左勇，陳靜，張晶，許努謙

1(四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 四川 成都， 610101)2(宜賓學(xué)院 質(zhì)量管理與檢驗(yàn)檢測(cè)學(xué)部， 四川 宜賓， 644000)3(重慶大學(xué) 生物工程學(xué)院， 重慶， 400044)4(成都裕智果業(yè)有限公司，四川 成都， 610307)

桑椹果酒是以成熟桑椹鮮果為原料，經(jīng)酵母發(fā)酵釀造而成，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和保健功效[1-3]。目前，對(duì)桑椹果酒的研究主要集中在菌種的選育、工藝的優(yōu)化、營養(yǎng)和風(fēng)味成分分析等方面，這有助于提升桑椹果酒的營養(yǎng)價(jià)值，利于消費(fèi)者的身體健康[4-10]。然而，在桑椹果酒發(fā)酵過程中，普遍存在揮發(fā)酸較高的問題。揮發(fā)酸是桑椹果酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，其主要成分是乙酸，此外還有少量的甲酸、丙酸、丁酸等脂肪酸[11]。揮發(fā)酸是一類損害性物質(zhì)，會(huì)帶來尖酸感和不愉快的醋味，其含量過高會(huì)損害果酒的風(fēng)味和口感。因此，控制桑椹果酒揮發(fā)酸含量對(duì)提升桑椹果酒品質(zhì)具有重要意義。

目前，果酒揮發(fā)酸的研究主要集中在果酒專用酵母的選育、醋酸代謝途徑的分析及發(fā)酵條件的優(yōu)化[12-13]。VILELA等[14]從不同分離源中分離得到135株酵母，4株酵母能同時(shí)利用葡萄糖和醋酸，其中2株菌具有良好的發(fā)酵性能，將其進(jìn)一步應(yīng)用于不同濃度醋酸和乙醇環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果顯示,2株菌均能較好降解醋酸[15]。VASSEROT等[16]對(duì)釀酒酵母醋酸代謝效果的研究發(fā)現(xiàn)，酵母對(duì)醋酸的代謝量隨初始醋酸濃度的增加而增加，但當(dāng)醋酸質(zhì)量濃度超過1 g/L時(shí)，達(dá)不到降酸效果。因此，本研究通過優(yōu)化發(fā)酵條件，即向桑椹發(fā)酵醪添加酶和金屬離子，研究其對(duì)揮發(fā)酸的影響，并分析不同發(fā)酵條件桑椹果酒的品質(zhì)，以期在控制揮發(fā)酸的同時(shí)，提升果酒品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑椹,產(chǎn)自四川，酸度為3.3～3.5 g/L，糖度約為10 °Bx；活性干酵母,購于安琪酵母股份有限公司。

LB20T型手持糖度計(jì)，成都格納絲商貿(mào)有限公司；STARTER，2C型pH計(jì)，奧豪斯儀器(上海)有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市正基儀器有限公司；BT125D型分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；T6型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；GZ-250-HS11型恒溫恒濕箱，韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；日立L-8800型全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

桑椹果酒的制作工藝流程如下：

桑椹果實(shí)→破碎打漿→成分調(diào)整(添加白砂糖、調(diào)酸)→主發(fā)酵→分離→后發(fā)酵→初濾→調(diào)整→陳釀→澄清→精濾→裝瓶→殺菌[17]

操作要點(diǎn)[18]：將桑椹破碎打漿得桑椹汁，添加白砂糖、檸檬酸以調(diào)整果醪糖度和酸度; 按比例接入酵母種子液于桑椹果醪中，將發(fā)酵醪置于一定溫度下發(fā)酵7 d，發(fā)酵過程中進(jìn)行攪拌以便完全發(fā)酵;發(fā)酵結(jié)束時(shí)進(jìn)行倒罐，并根據(jù)果醪糖度和酒精度，補(bǔ)加白砂糖，封罐進(jìn)入后發(fā)酵，發(fā)酵8～10 d至殘?zhí)琴|(zhì)量濃度<4 g /L;經(jīng)后發(fā)酵的桑椹果酒密封陳釀3～6個(gè)月; 陳釀結(jié)束后，桑椹果酒經(jīng)板框過濾機(jī)過濾、裝瓶并進(jìn)行巴氏滅菌。

1.2.2 桑椹果醪成分調(diào)整及接種發(fā)酵

桑椹果酒常規(guī)發(fā)酵條件為調(diào)節(jié)發(fā)酵醪糖質(zhì)量濃度為150 g/L，并按1 g/L的量加入檸檬酸以調(diào)節(jié)發(fā)酵醪酸度，酵母接種量為2 g/L，發(fā)酵醪于26 ℃發(fā)酵7 d。

1.2.3 酶對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響[19]

1.2.3.1 酶添加時(shí)間對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響

在桑椹果酒發(fā)酵前4 d，每天以0.2%(體積分?jǐn)?shù))的添加量向發(fā)酵醪分別加入單一酶制劑(果膠酶、纖維素酶和糖化酶)，同時(shí)以不添加酶的試驗(yàn)組作為對(duì)照。發(fā)酵結(jié)束時(shí)分析桑椹果酒中揮發(fā)酸和酒精含量。

1.2.3.2 酶添加量對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響

向發(fā)酵醪分別添加不同體積分?jǐn)?shù)(0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%)的單一酶制劑(果膠酶、纖維素酶和糖化酶)，同時(shí)以不添加酶的試驗(yàn)組作為對(duì)照,發(fā)酵結(jié)束時(shí)分析桑椹果酒揮發(fā)酸和酒精含量。

1.2.3.3 復(fù)合酶對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響

根據(jù)各種酶的最適添加量，分別向發(fā)酵醪加入單一酶和復(fù)合酶制劑(分別為：果膠酶、纖維素酶、糖化酶、果膠酶+纖維素酶、果膠酶+糖化酶、纖維素+糖化酶、果膠酶+纖維素酶+糖化酶)，同時(shí)以不添加酶的試驗(yàn)組作為對(duì)照,發(fā)酵結(jié)束時(shí)分析桑椹果酒揮發(fā)酸含量。

1.2.4 金屬離子對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響[20]

分別向桑椹發(fā)酵醪添加不同濃度(1、2、3、4、5 mmol/L)Zn2+、K+、Mg2+和Ca2+，以不添加金屬離子的試驗(yàn)組作為對(duì)照，發(fā)酵結(jié)束時(shí)分析桑椹果酒揮發(fā)酸和酒精含量。

1.2.5 不同外源添加物對(duì)桑椹果酒品質(zhì)的影響

在前期研究基礎(chǔ)上，分別向發(fā)酵醪添加復(fù)合酶(0.05%果膠酶、0.1%纖維素酶、0.05%糖化酶)和Mg2+，同時(shí)以不添加外源物質(zhì)的常規(guī)發(fā)酵試驗(yàn)組作為對(duì)照。發(fā)酵結(jié)束時(shí)對(duì)桑椹果酒的主要理化指標(biāo)、氨基酸、揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析、評(píng)價(jià)。

1.2.6 主要理化指標(biāo)分析

揮發(fā)酸、總酸、總糖參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行測(cè)定[21]；酒精度采用分光光度法[22]；揮發(fā)性風(fēng)味成分參照張晶等[23]桑椹果酒揮發(fā)性風(fēng)味成分的檢測(cè)方法。

1.2.7 游離氨基酸

游離氨基酸樣品前處理參照李俊芳等[24]的處理方法。取適量桑椹果酒置于密封袋超聲20 min，精確稱取1 g樣品，加入4%(體積分?jǐn)?shù))磺基水楊酸25 mL、過夜、10 000 r/min離心15 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，上機(jī)待測(cè)。

游離氨基酸由全自動(dòng)氨基酸分析儀檢測(cè)，其條件為：流速0.40 mL/min(pump1)，0.35 mL/min(pump2)；檢測(cè)波長570、 440 nm；柱溫135 ℃(反應(yīng)柱)、57 ℃(分離柱)；進(jìn)樣體積20 μL；游離氨基酸含量由儀器自帶程序計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶添加時(shí)間對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響

由于發(fā)酵醪中多糖類大分子物質(zhì)的存在，酵母不能直接利用，正常的酒精發(fā)酵受阻，易產(chǎn)生揮發(fā)酸等副產(chǎn)物，從而損害果酒的品質(zhì)[25]。為降解桑椹發(fā)酵醪中多糖類物質(zhì)，從桑椹果酒發(fā)酵0～4 d，分別向發(fā)酵醪液中加入果膠酶、纖維素酶和糖化酶，探究其對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酶添加時(shí)間對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響Fig.1 Effect of addition time of enzyme on volatile acidity of mulberry wine

由圖1可知，桑椹果酒發(fā)酵前2 d加入酶制劑，揮發(fā)酸含量均有不同程度的降低，表明加入酶制劑對(duì)揮發(fā)酸有較好的控制效果。且果膠酶和纖維素酶加入時(shí)間越早，揮發(fā)酸含量越低，其最佳添加時(shí)間為發(fā)酵第0天，揮發(fā)酸含量分別降低12.8%、10.1%。而糖化酶的最佳添加時(shí)間為發(fā)酵第2天，揮發(fā)酸含量降低6.0%。

2.2 酶添加量對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響

水果中普遍含有豐富的果膠、纖維素、淀粉等多糖類物質(zhì)。多糖類大分子物質(zhì)易造成果醪渾濁、不均一，影響正常的酒精發(fā)酵，導(dǎo)致?lián)]發(fā)酸、高級(jí)醇等副產(chǎn)物的產(chǎn)生，進(jìn)而損害果酒的品質(zhì)。果酒生產(chǎn)中，通常會(huì)用果膠酶、纖維素酶和糖化酶進(jìn)行酶解處理[26]，其中果膠酶、纖維素酶可以快速徹底地降解果膠、纖維素等物質(zhì)，降低果汁黏度，改善果汁成分，使果汁澄清透亮[27]；糖化酶能將淀粉類物質(zhì)降解為葡萄糖等易于被酵母利用的小分子物質(zhì)。本次試驗(yàn)分別研究了單一酶和復(fù)合酶對(duì)果酒揮發(fā)酸的影響。

2.2.1 單一酶對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸和酒精含量的影響

果膠酶、纖維素酶及糖化酶對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸和酒精含量的研究結(jié)果如圖2所示。

由圖2-a可知，隨著果膠酶的增加，桑椹果酒中揮發(fā)酸含量大致呈先降低后升高的變化趨勢(shì)，酒精含量先升高后降低。當(dāng)添加果膠酶體積分?jǐn)?shù)為0.05%時(shí)，揮發(fā)酸含量最低，為0.57 g/L，比不添加果膠酶時(shí)降低了13.7%。通過向桑椹發(fā)酵醪中加入果膠酶，桑椹果膠物質(zhì)被降解，這一方面改善了果醪中的物質(zhì)分布，另一方面降低了發(fā)酵醪的黏稠度，增加果醪的流動(dòng)性，有利于酵母發(fā)揮正常的發(fā)酵性能，從而促進(jìn)酒精發(fā)酵，控制了揮發(fā)酸的形成[28]。

隨著纖維素酶的增加，桑椹果酒中揮發(fā)酸含量先降低后升高，酒精含量大體呈逐漸上升的趨勢(shì)(圖2-b)。當(dāng)添加纖維素酶體積分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)，揮發(fā)酸含量最低，且酒精含量達(dá)到最高。這可能是由于纖維素酶的加入，細(xì)胞壁破裂，纖維素被降解為葡萄糖等小分子物質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)也隨之浸出，這不僅增加了發(fā)酵底物，也降低了果醪黏度，使整個(gè)發(fā)酵體系更適于酵母的繁殖、代謝，有利于反應(yīng)向酒精生成的方向進(jìn)行，同時(shí)也有效控制了揮發(fā)酸的生成[29]。

由圖2-c可知，隨著糖化酶的增加，桑椹果酒中揮發(fā)酸含量呈先降低后上升的變化趨勢(shì)，酒精含量先升高后降低。當(dāng)添加糖化酶體積分?jǐn)?shù)為0.05%時(shí)，揮發(fā)酸含量最低，為0.60 g/L，比不添加糖化酶時(shí)降低了10.3%。這可能是由于糖化酶可以將多糖轉(zhuǎn)化為可被酵母直接利用的葡萄糖[30]，有利于正常的酒精發(fā)酵，同時(shí)降低了揮發(fā)酸等副產(chǎn)物的生成。

2.2.2 復(fù)合酶對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響

由圖3可知，在桑椹果酒發(fā)酵過程中，同時(shí)添加3種酶對(duì)揮發(fā)酸的控制效果最好，優(yōu)于2種酶和單一酶，其揮發(fā)酸含量比不添加酶的試驗(yàn)組降低15.3%。

a-添加果膠酶；b-添加纖維末酶；c-添加糖化酶圖2 酶添加量對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響Fig.2 Effect of addition content of enzyme on volatile acidity of mulberry wine

在桑椹中，果膠和纖維素構(gòu)成相鄰細(xì)胞中間層黏結(jié)物，使組織細(xì)胞緊緊黏結(jié)在一起[31]。由果膠酶、纖維素酶和糖化酶組成的復(fù)合酶會(huì)對(duì)桑椹果實(shí)細(xì)胞壁產(chǎn)生更大的破壞作用，對(duì)細(xì)胞壁的降解作用更好，使果膠和纖維素等物質(zhì)被降解為葡萄糖等小分子化合物，而細(xì)胞內(nèi)的多糖類物質(zhì)也隨著細(xì)胞的破裂浸出，被糖化酶進(jìn)一步降解，這都有利于酵母對(duì)發(fā)酵底物的利用，同時(shí)由于復(fù)合酶的加入，提高了出汁率，使發(fā)酵醪澄清、均勻，更利于酒精發(fā)酵的進(jìn)行。

圖3 復(fù)合酶對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響Fig.3 Effect of component enzyme preparation on volatile acidity in mulberry fruit注：果,代表果果膠酶；纖,代表纖維末酶；糖,代表糖化酶

2.3 金屬離子對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響

微生物正常的生長、繁殖和代謝需要外界提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，其中無機(jī)鹽(金屬離子)是重要的營養(yǎng)要素。金屬離子在微生物體內(nèi)的作用廣泛，如構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)一般分子成分；作為酶的組成成分及其激活劑或抑制劑；調(diào)節(jié)發(fā)酵環(huán)境的滲透壓、pH值、氧化還原電位等。本次試驗(yàn)研究了金屬離子對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響。

2.3.1 金屬離子對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響

由圖4可知，向桑椹發(fā)酵醪中添加Zn2+、K+、Mg2+均有利于揮發(fā)酸的控制。隨著金屬離子濃度的增加，揮發(fā)酸含量呈先降低后升高的變化趨勢(shì)。當(dāng)Zn2+、K+、Mg2+濃度分別為2、 2、 4 mmol/L時(shí)，揮發(fā)酸質(zhì)量濃度最低，分別為0.68、0.69、0.65 g/L。這可能是由于Zn2+參與構(gòu)成乙醇脫氫酶的活性中心，對(duì)酶蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起到重要的作用，適量的Zn2+有利于乙醇脫氫酶發(fā)揮活性，使酒精發(fā)酵更好的進(jìn)行，同時(shí)也減少揮發(fā)酸等副產(chǎn)物的生成[32]；K+對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓起著重要的作用[33]；Mg2+是微生物體內(nèi)多種酶的激活劑，適量濃度的Mg2+能激活糖酵解途徑相關(guān)酶活性，促進(jìn)酵母代謝的正常進(jìn)行，而過量的Mg2+會(huì)抑制酵母的生長，出現(xiàn)發(fā)酵遲緩，不利于酒精發(fā)酵[34]。當(dāng)加入Ca2+時(shí)，桑椹果酒揮發(fā)酸含量隨著Ca2+濃度的增加逐漸升高?？赡苁怯捎贑a2+的加入，改變了揮發(fā)酸代謝途徑中相關(guān)酶的活性，乙醛脫氫酶活性提高，使醋酸合成量增加，另一方面乙酰輔酶A合成酶活性降低，使乙酸代謝途徑反應(yīng)受阻，從而引起揮發(fā)酸的升高[35]。

圖4 金屬離子對(duì)桑椹果酒揮發(fā)酸的影響Fig.4 Effect of metal ions on volatile acidity of mulberry fruit

2.3.2 金屬離子對(duì)桑椹果酒酒精含量的影響

由圖5可知，向桑椹發(fā)酵醪中添加Zn2+、K+、Mg2+均有利于酒精的生成。當(dāng)Zn2+、K+濃度為2 mmol/L時(shí)，酒精度達(dá)到最高，為7.5%vol。Mg2+的最適濃度為4 mmol/L，其酒精度為7.4%vol。當(dāng)加入Ca2+時(shí)，桑椹果酒酒精含量隨著Ca2+濃度的增加逐漸減低。這可能是由于金屬離子的加入，調(diào)節(jié)了桑椹果醪的發(fā)酵環(huán)境，使反應(yīng)向有利于酒精生成的方向進(jìn)行，同時(shí)減少發(fā)酵副產(chǎn)物的生成。

圖5 金屬離子對(duì)桑椹果酒酒精含量的影響Fig.5 Effect of metal ions on alcohol of mulberry fruit

2.4 不同外源添加物對(duì)桑椹果酒品質(zhì)的影響

2.4.1 主要理化指標(biāo)

桑椹果酒主要理化指標(biāo)如表1所示。

表1 桑椹果酒主要理化指標(biāo)Table 1 Main physical and chemical indexes of mulberry wine

由表1可知，以上3種桑椹果酒揮發(fā)酸均低于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的1.5 g/L，總酸為4～9 g/L，酒精度為7%vol～18%vol，殘?zhí)呛康陀诟尚蜕ｉ┕埔?guī)定的4 g/L，表明3種條件下釀造的桑椹果酒均能達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求，其中，添加復(fù)合酶的桑椹果酒揮發(fā)酸含量最低，酒精度最高。

2.4.2 游離氨基酸

游離氨基酸可呈現(xiàn)酸、甜、苦、澀、鮮等味道，賦予果酒豐富的味覺層次，其組成和含量能夠部分反映桑椹果酒的營養(yǎng)價(jià)值。由表2可知，從桑椹果酒中共檢測(cè)出17種氨基酸，甜味氨基酸有蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸和脯氨酸；鮮味氨基酸有谷氨酸；酸味氨基酸有天冬氨酸；苦味氨基酸有半胱氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸和酪氨酸；澀味氨基酸有纈氨酸和亮氨酸。3種果酒氨基酸呈味均以甜味為主，鮮味和苦味次之，澀味再次之，酸味最弱。果酒中谷氨酸、絡(luò)氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸含量均較高，其中，甘氨酸不僅能提供清甜味，還能減少苦味。不同果酒中，各種氨基酸含量以及氨基酸總量均呈現(xiàn)較大差異?？傮w上看，添加復(fù)合酶的桑椹果酒游離氨基酸總量高于其他2種桑椹果酒。

表2 桑椹果酒游離氨基酸 單位：mg/L

2.4.3 揮發(fā)性風(fēng)味成分

桑椹果酒揮發(fā)性風(fēng)味成分離子流圖譜如圖6所示，其相對(duì)百分含量如表3所示。

圖6 桑椹果酒揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.6 GC-MS total ion chromatogram of volatile flavor components of mulberry wine

表3 桑椹果酒揮發(fā)性風(fēng)味成分 單位：%

揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類和含量會(huì)影響桑椹果酒的品質(zhì)，是評(píng)價(jià)桑椹果酒內(nèi)在品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。由表3可知，從常規(guī)發(fā)酵條件、添加復(fù)合酶和添加Mg2+的桑椹果酒中分別檢測(cè)到28、33、23種揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中醇類和酯類占總量的90%以上，是桑椹果酒中最主要的揮發(fā)性風(fēng)味成分。添加復(fù)合酶的桑椹果酒揮發(fā)性風(fēng)味成分最豐富，其醇類和酯類的種類也高于其他2種條件下發(fā)酵的果酒，這可能是由于復(fù)合酶的添加促進(jìn)了桑椹大分子物質(zhì)的降解，發(fā)酵醪中物質(zhì)間相互作用，形成良好的發(fā)酵環(huán)境，更有利于風(fēng)味物質(zhì)的形成。

3 結(jié)論

酶制劑和金屬離子均有助于桑椹果酒揮發(fā)酸的控制，果膠酶和纖維素酶的最佳添加時(shí)間為發(fā)酵第0天，最適添加量分別為0.05%、0.1%(體積分?jǐn)?shù))；糖化酶的最佳添加時(shí)間為發(fā)酵第2天，最適添加量為0.05%(體積分?jǐn)?shù))；Zn2+、Mg2+、K+的最適添加量分別為2、4、2 mmol/L。添加復(fù)合酶(0.05%果膠酶、0.1%纖維素酶、0.05%糖化酶)時(shí)揮發(fā)酸含量最低，其含量比不添加酶制劑降低15.3%。在添加不同外源物質(zhì)的桑椹果酒中，添加復(fù)合酶的桑椹果酒揮發(fā)酸含量最低(0.66 g/L)，游離氨基酸含量最高(532.11 mg/L)，揮發(fā)性風(fēng)味成分最豐富(33種)，既有效控制了桑椹果酒揮發(fā)酸含量，又保證了桑椹果酒優(yōu)良的品質(zhì)。本研究為桑椹果酒揮發(fā)酸的控制提供了理論依據(jù)，不僅有利于降低桑椹果酒揮發(fā)酸，促進(jìn)品質(zhì)提升，同時(shí)也為其他果酒揮發(fā)酸的控制提供解決方案。