(jié)果表明，蒸汽爆破后的固態(tài)牛骨硬度隨著汽爆參數(shù)的增大而顯著下降（P＜0.05），因此，增大壓強(qiáng)及延長(zhǎng)時(shí)間更有利于牛骨的軟化及碎化；蒸汽爆破后的固態(tài)牛骨中多種物質(zhì)含量下降，其中蛋白質(zhì)含量顯著降低（P＜0.05）；隨著壓強(qiáng)的增大與時(shí)間的延長(zhǎng)，固態(tài)牛骨的紅外吸收光譜愈發(fā)趨近于羥基磷灰石晶體的傅里葉變換紅外光譜圖。蒸汽爆破后的液態(tài)牛骨隨著汽爆參數(shù)的增大，其粒徑分布逐漸集中，平均粒徑逐漸減小，而鈣離子的釋放率則逐漸增大，增大壓強(qiáng)及延長(zhǎng)時(shí)間更有利于牛骨中鈣離子的釋放。牛骨經(jīng)蒸汽爆破后，由原本的固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)與固態(tài)共存的形式，其中固體可用于制備羥基磷灰石，而液體則可用于制作牛骨類食品，從而實(shí)現(xiàn)牛骨的全利用。