范三紅，王嬌嬌，白寶清，張錦華

（1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.特色植物資源研究與利用山西重點實驗室（山西大學），山西 太原 030006）

辣椒紅色素是從成熟的辣椒果實中提取出的一種天然色素，在食品添加劑和美妝領(lǐng)域發(fā)展?jié)摿薮骩1]。辣椒紅色素因包含有辣椒紅素、玉米黃質(zhì)素和β-胡蘿卜素等，故具有VA的活性。研究表明辣椒紅色素具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)活性和預防輻射等重要的生理功能[2-3]。辣椒堿是辣椒中主要辛辣成分，已成為國際上主要的香辛料之一。辣椒堿類物質(zhì)具有消炎鎮(zhèn)痛、抑菌等生理活性[4]。Kang等[5]研究表明辣椒堿減輕脂肪組織的炎性反應(yīng)，改善胰島素耐受反應(yīng)，進一步降低血脂代謝。因此，提取分離得到高質(zhì)量的辣椒紅色素和辣椒堿，并對辣椒紅色素和辣椒堿進行定量定性分析具有一定的現(xiàn)實意義。

目前針對辣椒紅色素和辣椒堿的提取分離方法研究較多，多采用有機溶劑提取法、超聲波或微波輔助提取法和超臨界CO2萃取法等[6-7]，但對同時萃取分離得到2 種目標產(chǎn)物的研究較少[8-9]。鹽析萃取是一種新興的綠色萃取技術(shù)[10]，現(xiàn)已被充分應(yīng)用于天然產(chǎn)物有效成分的提取[11]。范勇等[12]采用雙水相體系L44/Na2CO3/乙醇提取辣椒堿，通過正交試驗優(yōu)化各因素，辣椒堿提取率達到95.6%。Dang Yanyan等[13]研究采用三液相體系分離辣椒紅素和辣椒堿，辣椒紅素和辣椒堿的產(chǎn)率分別為常規(guī)溶劑提取的105%和88%。本實驗研究超聲輔助石油醚-乙腈-K2HPO4三相鹽析萃取體系同時分離得到辣椒紅色素和辣椒堿，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化體系參數(shù)。

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）作為一種能準確、靈敏檢測天然產(chǎn)物有效成分含量的分析方法，已較多應(yīng)用于辣椒堿的檢測分析[14-15]，而辣椒紅色素的檢測還主要是常規(guī)的分光光度計法等[16]，其準確性較低。本實驗在響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助三液相萃取同時分離辣椒紅色素和辣椒堿的基礎(chǔ)上，結(jié)合HPLC法對33 種不同品種辣椒樣品中的辣椒紅色素和辣椒堿含量進行測定，并運用聚類分析法進行分析。以期為辣椒紅色素和辣椒堿的萃取分離及其深入研究提供理論基礎(chǔ)，為選育優(yōu)質(zhì)辣椒品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同品種辣椒（編號c1、c100、c104、c105、c107、c116、c121、c123、c126、c22、c24、c25、c27、c29、c3、c30～c33、c35、002A、004A2、005A1、f1、f4、f5、s16、s3、s4、y126-2、y13-1、y29），由山西省農(nóng)科院蔬菜研究所提供。

甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、石油醚（沸點60～90 ℃）、氯仿、無機鹽等均為分析純；甲醇、乙腈、二氯甲烷均為色譜純；辣椒紅素（98%）、玉米黃質(zhì)素（97%）、β-胡蘿卜素（97%）、辣椒堿（99%）、二氫辣椒堿（98%）、降二氫辣椒堿（98%）均購于百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WJX-800A型高速多功能粉碎機 上海緣沃工貿(mào)有限公司；AL204電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SB-5200DT型超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司；1260 Infinity II高效液相色譜儀美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 三相鹽析萃取體系的構(gòu)建

研究不同無機鹽種類與不同極性的有機溶劑的成相情況。選取K2HPO4、Na2CO3、KH2PO4三種無機鹽與極性較大的甲醇、乙腈和丙酮，以及極性較小的二氯甲烷、石油醚和氯仿等有機溶劑形成三液相萃取體系。發(fā)現(xiàn)KH2PO4與任意2 種有機溶劑均不能形成三相鹽析體系，Na2CO3可以形成三相體系，但是成相效果差，鹽極易析出形成沉淀。而K2HPO4與上述有機溶劑均可形成三相鹽析萃取體系，故選擇K2HPO4作為后續(xù)研究鹽析體系的無機鹽。

1.3.2 萃取分離

干辣椒洗凈、烘干，粉碎后過45 目篩。向20 mL的具塞試管中加入0.5 g辣椒粉末和K2HPO4質(zhì)量分數(shù)20%、乙腈質(zhì)量分數(shù)20%、石油醚質(zhì)量分數(shù)16%，加蒸餾水至質(zhì)量分數(shù)為100%，充分混勻，45 ℃超聲輔助萃取，待靜置三相分離后，分別讀取上、中相體積，并取兩相萃取液進行HPLC分析測定含量，按下式計算提取量（Y）：

式中：C為辣椒紅色素或辣椒堿各單組分質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為目標物所在相的體積/mL；M為辣椒粉末質(zhì)量/g。

1.3.3 單因素試驗

考察超聲溫度（35、40、45、50、55 ℃）、超聲時間（5、10、15、20、25 min）和萃取方式（1：三相混勻后加入樣品；2：樣品和有機溶劑混勻后加入鹽；3：鹽和乙腈、樣品混勻后加入石油醚；4：鹽和石油醚、樣品混勻后加入乙腈）對體系中辣椒紅色素和辣椒堿分離萃取的影響，確定最優(yōu)萃取條件。

1.3.4 響應(yīng)面試驗優(yōu)化萃取分離條件

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以辣椒紅色素提取量和辣椒堿提取量為指標，進行響應(yīng)面試驗優(yōu)化萃取分離工藝條件。試驗因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1Factors and their levels used for Box-Behnken design

1.3.5 HPLC法測定萃取相中辣椒紅色素和辣椒堿濃度

1.3.5.1 標準品溶液制備

精密稱取辣椒紅色素各組分標準品和辣椒堿各組分標準品適量，分別用正己烷和乙腈溶解，制成1 mg/mL標準品儲備液，并用0.45 μm微孔濾膜過濾后待用。

1.3.5.2 樣品溶液制備

準確稱取辣椒樣品粉末0.5 g，按1.3.2節(jié)方法進行萃取分離，分別取上相和中相萃取液過0.45 μm微孔濾膜，濾液取10 μL上機測定。

1.3.5.3 色譜條件

辣椒紅色素測定：ZORBAX RX-SIL色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A為甲醇，B為乙腈，C為二氯甲烷，A-B-C（5∶10∶85，V/V），等度洗脫，流速1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長：辣椒紅素為475 nm，β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)素為450 nm；以峰面積外標法定量。標準品溶液與樣品溶液進樣量均為10 μL。

辣椒堿測定：ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（70∶30，V/V），流速1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長280 nm；以峰面積外標法定量。標準品溶液與樣品溶液進樣量均為10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Origin軟件進行數(shù)據(jù)、圖形處理，采用Design-Expert V8.0.6軟件進行響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)分析，利用SPSS 20.0軟件對33 種辣椒樣品中辣椒紅色素和辣椒堿含量進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒紅色素和辣椒堿的標準品曲線

按HPLC條件進行測定，對一系列辣椒紅色素和辣椒堿標準品溶液進行分析，以峰面積（Y）對標準品溶液系列質(zhì)量濃度（X）進行回歸，β-胡蘿卜素、辣椒紅素和玉米黃質(zhì)素標準溶液質(zhì)量濃度與峰面積的線性回歸方程分別為Y=31 475X＋55.186（R2=0.998 1）、Y=26 296X＋198.22（R2=0.998 5）、Y=31 051X＋42.171（R2=0.996 3）；降二氫辣椒堿、辣椒堿和二氫辣椒堿標準溶液質(zhì)量濃度與峰面積的線性回歸方程分別為Y=2 629.6X＋10.989（R2=0.998 2）、Y=4 305.2X＋15.598（R2=0.997 9）、Y=1 293.5X＋7.835（R2=0.993 6），表明峰面積與待測物呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系[17]。

2.2 三相鹽析萃取體系的確立

2.2.1 K2HPO4質(zhì)量分數(shù)對辣椒紅色素和辣椒堿分離的影響

圖1 K2HPO4質(zhì)量分數(shù)對辣椒紅色素和辣椒堿分離的影響Fig.1 Effect of dipotassium phosphate concentration on the separation of capsanthin and capsaicin

當乙腈質(zhì)量分數(shù)為20%、石油醚質(zhì)量分數(shù)為16%時，考察K2HPO4不同質(zhì)量分數(shù)對辣椒紅色素和辣椒堿分配行為及提取量的影響。由圖1可知，隨著K2HPO4質(zhì)量分數(shù)的增大，辣椒堿提取量逐步上升后略下降，這是因為隨著K2HPO4質(zhì)量分數(shù)的增大，中相極性增大，辣椒堿富集量增大。辣椒紅色素提取量變化不大，在K2HPO4質(zhì)量分數(shù)為20%時達到最大值。因此，選擇20%為三相體系的最佳K2HPO4質(zhì)量分數(shù)。

2.2.2 乙腈質(zhì)量分數(shù)對辣椒紅色素和辣椒堿分離的影響

圖2 乙腈質(zhì)量分數(shù)對辣椒紅色素和辣椒堿分離的影響Fig.2 Effect of acetonitrile concentration on the separation of capsanthin and capsaicin

當體系中K2HPO4質(zhì)量分數(shù)20%、石油醚質(zhì)量分數(shù)16%時，考察乙腈質(zhì)量分數(shù)對辣椒紅色素和辣椒堿分離的影響，如圖2所示。由于辣椒紅色素類物質(zhì)極性較小而辣椒堿極性大[18]，乙腈極性比石油醚大[19]，所以辣椒堿幾乎全部集中于體系中相。隨著乙腈質(zhì)量分數(shù)增大，辣椒堿提取量先增大后下降，在質(zhì)量分數(shù)為22%時達到最大值。同時，辣椒紅色素提取量先升高后下降，在20%時取得辣椒紅色素提取量最大值，這是由于乙醇質(zhì)量分數(shù)的增大使得上相體積變小，故辣椒紅色素濃度變大。由于辣椒堿提取量在乙腈質(zhì)量分數(shù)為20%～22%范圍內(nèi)變化不大，故體系選擇乙腈質(zhì)量分數(shù)為20%進行后續(xù)研究。

2.2.3 石油醚質(zhì)量分數(shù)對辣椒紅色素和辣椒堿分離的影響

圖3 石油醚質(zhì)量分數(shù)對辣椒紅色素和辣椒堿分離的影響Fig.3 Effect of petroleum ether concentration on the separation of capsanthin and capsaicin

固定K2HPO4質(zhì)量分數(shù)20%和乙腈質(zhì)量分數(shù)20%，考察石油醚質(zhì)量分數(shù)對辣椒紅色素和辣椒堿提取量的影響。由圖3可知，辣椒堿提取量在石油醚質(zhì)量分數(shù)先增大后減小，在20%時取得最大值，隨后下降，造成該現(xiàn)象的原因可能是隨著石油醚質(zhì)量分數(shù)增大，中相辣椒堿濃度變大，但當石油醚質(zhì)量分數(shù)超過20%時，辣椒堿溶出已達到飽和，所以提取量降低。而辣椒紅色素提取量隨石油醚質(zhì)量分數(shù)增大變化不大，但在石油醚質(zhì)量分數(shù)為16%時達到最高點，綜合考慮選擇石油醚質(zhì)量分數(shù)為16%。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 超聲溫度對目標產(chǎn)物提取量的影響

圖4 超聲溫度對辣椒紅色素和辣椒堿分離的影響Fig.4 Effect of temperature on the separation of capsanthin and capsaicin

超聲輔助萃取分離辣椒紅色素和辣椒堿，既能使分子細胞壁破裂，加速溶劑的浸入，還能產(chǎn)生熱量，加速分子運動[20]。如圖4所示，隨著超聲溫度升高，辣椒紅色素和辣椒堿的提取量均呈上升趨勢，且在45 ℃時兩者提取量均較高，但溫度過高會影響色素和堿類物質(zhì)的穩(wěn)定性[21-22]，因此，采用45 ℃作為最佳超聲溫度。

2.3.2 超聲時間對目標產(chǎn)物提取量的影響

圖5 超聲時間對辣椒紅色素和辣椒堿分離的影響Fig.5 Effect of sonication time on the separation of capsanthin and capsaicin

如圖5所示，隨著超聲時間的延長，辣椒堿提取量先增大后減小，在5～10 min內(nèi)其提取量增長迅速，10 min時辣椒堿提取量達到最大值，10～15 min提取量趨于穩(wěn)定而后下降。造成這種現(xiàn)象的原因是超聲時間過短，不能使物料內(nèi)部細胞壁破裂。但時間過長，超聲波的作用會使目標物遭到破壞，也會使雜質(zhì)過多溶出。辣椒紅色素提取量在5～15 min范圍內(nèi)也呈現(xiàn)先增后減的趨勢，但整體范圍內(nèi)變化不大。在10 min時，辣椒紅色素提取量達到最大值，且10 min時辣椒堿提取量與最大值相差不大，故選擇10 min為最適超聲時間。

2.3.3 萃取方式對目標產(chǎn)物提取量的影響

圖6 萃取方式對辣椒紅色素和辣椒堿分離的影響Fig.6 Effects of mixing sequence on the separation of capsanthin and capsaicin

由圖6可知，不同萃取方式下對辣椒堿和辣椒紅色素提取量的影響不大。萃取方式2條件下辣椒紅色素和辣椒堿提取量均較高，這是因為樣品與有機溶劑的事先混合，使得目標產(chǎn)物能較多地溶出，故選擇先將樣品粉末和乙腈石油醚混合后再加入K2HPO4進行鹽析分離。

2.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

運用Design-Expert V8.0.6軟件程序?qū)Ρ?數(shù)據(jù)進行回歸分析，擬合后得到超聲溫度、超聲時間、萃取方式對辣椒堿提取量和辣椒紅色素提取量的二次回歸模型分別為：辣椒紅色素提取量=0.26＋0.014A＋0.020B－6.400×10－3C＋5.750×10－4AB－0.020AC－2.250×10－3BC－0.042A2－0.02B2－6.453×10－3C2（R2=0.930 8）；辣椒堿提取量=1.56＋0.026A－9.575×10－3B＋0.044C＋59.400×10－3AB－0.054AC＋0.056BC－0.082A2－0.12B2－0.050C2（R2=0.987 0）。說明模型擬合良好[23-24]。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.4.2 方差分析及響應(yīng)面分析

表3 回歸統(tǒng)計分析Table 3 Analysis of variance for each term of the fitted regression equations

圖7 各因素交互作用對辣椒堿（a）和辣椒紅色素（b）提取量影響Fig.7 Response surface plots showing the interactive effects of various extraction conditions on the yields of capsaicin (a) and capsanthin (b)

如表3、圖7所示，響應(yīng)面圖可以直觀地評價萃取方式、超聲時間和超聲溫度間的交互作用及對目標產(chǎn)物提取量的影響，響應(yīng)面圖曲率越大，這2 個因素之間的差異就越顯著[25]。對于辣椒堿提取量模型，萃取方式的影響為極顯著，超聲溫度影響為顯著。同時，由F值的大小可以推斷，在所選擇的實驗范圍內(nèi)，3 個因素對辣椒堿提取量影響的排序為萃取方式＞超聲溫度＞超聲時間，而在辣椒紅色素模型中3 個影響因素排序為超聲時間＞超聲溫度＞萃取方式。這表明方差分析結(jié)果與響應(yīng)面圖反映結(jié)果一致。

2.4.3 驗證實驗結(jié)果

根據(jù)Design-Expert軟件，對回歸方程進行求解，預測出可同時保證辣椒堿和辣椒紅色素提取量較高的最佳提取條件：超聲溫度47.01 ℃、超聲時間12.57 min、萃取方式為1（三相溶劑混勻后加入樣品粉末）。此條件下辣椒堿和辣椒紅色素提取量可高達1.423 mg/g和0.274 mg/g，且模型可信度高?？紤]到實驗條件的限制及操作的方便性，將各因素修正為超聲溫度45 ℃、超聲時間10 min、萃取方式采用三相溶劑混勻后加入樣品，經(jīng)3 次平行實驗后，辣椒堿和辣椒紅色素提取量為1.412 mg/g和0.263 mg/g，與模型預測值無明顯差異。

2.5 辣椒紅色素和辣椒堿的HPLC測定

圖8 混合標準品和辣椒樣品的HPLC分析Fig.8 HPLC analysis of mixed standards and capsanthin and capsaicin from chili pepper samples

從圖8可以看出，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后的石油醚-乙腈-K2HPO4三相鹽析萃取體系萃取分離后，進行HPLC分析。在體系上相，即辣椒紅色素相中沒有辣椒堿類物質(zhì)。同時在體系的中相，即辣椒堿相，也幾乎檢測不到辣椒紅色素的各組分物質(zhì)。表明該三相鹽析體系可用于同時萃取分離得到辣椒紅色素和辣椒堿。由圖8a、b可知，辣椒紅色素3 個組分根據(jù)出峰時間依次為β-胡蘿卜素、辣椒紅素和玉米黃質(zhì)素，樣品中辣椒紅色素各組分出峰時間與標準品一致，樣品中β-胡蘿卜素和辣椒紅素峰形良好但由于2 種物質(zhì)極性相近，較難分離完全[26-27]。圖8d可以看出，辣椒堿各組分標準品從左到右依次為降二氫辣椒堿、辣椒堿和二氫辣椒堿，樣品中3 種辣椒堿單體組分出峰時間與標準品各組分辣椒堿一致，且分離完全、峰形良好。

2.6 辣椒樣品辣椒紅色素和辣椒堿含量檢測結(jié)果與分析

2.6.1 辣椒樣品中辣椒紅色素和辣椒堿含量檢測結(jié)果

表4 辣椒樣品中辣椒紅色素和辣椒堿含量Table 4 Contents of capsanthin and capsaicin in chili peppers

如表4所示，辣椒紅色素含量范圍為0.011～0.686 mg/g，c126樣品含量最低；辣椒堿的含量范圍為0.030～4.705 mg/g，c31樣品含量最低。

2.6.2 33 種辣椒樣品中辣椒紅色素和辣椒堿含量的聚類分析

圖9 33 種辣椒樣品中辣椒紅色素（a）和辣椒堿（b）含量的聚類分析Fig.9 Cluster analysis of capsanthin (a) and capsaicin (b) contents in 33 varieties of chili pepper

對33 種辣椒樣品的辣椒紅色素和辣椒堿含量進行聚類分析[28]，采用系統(tǒng)聚類，形成樹狀聚類圖。如圖9a所示，以辣椒紅色素含量為指標，歐氏距離為5時，辣椒品種可以分為三大類。編號003A和s4的辣椒紅色素含量高，為第1類；c22、s3、c25、c3和005A1為第2類，辣椒紅色素含量在0.260～0.413 mg/g范圍內(nèi)；其余品種辣椒紅色素含量較低，歸為第3類。以辣椒堿含量為聚類變量（圖9b），當歐氏距離為5時，辣椒品種也被分為三大類群。c100和c105的辣椒堿含量最高，聚為一類，分別為4.498 mg/g和4.705 mg/g；第2類（包括003A、c22、c126、c104、c27、y13-1、c3、005A1和s4）辣椒品種的辣椒堿含量平均為2.237 mg/g；第3類包含22 種辣椒品種，其辣椒堿含量均較低。

3 結(jié) 論

采用超聲輔助三相鹽析萃取體系對辣椒中的辣椒紅色素和辣椒堿進行同時萃取分離，在構(gòu)建最優(yōu)鹽析體系組成的基礎(chǔ)上，考察萃取條件即超聲溫度、超聲時間和不同萃取方式對目標產(chǎn)物提取量的影響。運用響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化工藝條件，獲得一種較優(yōu)的同時分離得到辣椒紅色素和辣椒堿的三相萃取方法[29-30]。

三相鹽析體系為44%蒸餾水-20% K2HPO4-20%乙腈-16%石油醚，萃取分離辣椒紅色素和辣椒堿最佳萃取工藝參數(shù)為超聲溫度45 ℃、超聲時間10 min、萃取方式采用三相溶劑混勻后加入樣品。萃取分離后，將兩萃取相目標物經(jīng)高效液相色譜分析測定。在此條件下，辣椒紅色素和辣椒堿提取量均較高，分別為0.263 mg/g和1.412 mg/g。該法可作為一種溫和簡便同時分離得到辣椒紅色素和辣椒堿的有效方法。采用此方法對33 種辣椒品種的辣椒紅色素和辣椒堿含量進行聚類分析，可為今后從植物資源中提取辣椒紅色素和辣椒堿類物質(zhì)及辣椒優(yōu)質(zhì)品種的選擇提供理論和實驗基礎(chǔ)。