趙玲艷，黃嘉欣，楊 劍，卿煜維，潘金微，周 熠，鄧放明,

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128；2.辣妹子食品股份有限公司，湖南 長沙 413100）

鹽漬辣椒即新鮮辣椒經(jīng)清洗、切碎（或不切碎），添加15%～25%食鹽、0.05%～0.1%左右的CaCl2，0.05‰～0.1‰焦亞硫酸鈉拌勻、裝袋、貯存后的產(chǎn)品[1]。鹽漬辣椒具有食鹽含量高、保質(zhì)期長、運輸方便等特點。鹽漬辣椒經(jīng)脫鹽、調(diào)配、罐裝、殺菌等處理后，可加工成低鹽調(diào)味辣椒，因此，鹽漬辣椒已經(jīng)成為全國辣椒加工企業(yè)的主要加工原料[2]。近年來，針對鹽漬辣椒的研究大多集中在菌種的分離純化、發(fā)酵工藝的優(yōu)化和營養(yǎng)成分變化等[3-7]。鹽漬辣椒因其食鹽含量高，大部分微生物的生長受到抑制，但仍有部分耐鹽微生物生長，以維持鹽漬辣椒的緩慢發(fā)酵和較長的貯藏期。采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法，可以分離出鹽漬辣椒中許多耐鹽微生物，然而傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)大多僅利用可培養(yǎng)的微生物，自然界中可分離培養(yǎng)的微生物不到總微生物的1%，自然發(fā)酵辣椒中還有絕大多數(shù)不可人工培養(yǎng)和暫未人工培養(yǎng)的微生物。并且針對鹽漬辣椒貯藏過程中微生物的研究僅局限于菌種的分離培養(yǎng)，其微生物多樣性研究鮮有報道[8-9]。454高通量焦磷酸測序技術(shù)堪稱宏基因組技術(shù)發(fā)展史上的一個里程碑，該技術(shù)可以對數(shù)百萬個DNA分子同時測序，具有速度快、單個堿基的測序費用低、簡單、高效、方便等特點[10-15]。Liu Zhanggen等[16]研究了江水酸菜中的主要微生物的組成；周森等[17]將傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法和高通量測序技術(shù)相結(jié)合，解析了大曲中微生物的組成情況；韓俊燕等[18]發(fā)現(xiàn)剁辣椒中魏斯氏菌、明串珠菌和乳桿菌是主要的菌屬。

本研究采用454焦磷酸測序技術(shù)，對鹽漬線椒和鹽漬米椒的細菌多樣性進行研究，探明鹽漬線椒和鹽漬米椒細菌群落結(jié)構(gòu)和相對豐度，挖掘鹽漬線椒和鹽漬米椒中有益微生物資源，旨在為進一步對鹽漬蔬菜進行質(zhì)量監(jiān)控、改進生產(chǎn)工藝、提高產(chǎn)品品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

鹽漬線椒和鹽漬米椒來自湖南壇壇香食品科技有限公司。

鹽漬線椒：切碎鹽漬，原料為山西忻州的‘辣豐3號’線椒，切碎后添加約21%的食鹽和0.2% CaCl2，混勻，入袋貯藏。

鹽漬米椒：原料為云南小米椒，添加約14%的食鹽、0.2% CaCl2、0.6%檸檬酸，混勻，整只鹽漬，入袋貯藏。

1.1.2 試劑

E.Z.N.A.?Soil DNA試劑盒、TransStart FastpfuDNA聚合酶、AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒、Roche GS FLX Titanium emPCR Kits、Roche GS FLX+ Sequencing Method、Manual_XLR70 kit 北京Omega BioTek公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-6C型凝膠電泳儀 北京市六一儀器廠；GeneAmp?9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；Quanti Fluor?-ST熒光定量系統(tǒng) 美國Promega公司；Roche GS FLX測序儀 瑞士Roche公司；UVP CDS-8000凝膠成像系統(tǒng)美國Metone公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

打開鹽漬線椒和鹽漬米椒的編織袋后，通過觀察袋中辣椒的色澤和聞袋中辣椒的氣味，分別選擇5 袋風味較好的鹽漬線椒和鹽漬米椒為取樣對象，撇去袋中表面厚約20 cm的辣椒，每袋無菌操作取樣500 g，于EP管中密封帶回實驗室，分別將鹽漬線椒和鹽漬米椒的5 個樣品混勻，取樣，每份100 g，一式三份，鹽漬線椒標號為X_G，鹽漬米椒標號為M_G，于－80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.3.2 樣品中微生物DNA的提取及DNA質(zhì)量檢測

參照E.Z.N.A.?Soil DNA試劑盒抽提方法對鹽漬辣椒中微生物DNA提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA[19]。

1.3.3 擴增產(chǎn)物定量及測序

正反向引物（27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；533R：5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’），帶有5’端454測序A、B接頭的特異引物和3’端的融合引物，其中A為測序端，需要加上barcode，B端引物可以共用。PCR采用20 μL反應體系[20]，具體見表1。

表1 PCR擴增體系Table 1 Composition of PCR reaction system used in this study

PCR擴增條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環(huán)，72 ℃最后延伸10 min。切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。

1.3.4 PCR產(chǎn)物定量、測序

PCR產(chǎn)物熒光定量，確?？偭看笥?00 ng，PCR產(chǎn)物質(zhì)量濃度大于5 ng/μL，OD260nm/OD280nm介于1.8～2.0之間，無降解，將PCR產(chǎn)物混合，按照454 Roche GS-FLX測序[21]。

1.3.5 生物信息分析

為了提取高質(zhì)量核苷酸序列，使用Qiime [1]（vsesion 1.17）軟件去雜后，進行高質(zhì)量序列的生物信息學處理，包括去除嵌合體、可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類、分類學分析、比對分析等[22-24]，應用到的數(shù)據(jù)庫和軟件見表2，利用R語言工具繪制群落結(jié)構(gòu)組分圖、Heatmap圖、Rank-Abundance曲線、Shannon-Wiener曲線、主成分分析等[25-27]。

表2 生信分析數(shù)據(jù)庫或軟件Table 2 Bioinformatics software or databases used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

從圖1可以看出，從樣品X_G和M_G中提取的微生物基因組DNA質(zhì)量濃度大于5 ng/μL，無明顯降解，適合進行后續(xù)PCR實驗。

圖1 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total bacterial genomic DNA from salted peppers

2.2 基因組DNA PCR擴增結(jié)果

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測微生物總DNA合格后，擴增微生物總DNA的16S rRNA V1-V3區(qū)，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、洗脫、2%瓊脂糖電泳檢測[28]，結(jié)果見圖2。

圖2 鹽漬辣椒細菌PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of the V1-V3 region of the bacterial 16S rRNA gene sequence from salted peppers

從圖2可以看出，樣品X_G和M_G中微生物總DNA的16S rRNA V1-V3區(qū)PCR擴增產(chǎn)物條帶均整齊、明亮、非特異帶少，長度均約525 bp，條帶大小正確，濃度合適，PCR擴增效果良好，適宜后續(xù)實驗。

2.3 有效序列統(tǒng)計結(jié)果

M_G和X_G細菌總序列數(shù)為31 373 條，細菌的總堿基數(shù)為12 670 729 bp，細菌序列的平均長度為430 bp。有效序列經(jīng)去除冗余、去重復處理后，優(yōu)化數(shù)據(jù)統(tǒng)計，M_G和X_G細菌總堿基數(shù)為10 313 535 bp，序列總數(shù)為24 175 條，平均長度為426 bp。

2.4 X_G和M_G細菌多樣性評估結(jié)果

優(yōu)化序列在相似度為97%的水平下進行OTU聚類，X_G和M_G細菌的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)結(jié)果見表3。

表3 鹽漬辣椒在97%相似性水平下細菌多樣性指數(shù)Table 3 Diversity indexes of bacterial community at 97% similarity level in salted peppers based on 454 pyrosequencing data

從表3可以看出，X_G和M_G細菌的OTU值均小于ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)，說明在X_G和M_G中可能很多未知的微生物資源；X_G細菌的OTU值、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Simpson指數(shù)大于M_G，Shannon指數(shù)小于M_G，說明X_G的細菌多樣性大于M_G的細菌多樣性。產(chǎn)生此現(xiàn)象的主要原因可能有以下2 個方面：其一是因線椒原料的含水量較米椒高，辣椒素含量較米椒低，線椒原料可能更適合微生物生長；其二是因2 種辣椒鹽漬時食品添加劑的使用不一樣，線椒鹽漬時未添加檸檬酸，僅借助于高鹽（質(zhì)量分數(shù)21%）抑制微生物的生長，達到較長時間保胚的目的。而米椒鹽漬時因添加了0.6%檸檬酸，適當降低了食鹽用量（質(zhì)量分數(shù)14%），低初始pH值和較高食鹽濃度的共同作用抑制了微生物的生長，降低了其微生物多樣性，達到較長時間保胚的目的。由此可以看出，辣椒或者其他蔬菜高鹽保胚時，借助于添加酸味劑等輔助措施，可降低食鹽添加量，達到較長時間保存蔬菜原料目的的同時，減少蔬菜加工脫鹽時資源浪費和環(huán)境污染。對比低鹽發(fā)酵辣椒細菌多樣性指數(shù)（待發(fā)表），X_G和M_G細菌的OTU值、ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)和Simpson指數(shù)均遠小于低鹽發(fā)酵辣椒，說明鹽漬辣椒的微生物多樣性指數(shù)低于低鹽發(fā)酵辣椒的微生物多樣性指數(shù)，高鹽抑制了大部分微生物生長，這也是鹽漬辣椒利用高鹽抑制大部分微生物生長，維持緩慢發(fā)酵，達到較長時間保胚的原因。

2.5 X_G和M_G細菌群落多樣性分析

X_G和M_G微生物經(jīng)454焦磷酸測序分析后得知，X_G已知分類的細菌可歸屬到8 個門、15 個綱、26 個目、31 個科、94 個屬、101 個種，并檢測到了13 個不能培養(yǎng)的細菌種。M_G已知分類的細菌可歸屬到6 個門、15 個綱、29 個目、44 個科、58 個屬、42 個種，并檢測到了10 種不能培養(yǎng)的細菌。

2.5.1 X_G和M_G在門水平細菌群落組成和相對豐度

圖3 在門水平鹽漬辣椒相對豐度大于0.01%細菌群落組成和相對豐度Fig.3 Relative abundances and phylum-level composition of bacterial communities with relative abundance greater than 0.01% in salted peppers

如圖3所示，在門水平，X_G中相對豐度大于1%的細菌有藍藻細菌（Cyanobacteria，77.01%）、變形菌門（Proteobacteria，14.78%）和厚壁菌門（Firmicutes，6.36%）；M_G中相對豐度大于1%的細菌有Proteobacteria（51.5%）和Firmicutes（46.92%）。X_G中檢測出了大量Cyanobacteria，但在綱、目、科、屬水平?jīng)]有任何分類，推測Cyanobacteria實際上是宿主（辣椒）本身DNA的污染，M_G中未大批量檢出Cyanobacteria的原因可能是米椒是整只鹽漬，減少了辣椒切碎過程中辣椒汁的流出，從而降低了宿主DNA的污染[29]。因此，蔬菜中微生物DNA提取時，如何有效地去除宿主DNA的干擾是今后需要研究的課題。

2.5.2 X_G和M_G在綱水平細菌群落組成和相對豐度

圖4 在綱水平鹽漬辣椒相對豐度大于0.01%細菌群落組成和相對豐度Fig.4 Relative abundances and class-level composition of bacterial communities with relative abundance greater than 0.01% in salted peppers

如圖4所示，在綱水平，X_G中相對豐度大于1%的已知分類細菌綱有葉綠體（chloroplast，77.01%）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria，8.03%）、桿菌綱（Bacilli，6.3%）、α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria，6.15%）；M_G中相對豐度大于1%已知分類細菌綱有Gammaproteobacteria（49.36%）、梭菌綱（Clostridia，38.94%）、Bacilli（7.84%）、變形菌綱（Epsilonproteobacteria，1.9%）。由此可以看出，X_G和M_G在綱水平細菌群落組成相差不大，在綱水平，因葉綠體與細菌DNA的同源性而檢測到了大量葉綠體，再次證明了X_G因切碎鹽漬細菌DNA受宿主（辣椒）DNA的污染嚴重。

2.5.3 X_G和M_G在目水平細菌群落組成和相對豐度

如圖5所示，在目水平，X_G中相對豐度大于1%的細菌有無分類地位目（77.01%）、乳桿菌目（Lactobacillales，6.15%）、腸桿菌目（Enterobacteriales，6%）、根瘤菌目（Rhizobiales，3.92%）、立克次體目（Rickettsiales，1.84%）和黃色單胞菌目（Xanthomonadales，1.41%）；M_G中相對豐度大于1%的細菌有海洋螺菌目（Oceanospirillales，48.82%）、鹽厭氧菌目（Halanaerobiales，38.88%）、Lactobacillales（7.4%）和彎曲桿菌目（Campylobacterales，1.9%）。X_G和M_G在目水平細菌群落組成的差異較大，X_G中無分類地位目是宿主的DNA污染。

圖5 在目水平鹽漬辣椒相對豐度大于0.01%細菌群落組成和相對豐度Fig.5 Relative abundances and order-level composition of bacterial communities with relative abundance greater than 0.01% in salted peppers

2.5.4 X_G和M_G在科水平細菌群落組成和相對豐度

如圖6所示，在科水平，X_G中相對豐度大于1%的已知分類地位的細菌有腸桿菌科（Enterobacteriaceae，6%）、鏈球菌科（Streptococcaceae，5.22%）、根瘤菌科（Rhizobiaceae，2.78%）、線粒體（mitochondria，1.84%）、黃單胞菌科（Xanthomonadaceae，1.41%）；M_G中相對豐度大于1%的細菌有：鹽厭氧菌科（Halanaerobiaceae，38.88%）、海洋螺菌科（Oceanospirillaceae，24.8%）、鹽單胞菌科（Halomonadaceae，23.08%）、鏈球菌科（Streptococcaceae，5.31%）、腸球菌科（Enterococcaceae，1.93%）、彎曲桿菌科（Campylobacteraceae，1.9%）。

圖6 在科水平鹽漬辣椒相對豐度大于0.01%細菌群落組成和相對豐度Fig.6 Relative abundances and family-level composition of bacterial communities with relative abundance greater than 0.01% in salted peppers

2.5.5 X_G和M_G在屬水平細菌群落組成和相對豐度

如圖7所示，X_G和M_G相對豐度大于0.01%的細菌分別有22 個屬和19 個屬，X_G中沒有任何分類的細菌norank占78.89%，這就是線椒本身的葉綠體和線粒體基因，經(jīng)去宿主DNA處理后，X_G和M_G相對豐度大于1%的細菌見圖8，X_G和M_G相對豐度大于1%的細菌共有19 個屬，分別是：鹽厭氧菌（Halanaerobium）、海螺菌（Marinospirillum）、乳酸乳球菌（Lactococcus）、色鹽桿菌（Chromohalobacter）、鹽單胞菌（Halomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、泛菌（Pantoea）、四聯(lián)球菌（Tetragenococcus）、弓形菌（Arcobacter）、黃單胞菌（Xanthomonas）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas）、蒼白桿菌（Ochrobactrum）、果膠桿菌（Pectobacterium）、漫游球菌（Vagococcus）、明串珠菌（Leuconostoc）、寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas）、金黃色單胞菌（Aureimonas）、甲基桿菌（Methylobacterium）。通過對比發(fā)現(xiàn)：2 個樣品的優(yōu)勢菌屬的組成及相對豐度上存在較大差異，X_G的優(yōu)勢菌屬為Lactococcus（24.51%）、根瘤菌（Rhizobium，13.17%）和未分類菌種（22.78%），共占60%以上；M_G的優(yōu)勢菌屬為Halanaerobium（38.88%）、Marinospirillum（24.79%）、Chromohalobacter（12.32%）和Lactococcus（5.12%），共占80%以上。造成2 種鹽漬辣椒優(yōu)勢菌屬差異的原因可能跟原料的品種、含水量、辣椒素含量、發(fā)酵體系初始pH值等因素有關(guān)。2 種鹽漬辣椒中豐度較高的乳酸菌僅為乳酸乳球菌，說明鹽漬辣椒乳酸發(fā)酵比較微弱，發(fā)酵速度比較緩慢，能達到較長時間保胚的目的，且乳酸乳球菌是乳酸菌中耐鹽性比較強的菌屬[30]。

圖7 在屬水平鹽漬辣椒細菌相對豐度大于0.01%群落組成和相對豐度Fig.7 Relative abundances and genus-level composition of bacterial communities with relative abundance greater than 0.01% in salted peppers

圖8 鹽漬辣椒優(yōu)勢細菌相對豐度大于1%屬群落組成和相對豐度Fig.8 Relative abundances and composition of dominant bacterial genera with relative abundance greater than 1% in salted peppers

圖9 相對豐度前100的微生物OTU在樣品間的分布Fig.9 OTU Distribution of top 100 most abundant microbial genera

從圖9可以看出，經(jīng)聚類分析后發(fā)現(xiàn)前100 個細菌OTU中，X_G中含有75 個，M_G中含有48 個，X_G和M_G中共同含有的細菌OTU有23 個，再次印證了X_G的細菌多樣性大于M_G的細菌多樣性的結(jié)論。

3 結(jié) 論

采用454焦磷酸測序技術(shù)對湖南壇壇香食品科技有限公司鹽漬辣椒中兩個主要品種X_G和M_G測序，X_G已知分類的細菌可歸屬到8 個門、15 個綱、26 個目、31 個科、94 個屬、101 個種。M_G已知分類的細菌可歸屬到6 個門、15 個綱、29 個目、44 個科、58 個屬、42 個種。X_G主要的細菌門有Cyanobacteria（77.01%）、Proteobacteria（14.78%）和Firmicutes（6.36%），M_G優(yōu)勢細菌門為Proteobacteria（51.5%）和Firmicute（46.92%）。X_G和M_G相對豐度大于1%的細菌屬共有19 個，X_G中優(yōu)勢菌屬為Lactococcus（24.51%）和Rhizobium（13.17%)。M_G中優(yōu)勢菌屬為Halanaerobium（38.99%）、Marinospirillum（24.86%）、Chromohalobacter（12.36%）和Halomonas（9.67%）。測序結(jié)果表明，鹽漬辣椒中存在著豐富的微生物資源，為發(fā)酵辣椒增香添味。同時本研究明晰了鹽漬辣椒中的細菌群落組成及相對豐度，為鹽漬辣椒優(yōu)勢優(yōu)良菌種的篩選及發(fā)酵辣椒菌種資源庫的建立提供了理論依據(jù)。