張舒晴，劉圣勇,，馬 鵬

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)村可再生能源新材料與裝備重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；3.鄭州工程技術(shù)學(xué)院生物質(zhì)高值利用研發(fā)中心，河南 鄭州 450044）

我國是畜禽養(yǎng)殖大國，2018年全年肉類總產(chǎn)量8 517萬 t[1]，約產(chǎn)生2 668.75萬 t的畜禽骨副產(chǎn)品，除去可直接食用的部分，如排骨、腔骨，剩余的絕大部分骨頭若無法充分利用，則會造成巨大的骨骼資源浪費(fèi)[2-3]。畜禽骨主要由水分、無機(jī)鹽（鈣和磷等）、蛋白質(zhì)以及脂肪組成。其中蛋白質(zhì)與鈣、磷等無機(jī)鹽含量較高，包含多種人體所需氨基酸及微量元素，而軟骨素及骨膠原等營養(yǎng)組分則多存在于骨髓中[3-5]。

目前國內(nèi)外對畜禽骨的利用主要分為兩個方面：一是作為骨類食品的原料，如骨素[6-7]、骨粉[8-9]、骨油[9-10]、骨湯[11-12]等；二是制備羥基磷灰石[13-15]。在對畜禽骨進(jìn)行深加工和利用之前，通常需要將其粉碎或軟化，而這一步驟很大程度上增加了成本，從而阻礙了畜禽骨加工利用的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。若能有某種方法或工藝使畜禽骨硬度降低，甚至直接變?yōu)榉勰┗蛞后w，方便下一步的深加工，則畜禽骨的利用率應(yīng)會上升。邱志超[16]、王陽光[17]、吳克剛[18]等研究了高壓和酸處理對魚骨硬度的影響，結(jié)果表明高壓和酸處理使魚骨的硬度顯著下降；柴向華等[19]研究了高溫蒸煮對雞骨的影響，結(jié)果表明在0.12 MPa下蒸煮45 min最佳；劉建華等[20]研究了高溫水煮和酸煮對豬骨硬度及化學(xué)成分的影響，結(jié)果表明豬骨硬度的顯著下降出現(xiàn)在高溫水煮或酸煮40 min后；張崟[21]、張婷[22]、陳麗堯[23]等研究了豬骨超微粉碎工藝，提高了粉碎率，而處理時間則在60 min左右；Boutinguiza等[13]將魚骨在600 ℃的高溫下煅燒12 h后得到了羥基磷灰石；Ooi等[14]的研究結(jié)果表明，2 h的600 ℃退火處理可將牛骨中的有機(jī)物完全去除；Barakat等[15]對比了3 種從牛骨中提取羥基磷灰石的方法：亞臨界水法需要將反應(yīng)器在250 ℃的硅油中加熱1 h；堿熱水解法需要在250 ℃的環(huán)境下持續(xù)5 h；熱分解法則需要持續(xù)加熱1 h。上述的處理方法雖然能有效地使畜禽骨軟化、粉碎或改變其成分，但都存在對溫度要求過高及耗時過長的缺點(diǎn)。

蒸汽爆破技術(shù)因其粉碎效果好、耗時短等優(yōu)點(diǎn)，近年來多作為預(yù)處理技術(shù)應(yīng)用于以植物為原料的研究。隋文杰等[24]對汽爆過程進(jìn)行了解析，汽爆以水作為介質(zhì)，充滿物料的孔隙，而在泄壓瞬間，物料孔隙內(nèi)液態(tài)水發(fā)生閃蒸而高壓蒸氣體積急劇膨脹對外做功，對物料起到物理撕裂作用從而破壞物料結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)將蒸汽爆破技術(shù)應(yīng)用于牛骨處理研究，研究在不同的參數(shù)條件下，蒸汽爆破對于畜禽骨的理化特性的影響，為制備牛骨類食品及羥基磷灰石提供新的前處理技術(shù)與理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛腿骨由河南伊賽牛肉有限公司提供。

六偏磷酸鈉、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、亞甲基藍(lán)指示劑、氫氧化鈉、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、高氯酸、氧化鑭、對苯二酚、無水亞硫酸鈉、鉬酸銨、氯化亞錫、硫酸肼（均為分析純）、硫酸、硝酸、鹽酸、高氯酸（均為優(yōu)級純） 阿法埃莎（中國）化學(xué)有限公司；溴化鉀（光譜純） 德國Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QBS-80B蒸汽爆破裝置 鶴壁正道生物能源有限公司；101-3AS鼓風(fēng)干燥箱 鄭州安晟科學(xué)儀器有限公司；Mastersize 2000激光粒徑分析儀 英國馬爾文公司；TA.XT.Plus物性測試儀 英國Stable Micro Systems公司；K130全自動凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司；Nicoleti S10傅里葉變換紅外光譜儀美國Thermo Fisher Scientific公司；AA-6300C原子吸收分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)前處理

將牛腿骨剔除骨髓及表面殘留的碎肉、筋、膜等組織后，切成長、寬約為5 cm的塊狀，隨機(jī)分為25 組后，放入蒸汽爆破裝置，分別在不同的壓強(qiáng)（1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 MPa）和保壓時間（100、300、500、700、900 s）下進(jìn)行爆破處理。

根據(jù)汽爆后樣品的形態(tài)，將其分為全固態(tài)（即樣品維持原本的尺寸與形狀或破碎的樣品，質(zhì)量不超過樣品總質(zhì)量的10%）、半固態(tài)、全液態(tài)（指未有直徑大于1 mm的固體顆粒，即可通過18 目的篩網(wǎng)）。

將全固態(tài)及半固態(tài)樣品中的未完全破碎的塊狀物進(jìn)行硬度、鈣、磷及粗蛋白含量的測定，以及傅里葉變換紅外光譜分析，探究蒸汽爆破前后牛骨硬度、鈣、磷、粗蛋白含量及官能團(tuán)的變化。液態(tài)樣品與半固態(tài)樣品（破碎的樣品質(zhì)量＞處理前總質(zhì)量的60%）在測定粒徑后，分別使用紗布進(jìn)行過濾，分析不同爆破參數(shù)對樣品粒徑的影響。對過濾后的固體顆粒進(jìn)行鈣、磷及粗蛋白含量的測定，以及傅里葉變換紅外光譜分析；液體用于鈣釋放率的測定，分析不同爆破參數(shù)對鈣釋放率的影響。所有指標(biāo)的檢測均重復(fù)3 次，鈣、磷及蛋白質(zhì)含量均為干基含量。

1.3.2 粒度的測定

使用激光粒徑分析儀進(jìn)行濕法測定樣品的粒度（假設(shè)樣品顆粒為球形）。參考Yin Tao等[25]的方法并略作改動。使用離子水將樣品中固體的質(zhì)量濃度調(diào)整至1 g/100 mL，使用質(zhì)量濃度為0.2 g/100 mL的六偏磷酸鈉為分散劑。

1.3.3 硬度的測定

采用TA.XT.Plus物性測試儀進(jìn)行樣品的硬度測定。參考丘志超[16]與劉建華[20]等的方法，探頭：HDP/BS，測試前速率：1.5 mm/s；測試速率：2.0 mm/s；測試后速率：10.0 mm/s；下壓距離：strain 90%。記錄峰值讀數(shù)，單位為g。

1.3.4 粗蛋白含量的測定

按照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》[26]中的凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量，其中蛋白質(zhì)的換算系數(shù)為6.25。

1.3.5 鈣及磷含量的測定

鈣含量的測定：按照GB 5009.92—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鈣的測定》[27]中火焰原子吸收光譜法測定鈣含量。

磷含量的測定：按照GB 5009.87—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中磷的測定》[28]中鉬藍(lán)分光光度法測定磷含量。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

采用傅里葉變換紅外光譜儀測定牛骨紅外吸收圖譜，采用溴化鉀壓片法進(jìn)行壓片，將經(jīng)過干燥的試樣與溴化鉀在瑪瑙研缽中研細(xì)，置于模具中并在壓片機(jī)上壓成透明薄膜進(jìn)行測定，具體參數(shù)為：測試分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為40 次，測試范圍為400～4 000 cm-1。

1.3.7 鈣釋放率的測定

取過濾后的液體樣品加入離子水定容后，過0.45 μm濾膜并進(jìn)行稀釋。將稀釋液放入原子吸收分光光度計進(jìn)行鈣含量的測定。鈣的釋放率為可溶性鈣含量占樣品中鈣的總含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用Origin 2018軟件進(jìn)行匯總與作圖，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析（單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著）。所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒸汽爆破條件對牛骨粒度的影響

蒸汽爆破后液態(tài)樣品與部分半固態(tài)樣品的平均粒徑如表1所示。當(dāng)壓強(qiáng)一定時，牛骨的平均粒徑隨著蒸汽爆破時間的延長而顯著減?。≒＜0.05）。骨皮質(zhì)由無機(jī)相、有機(jī)相及水組成，其中有機(jī)物組成排列緊密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使骨骼具有韌性，而無機(jī)物則填充進(jìn)入有機(jī)物形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，保證了骨骼硬度的同時也使骨骼具有抵抗外力破壞的能力[29]。蒸汽爆破技術(shù)通過加壓的方式提升物料箱內(nèi)溫度，通過骨膠原蛋白的變性與降解，破壞其形成的致密的有序網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而使骨骼易碎。氣體在保壓期間滲入骨骼的孔隙，在泄壓的瞬間爆破，從而達(dá)到粉碎骨骼的目的。

表1 不同蒸汽爆破條件下的牛骨平均粒徑Table 1 Average particle size of bovine bones subjected to steam explosion with different processing parameters

圖1 不同蒸汽爆破條件下牛骨的粒徑分布Fig. 1 Particle size distribution of bovine bones subjected to steam explosion with different processing parameters

圖1表示不同蒸汽爆破條件下牛骨的粒徑分布。隨著壓強(qiáng)的增大與時間的延長，氣體更加充分地滲入骨骼，使爆破的牛骨粒徑縮小并且分布的范圍集中。

2.2 蒸汽爆破條件對牛骨硬度的影響

不同壓強(qiáng)與時間下，蒸汽爆破對牛骨硬度的影響及變化趨勢如圖2所示。就整體趨勢而言，牛骨硬度隨壓強(qiáng)的增大與時間的延長而減弱。隨著時間的延長，牛骨硬度顯著下降（P＜0.05）；隨著壓強(qiáng)的上升，牛骨硬度顯著下降（P＜0.05）。相較于壓強(qiáng)變化帶來的影響而言，時間對牛骨硬度的變化更為敏感。同時增加壓強(qiáng)并延長時間，有助于加速牛骨的軟化，二者有協(xié)同作用。牛骨由蛋白質(zhì)等有機(jī)質(zhì)及碳酸鈣等無機(jī)質(zhì)組成，二者相互支撐共同維持骨的結(jié)構(gòu)。其中羥基磷灰石及無定形的碳酸鈣及磷酸鈣作為無機(jī)質(zhì)的主要存在形式，為牛骨提供硬度，使其質(zhì)地堅硬[26]。因此，牛骨中有機(jī)物的變性以及無機(jī)物的析出導(dǎo)致牛骨成分及結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響牛骨的機(jī)械強(qiáng)度與形態(tài)。

圖2 不同蒸汽爆破條件對牛骨硬度的影響Fig. 2 Effect of pressure and holding time for steam explosion on hardness of bovine bones

2.3 蒸汽爆破條件對牛骨中蛋白質(zhì)含量的影響

圖3 不同蒸汽爆破條件下牛骨蛋白質(zhì)含量隨保壓時間（A）及壓強(qiáng)（B）的變化Fig. 3 Effect of holding time (A) and pressure (B) for steam explosion on protein content of bovine bones

選取在壓強(qiáng)1.6 MPa、時間500 s的牛骨與新鮮牛骨（對照組）進(jìn)行對比，其蛋白質(zhì)含量（20.7±1.5）g/100 g明顯低于新鮮牛骨（26.1±0.1）g/100 g。

不同壓強(qiáng)條件與時間對牛骨蛋白質(zhì)含量的影響如圖3所示，總體來看，蛋白質(zhì)含量隨著壓強(qiáng)的增加與時間的延長而降低。其中，圖3A以1.6 MPa為分界線，1.2 MPa與1.4 MPa的趨勢相近，1.8 MPa與2.0 MPa的趨勢相近。在1.2 MPa與1.4 MPa壓強(qiáng)下，隨著時間的延長，蛋白質(zhì)含量分別呈下降趨勢；而在1.8 MPa與2.0 MPa壓強(qiáng)下，隨著時間延長至500 s，蛋白質(zhì)含量急速下降，而時間大于500 s時，蛋白質(zhì)含量下降速率減緩并逐漸趨于平緩。在不同的時間條件下，蛋白質(zhì)含量隨壓強(qiáng)增大而降低（圖3B）。

2.4 蒸汽爆破條件對牛骨中鈣、磷含量的影響

不同壓強(qiáng)條件與時間對牛骨鈣、磷含量的影響如圖4所示，總體來看，蒸汽爆破對牛骨固體中鈣、磷含量影響相似，呈現(xiàn)出的趨勢均為隨著壓強(qiáng)的增大與時間的延長而減小。相較于蛋白質(zhì)含量的減少量（g/100 g），鈣、磷含量的減少量（mg/g）小了一個量級，說明蒸汽爆破對牛骨中有機(jī)物含量的影響遠(yuǎn)大于對無機(jī)物的影響[29]。

圖4 不同蒸汽爆破條件下牛骨鈣含量（A）及磷含量（B）的變化Fig. 4 Effect of pressure and holding time for steam explosion on calcium (A) and phosphorus (B) contents of bovine bones

牛骨中的鈣大多存在于組成牛骨的無機(jī)物中，而無機(jī)物則與形成致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的有機(jī)物有機(jī)結(jié)合，通常難以溶出[30]。由圖5可知，隨著壓強(qiáng)的增大與時間的延長，鈣離子的釋放率顯著增加（P＜0.05），這與牛骨中有機(jī)物形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞、無機(jī)物被裸露釋放有關(guān)[25]。900 s后，5 種蒸汽爆破壓強(qiáng)下產(chǎn)生的骨液中鈣的釋放率與100 s后鈣的釋放率相比提高了近3 倍。骨液的鈣釋放率隨著時間延長而增加，這與李亞杰等[31]在研究納米骨液制品性質(zhì)中的結(jié)果相似，其原因可能與蒸汽爆破過程中也產(chǎn)生了可溶性的氨基酸有關(guān)，但還需進(jìn)一步研究。

圖5 不同的蒸汽爆破條件下牛骨鈣釋放率隨保壓時間（A）及保壓時間與壓強(qiáng)共同作用（B）的變化Fig. 5 Effect of holding time (A) and its interaction with pressure (B)for steam explosion on calcium release from bovine bones

2.5 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

圖6 不同壓強(qiáng)條件與保壓時間下牛骨的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 6 FTIR spectra of bovine bones subjected to steam explosion under different pressures and holding times

不同壓強(qiáng)與時間下的牛骨紅外吸收光譜與羥基磷灰石的傅里葉變換紅外光譜如圖6所示，與美國自然博物館收藏的天然羥基磷灰石[32]的傅里葉變換紅外圖譜相似。以壓強(qiáng)1.2 MPa、時間100 s為例，相對于羥基磷灰石，牛骨的傅里葉變換紅外光譜圖上的峰較多，因?yàn)榕９侵胁坏袩o機(jī)物，還含有有機(jī)物。單就牛骨而言，隨著壓強(qiáng)的增大和時間的延長，牛骨內(nèi)物質(zhì)隨著蒸汽爆破而流失，因此傅里葉變換紅外光譜圖的峰逐漸清晰。在1 034 cm-1處的峰位屬于v3 PO43-反對稱拉伸振動峰，在960 cm-1處的峰位屬于v1 PO43-對稱拉伸振動峰，在603 cm-1處的峰位屬于v4 PO43-反對稱彎曲振動峰，在563 cm-1處的峰位屬于v2 PO43-對稱彎曲振動峰[33-34]；在1 456、1 416 cm-1處及871 cm-1處的峰位屬于v2 CO32-振動峰，是B型碳酸磷灰石（被取代）的特征[35]；的3 個特征吸收峰與的2 個特征吸收峰在圖中的位置無明顯差異，說明蒸汽爆破對牛骨中的羥基磷灰石及其官能團(tuán)無明顯影響。在2 961 cm-1處的峰位屬于C—H基團(tuán)伸縮振動峰，代表牛骨中有機(jī)物[36]。在1 659 cm-1處的峰位屬于C＝O基團(tuán)的伸縮振動峰，與蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變化相關(guān)[37]。在未處理牛骨的紅外光譜圖中1 544 cm-1處的峰位處于酰胺II帶，是N—H彎曲振動和C—N伸縮振動引起的吸收峰[36]，代表骨膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)中氫鍵結(jié)構(gòu)的存在，而在處理后的牛骨中未見此峰位，因此可判斷蒸汽爆破對骨膠原蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)有破壞作用。對比不同壓強(qiáng)和時間下的牛骨紅外光譜圖還可以發(fā)現(xiàn)，高壓強(qiáng)和長時間下的牛骨紅外吸收峰強(qiáng)度明顯小于低壓強(qiáng)和短時間下的牛骨，說明汽爆過程中增壓或延長時間可以降低牛骨中有機(jī)物含量。此外，隨著壓強(qiáng)的增大及時間的延長，有機(jī)物及水的吸收強(qiáng)度降低，蒸汽爆破后固態(tài)牛骨的紅外光譜圖趨近于羥基磷灰石，說明汽爆可以有效地破壞骨蛋白螺旋結(jié)構(gòu)，改變牛骨成分，使牛骨內(nèi)有機(jī)物質(zhì)流失析出，并可作為利用畜禽骨制備羥基磷灰石的一種手段。

3 結(jié) 論

蒸汽爆破對牛骨硬度及化學(xué)成分的影響結(jié)果表明，蒸汽爆破后的固態(tài)牛骨硬度隨著汽爆參數(shù)的增大而顯著下降（P＜0.05），因此，增大壓強(qiáng)及延長時間更有利于牛骨的軟化及碎化；蒸汽爆破后的固態(tài)牛骨中多種物質(zhì)含量下降，其中蛋白質(zhì)含量顯著降低（P＜0.05）；隨著壓強(qiáng)的增大與時間的延長，固態(tài)牛骨的紅外吸收光譜愈發(fā)趨近于羥基磷灰石晶體的傅里葉變換紅外光譜圖。蒸汽爆破后的液態(tài)牛骨隨著汽爆參數(shù)的增大，其粒徑分布逐漸集中，平均粒徑逐漸減小，而鈣離子的釋放率則逐漸增大，增大壓強(qiáng)及延長時間更有利于牛骨中鈣離子的釋放。牛骨經(jīng)蒸汽爆破后，由原本的固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)與固態(tài)共存的形式，其中固體可用于制備羥基磷灰石，而液體則可用于制作牛骨類食品，從而實(shí)現(xiàn)牛骨的全利用。