李 蕊，王一然，劉一鳴，史海粟，陳 旭，趙瑛博，武俊瑞

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

酸奶因含有豐富的蛋白質(zhì)、鈣、核黃素、VB6和VB12，被認(rèn)為比牛奶具有更多的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。隨著人們生活水平及健康意識(shí)的提高，益生菌及益生元逐漸被用于酸奶發(fā)酵。益生菌使酸奶具有特殊的風(fēng)味，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)具有控制血清膽固醇水平[2]、提高免疫力和預(yù)防癌癥[3]的作用。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，植物乳桿菌[4]、瑞士乳桿菌[5]、副干酪乳桿菌[6]、干酪乳桿菌[7]等新型益生菌也逐漸被研發(fā)。

益生元是一種膳食補(bǔ)充劑，包括菊粉、低聚異麥芽糖、低聚木糖、低聚半乳糖等，與酸奶中添加的蔗糖不同，益生元可以改善宿主的健康[8]，促進(jìn)腸道有益菌生長(zhǎng)[9]，利于營(yíng)養(yǎng)素的消化吸收[10]，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)，預(yù)防肥胖和便秘[11]，降低腸道pH值，減少心血管疾病及癌癥風(fēng)險(xiǎn)[12]，還可以增加鈣和鎂的吸收[13]，影響血糖水平并改善血漿脂質(zhì)[14]。益生元對(duì)有益菌有增殖效果，菊粉能增加雙歧桿菌的代謝活性[15]；低聚木糖和低聚異麥芽糖可以影響酸奶中乳酸菌的數(shù)量[16]。同時(shí)，益生元的添加對(duì)酸奶的品質(zhì)、結(jié)構(gòu)也存在一定的影響，菊粉可以使酸奶的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，增強(qiáng)酸奶的固體性質(zhì)[17]，且不會(huì)對(duì)酸奶本身產(chǎn)生影響[18]。β-葡聚糖會(huì)減弱酸奶的凝膠程度，進(jìn)而提高酸奶中益生菌的活力[19]。但益生元對(duì)酸奶風(fēng)味的影響參差不一，菊粉具有類似蔗糖的甜味，可以提高產(chǎn)品的甜味[20]，而低聚果糖、低聚半乳糖等益生元會(huì)減弱酸奶的風(fēng)味[21]。聚葡萄糖的添加會(huì)使酸奶產(chǎn)生不良風(fēng)味，降低酸奶的接受度[22]，低聚異麥芽糖[23]、菊苣粉[24]會(huì)降低酸奶的口感。

益生元在酸奶中發(fā)揮有益作用，使其具有更廣泛的研究空間與開發(fā)前景。目前，對(duì)于益生元酸奶的研究主要集中于理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)質(zhì)地、益生菌及發(fā)酵菌種的影響，對(duì)酸奶游離氨基酸及風(fēng)味的研究較少。不同益生元間分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)間存在差異，進(jìn)而會(huì)對(duì)酸奶中游離氨基酸及風(fēng)味產(chǎn)生不同影響。本實(shí)驗(yàn)以添加不同益生元發(fā)酵的酸奶為研究對(duì)象，除檢測(cè)蛋白質(zhì)、脂肪等基本營(yíng)養(yǎng)成分外，對(duì)不同種益生元發(fā)酵酸奶的游離氨基酸種類及含量進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)酸奶中游離氨基酸與整體風(fēng)味間的聯(lián)系進(jìn)行分析，旨在揭示添加不同益生元對(duì)工業(yè)化發(fā)酵酸奶中游離氨基酸和風(fēng)味的影響，為益生菌酸奶的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳為市售純牛奶。

嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌 法國(guó)Danisco公司；低聚木糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、蔗糖山東龍力生物科技股份有限公司；電子舌內(nèi)部溶液、參比溶液、陰、陽(yáng)離子溶液 日本Insent公司。

1.2 儀器與設(shè)備

120 乳品綜合成分指標(biāo)分析儀 美國(guó)Flowserve公司；5424R高速臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份公司；SA402B電子舌 日本Insent公司；L-8900高效氨基酸分析儀日本日立公司；超高效液相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)美國(guó)AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 添加不同益生元酸奶樣品的制備

以保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌1∶1混合作為發(fā)酵劑，以添加5%蔗糖、42 ℃發(fā)酵的酸奶為對(duì)照組，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，同等條件下酸奶制備重復(fù)3 次，制備過程如下：

1.3.2 酸奶中基本營(yíng)養(yǎng)成分含量測(cè)定

采用120乳品綜合成分指標(biāo)分析儀進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.3.3 電子舌味感的測(cè)定

利用電化學(xué)傳感器，通過測(cè)定液體樣本的綜合味覺信息，對(duì)被測(cè)試樣進(jìn)行定量和定性分析。實(shí)驗(yàn)取適量體積酸奶進(jìn)行測(cè)定，包括酸、苦、澀、咸、鮮及味感的豐富度。

1.3.4 添加不同益生元酸奶中游離氨基酸含量的測(cè)定

1.3.4.1 酸奶樣品的前處理

根據(jù)Mayer等[25]的方法稍作修改，取待測(cè)酸奶樣品加入5%磺基水楊酸混勻，離心后靜置過膜，裝入上樣瓶備用。

1.3.4.2 色譜條件

分析柱（4.6 mm×60 mm，3 μm），柱溫57.0 ℃，反應(yīng)柱溫度135 ℃，泵1流速0.45 mL/min，泵2流速0.35 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。紫外檢測(cè)器：脯氨酸在波長(zhǎng)440 nm處測(cè)定吸光度，其他氨基酸在波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4.3 游離氨基酸含量的計(jì)算

式中：Ci為游離氨基酸質(zhì)量濃度/（ng/mL）；V為樣品體積/mL；F為稀釋倍數(shù)；M為氨基酸摩爾質(zhì)量/（g/mol）；m為酸奶質(zhì)量/mg。

1.3.5 營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organation，F(xiàn)AO）/世界衛(wèi)生組織（World Health Organation，WHO）最佳配比模式進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)，即氨基酸評(píng)分（amino acid score，AAS），按式（2）計(jì)算：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用單因素及相關(guān)性分析進(jìn)行顯著性分析；作圖采用軟件Origin 8.6和Sigma Plot 11。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同益生元發(fā)酵酸奶中基本營(yíng)養(yǎng)成分

添加不同益生元發(fā)酵酸奶，當(dāng)酸度達(dá)到70 °T時(shí)，停止發(fā)酵，相較于對(duì)照組發(fā)酵時(shí)間4.5 h，添加益生元組發(fā)酵時(shí)間有所差異，其中低聚木糖組發(fā)酵時(shí)間為4 h，低聚半乳糖組為5.2 h，低聚異麥芽糖組為6 h。利用乳品綜合成分指標(biāo)分析儀對(duì)不同益生元發(fā)酵酸奶的基本營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行測(cè)定，包括脂肪、蛋白質(zhì)、總固形物、非脂乳固體含量，結(jié)果如表1所示。

表1 不同益生元發(fā)酵酸奶中基本營(yíng)養(yǎng)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Contents of basic nutrients in yoghurts added with different probiotics%

發(fā)酵時(shí)間反映了不同益生元對(duì)酸奶中產(chǎn)酸菌株的作用存在差異，說明不同益生素的添加會(huì)影響酸奶中產(chǎn)酸菌株的活力，即低聚木糖可以提高保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌的活力，但低聚異麥芽糖及低聚半乳糖作用不明顯，為益生元在酸奶工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

由表1可知，低聚異麥芽糖酸奶中總固形物和非脂乳固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為16.02%、9.22%，低聚木糖酸奶中脂肪和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為3.54%、3.11%。GB 19302—2010《發(fā)酵乳》規(guī)定蛋白質(zhì)≥2.9%，脂肪≥3.1%，非脂乳固體≥8.1%，可以看出，添加不同益生元發(fā)酵酸奶的蛋白質(zhì)含量、脂肪含量均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。益生元的添加可以提高酸奶中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量，使酸奶的品質(zhì)得到提升，且添加低聚木糖發(fā)酵的酸奶營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)最好。

2.2 不同益生元發(fā)酵酸奶的電子舌味感分析

圖1 不同益生元發(fā)酵酸奶電子舌雷達(dá)圖Fig.1 Electronic tongue radar chart of yogurts added with different probiotics

從圖1可以看出，添加不同益生元對(duì)酸奶的酸味有顯著影響，從其酸味大小依次為：低聚木糖＜低聚半乳糖＜低聚異麥芽糖＜對(duì)照組。添加低聚異麥芽糖的酸奶澀味值顯著小于其他組（P＜0.05），添加低聚異麥芽糖和低聚木糖的酸奶鮮味值顯著大于對(duì)照組（P＜0.05），添加低聚異麥芽糖的酸奶甜味值顯著大于對(duì)照組（P＜0.05），添加低聚木糖酸奶的苦味值顯著大于其他組（P＜0.05）。綜合得出，添加益生元可以降低酸奶的甜味，添加低聚異麥芽糖酸奶的口感要稍高于其他組別的酸奶。

2.3 不同益生元發(fā)酵酸奶中游離氨基酸含量

表2 添加不同益生元酸奶中游離氨基酸含量Table 2 Contents of free amino acids in yogurts added with different probiotics mg/g

由表2可知，從酸奶中共檢測(cè)出17 種游離氨基酸，其中含8 種必需氨基酸。從整體看，添加低聚木糖酸奶中必需氨基酸含量最多，依次為低聚木糖＞對(duì)照組＞低聚異麥芽糖＞低聚半乳糖，且總氨基酸含量顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組（P＜0.05）。添加低聚異麥芽糖組和對(duì)照組中總氨基酸含量顯著高于低聚半乳糖組（P＜0.05）。

此外，添加低聚木糖酸奶的Ser、Glu、Arg含量顯著高于添加低聚半乳糖組（P＜0.05）；其中Thr、Val、Ile、Phe、Leu、Tyr等11 種氨基酸含量均高于對(duì)照組，且Leu、Tyr含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），Leu有助于調(diào)節(jié)血糖水平[26]，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[27]；Tyr可被代謝成延胡索酸，參與三羧酸循環(huán)，為機(jī)體提供能量。此外，低聚木糖酸奶中Val、Ile和Leu含量均顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），當(dāng)Val、Ile和Leu協(xié)同作用時(shí)，具有修復(fù)肌肉、控制血糖、提供能量的作用。

2.4 不同益生元發(fā)酵酸奶主成分分析

圖2 添加不同益生元發(fā)酵酸奶的主成分分析得分圖（A）和載荷圖（B）Fig.2 PCA score plot (A) and loading plot (B) of yogurts added with different probiotics

由圖2A可以看出，不同添加物發(fā)酵酸奶分布在不同區(qū)域，主成分存在較大差異，且4 組樣品數(shù)據(jù)均分布在95%的置信區(qū)間內(nèi)，說明添加不同益生元發(fā)酵酸奶與蔗糖發(fā)酵酸奶的游離氨基酸組分及含量存在很大差異，區(qū)分較為明顯?？梢钥闯觯M間分離較為清楚，組內(nèi)聚集性良好，分布結(jié)果比較理想，且相較于對(duì)照組，添加益生元實(shí)驗(yàn)組分布更為集中、均勻，說明樣品重復(fù)性好，游離氨基酸含量較為穩(wěn)定，進(jìn)一步說明了添加益生元發(fā)酵酸奶均一性、穩(wěn)定性良好，營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)更為穩(wěn)定。

由圖2B可知，添加低聚木糖組Val、Ile、Leu等游離氨基酸含量較高，所以分布在PC1負(fù)方向。添加低聚異麥芽糖組和對(duì)照組His、Pro、Ala、Val、Asp、Ser等游離氨基酸含量較高，所以分布在PC2正方向。而添加低聚半乳糖組游離氨基酸含量相較于其他組略低，所以PC1正方向與PC2負(fù)方向重疊區(qū)域無氨基酸出現(xiàn)。可以體現(xiàn)出，正是不同游離氨基酸含量及配比導(dǎo)致了添加不同益生元發(fā)酵酸奶樣品之間的差異。

2.5 呈味特征分析

氨基酸可分為鮮味、甜味、苦味和無味，鮮味氨基酸有Asp和Glu；甜味氨基酸有Thr、Ser、Gly和Ala[28]；苦味氨基酸有His、Phe、Ile、Leu、Tyr、Val、Met和Arg；無味氨基酸有Cys、Lys和Pro。添加不同益生元發(fā)酵酸奶的呈味氨基酸含量如圖3所示。

圖3 添加不同益生元發(fā)酵酸奶呈味氨基酸含量Fig.3 Contents of taste amino acids in yogurts with different probiotics added

由圖3可知，各組間呈味氨基酸含量存在顯著差異，其中，添加低聚木糖組鮮味、甜味、苦味氨基酸均顯著高于其他組（P＜0.05），且鮮味與苦味的含量與其他組差異較為明顯，印證了圖1中添加低聚木糖組鮮味苦味均大于其他組的結(jié)果；而圖3所顯示甜味氨基酸含量的結(jié)果與圖1結(jié)果有所差異，分析原因在于甜味氨基酸含量在總氨基酸含量中所占比重較小，導(dǎo)致作用效果不夠明顯。添加低聚異麥芽糖組鮮味顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。添加低聚半乳糖組各呈味氨基酸均小于其他實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組。

2.6 滋味活性值（taste active value，TAV）分析

各種游離氨基酸體現(xiàn)出不同的呈味特征，是由于呈味物質(zhì)含量及其味道閾值有所不同。TAV是各呈味物質(zhì)在樣品中的含量與其對(duì)應(yīng)的味道閾值之比。通常認(rèn)為，當(dāng)TAV大于1時(shí)，該物質(zhì)對(duì)樣品的滋味有影響[29]。根據(jù)表2添加不同益生元發(fā)酵酸奶中各游離氨基酸含量及表3味道閾值，分析得到各游離氨基酸在添加不同益生元組分中的TAV，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，添加低聚異麥芽糖組有15 種氨基酸TAV大于1，添加低聚木糖組次之，有14 種，添加低聚半乳糖組與對(duì)照組最少，有13 種。添加低聚木糖組中，對(duì)其味道有特別貢獻(xiàn)的為Val、Ile和Phe，均為苦味氨基酸，其TAV分別為20.20、9.36和7.41。均高于其他品種，進(jìn)一步印證了圖1添加低聚木糖組鮮味苦味均大于其他組的結(jié)果。對(duì)照組中，對(duì)其味道有特別貢獻(xiàn)的為His、Ala，分別為苦味氨基酸和甜味氨基酸。總體來看，各實(shí)驗(yàn)組Val、Phe、Ile、Arg和His對(duì)苦味貢獻(xiàn)較大，Glu對(duì)鮮味貢獻(xiàn)較大，Ala對(duì)甜味貢獻(xiàn)較大。Met和Tyr對(duì)風(fēng)味整體沒有貢獻(xiàn)，其余各氨基酸對(duì)酸奶風(fēng)味影響大小依次為：Glu＞His＞Val＞Lys＞Ala＞Arg＞Ile＞Phe＞Pro＞Ser＞Leu＞Gly＞Asp＞Thr＞Cys。

表3 不同益生元發(fā)酵酸奶游離氨基酸TAVTable 3 TAV of free amino acids in yogurts added with different probiotics

表4 添加不同益生元發(fā)酵酸奶游離氨基酸與味感相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between free amino acids and taste characteristics of yoghurts added with different probiotics

2.7 不同營(yíng)養(yǎng)素發(fā)酵酸奶相關(guān)性分析

由表4可知，Ile、Val、Leu、Phe均為苦味氨基酸，Ile、Val呈顯著正相關(guān)，Leu和Ile呈極顯著正相關(guān)，苦味與Phe呈極顯著正相關(guān)；Glu、Asp為鮮味氨基酸，Ser、Thr為甜味氨基酸，Glu與Ser呈顯著正相關(guān)，鮮味與Thr呈顯著正相關(guān)，甜味與Asp呈極顯著正相關(guān)，這3 組關(guān)系相互印證了鮮味氨基酸與甜味氨基酸顯著相關(guān)。Tyr為苦味氨基酸，酸味與Tyr呈顯著負(fù)相關(guān)，這與圖1中對(duì)照組酸味大、苦味小以及添加低聚木糖組苦味大、酸味小的結(jié)果吻合，同時(shí)驗(yàn)證了Tseng等[30]對(duì)氨基酸滋味的特征描述。

2.8 營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

表5 添加不同益生元發(fā)酵酸奶的AASTable 5 Amino acid scores of yoghurts with different probiotics added

FAO/WHO推薦的氨基酸模式中人體的各AAS分別為Ile 4.0、Leu 7.0、Lys 5.5、Met＋Cys 3.5、Phe＋Tyr 6.0、Thr 4.0、Val 5.0，由表5可知，Ile、Lys、Phe＋Tyr、Thr、Val的AAS均高于模式譜標(biāo)準(zhǔn)值，且添加低聚木糖組最高。添加低聚木糖組和對(duì)照組Leu的AAS高于模式譜標(biāo)準(zhǔn)值，Met＋Cys的各實(shí)驗(yàn)組均未達(dá)到氨基酸模式譜標(biāo)準(zhǔn)值。越接近氨基酸模式，即營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越均衡，因此，可以看出實(shí)驗(yàn)樣品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不夠均衡，但作為人體主要限制氨基酸之一的賴氨酸評(píng)分值較高，且添加低聚木糖組最高。

3 結(jié) 論

添加不同益生元對(duì)酸奶中發(fā)酵菌株、氨基酸含量及風(fēng)味存在不同程度的影響。其中，各實(shí)驗(yàn)組的基本營(yíng)養(yǎng)成分均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，低聚木糖可以提高保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌活力；不同組分電子舌味感結(jié)果有所不同，對(duì)酸味影響最大；低聚木糖的添加可以提高Leu、Tyr、Ile、Val、Ser、Glu和Arg的含量；各實(shí)驗(yàn)組主成分間存在較大差異；結(jié)合相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，鮮味、甜味氨基酸呈顯著正相關(guān)；添加低聚木糖組的AAS最高，且作為人體主要限制氨基酸之一的Lys評(píng)分值最高。因此，添加低聚木糖發(fā)酵的酸奶風(fēng)味更好，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高，具有更好的益生作用。為其后續(xù)的風(fēng)味研究及產(chǎn)品的開發(fā)生產(chǎn)利用了提供理論依據(jù)。