李曉靜，孫文，康垚，樊江莉，彭孝軍

（大連理工大學(xué)精細(xì)化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116024）

引 言

羥基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2，HAP)，Ca/P為1.67，是脊椎動(dòng)物骨骼和牙齒的主要無(wú)機(jī)組成成分，具有獨(dú)特的理化性質(zhì)，如高溶解度、高表面能、強(qiáng)吸附性和生物活性等。具有無(wú)毒、無(wú)刺激、可降解，不會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏、突變、溶血和組織損壞等優(yōu)點(diǎn)。HAP 納米材料通常呈棒狀或針狀晶體，具有大的比表面積；對(duì)pH 敏感，在微酸環(huán)境下，可以降解為鈣和磷元素，同時(shí)釋放所負(fù)載的藥物，因此被廣泛應(yīng)用于載藥系統(tǒng)(DDSs)[1?9]。研究表明，HAP 納米材料通過(guò)表面功能化可實(shí)現(xiàn)靶向藥物遞送，大大改善了小鼠腫瘤模型的治療效果，并減少了藥物對(duì)正常組織和器官的毒副作用[3,5,10?11]。

阿霉素(DOX)是一種廣譜類(lèi)抗癌藥物，由于該類(lèi)藥物自身具有熒光，通常在載藥體系研究中作為模型藥物，用于可視化納米載藥體系在生物體內(nèi)的遞送。目前，大多數(shù)報(bào)道的納米載藥體系是利用單通道DOX 的熒光信號(hào)來(lái)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其向病灶部位的遞送[11?13]。然而，DOX 的發(fā)射波長(zhǎng)主要位于550～650 nm 之間，波長(zhǎng)較短，生物背景熒光較大以及組織滲透深度較小，不利于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)納米載藥系統(tǒng)在生物體內(nèi)遞送過(guò)程中的分布和積累。七甲川花菁染料是一類(lèi)重要的近紅外熒光染料，其發(fā)射波長(zhǎng)主要位于700～1000 nm 之間，波長(zhǎng)較長(zhǎng)，生物背景熒光較小以及組織穿透深度較大，廣泛應(yīng)用于活體熒光成像[14?17]。因此，構(gòu)建基于近紅外熒光染料的納米載藥體系尤為重要。

聚乙二醇(PEG)廣泛修飾于納米載體來(lái)提高其溶解性和腫瘤被動(dòng)靶向作用，如膠束、C 量子點(diǎn)和無(wú)機(jī)納米材料[18?22]。被動(dòng)靶向主要是通過(guò)納米材料表面PEG 鏈的修飾，減少非特異性蛋白質(zhì)的吸附和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的細(xì)胞攝取，從而增強(qiáng)其滲透性和滯留性(EPR 效應(yīng))改善DDSs 的生物分布并延長(zhǎng)其血液循環(huán)半衰期[21,23?26]。然而，PEG 化的HAP納米材料應(yīng)用于DDSs鮮有報(bào)道。

因此，本文通過(guò)水熱共沉淀的方法制備了納米藥物DOX@HAP，DOX 摻雜于HAP 納米材料的晶格中，減少其在DDSs 遞送過(guò)程中的泄漏；進(jìn)一步通過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)修飾近紅外菁染料(Cy)，通過(guò)銅(I)催化的炔?疊氮化物環(huán)加成反應(yīng)修飾PEG 鏈，從而構(gòu)建了一例具有被動(dòng)靶向腫瘤的新型納米制劑DOX@HAP?Cy?PEG。該納米制劑具有雙通道熒光成像的性質(zhì)，利用DOX 和Cy 的雙通道熒光成像，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DDSs 在Hela 和HepG2 細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)分布。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

硝酸鈣(Ca(NO3)2·4(H2O))、磷酸氫二銨((NH4)2HPO4)、2,3,3?三甲基吲哚、1,3?二溴丙烷、6?庚酸、疊氮化鈉(NaN3)、二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(CH2Cl2)、三氯氧磷(POCl3),、乙酸酐、乙酸鈉(NaAc)、環(huán)己酮、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、4?二甲氨基吡啶(DMAP)、3?氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、鹽酸阿霉素(DOX)、正十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、抗壞血酸鈉、硫酸銅(CuSO4·5H2O)、甲氧基聚乙二醇(M=5000)、噻唑藍(lán)均購(gòu)買(mǎi)于安耐吉。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 分析測(cè)試儀器

ZS90 納米粒度及Zeta 電位分析儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司)，HT7700EXALENS 透射電子顯微電鏡(TEM，日本日立公司)，NOVA NanoSEM 450 掃描電子顯微鏡(SEM，美國(guó))，X 射線光電子能譜儀(XPS，英國(guó)thermo)和X 射線衍射儀(XRD，日本)，F(xiàn)P6500熒光分光光度計(jì)(Jasco)，Lambda 35 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Perkin Elmer)，6700 高級(jí)傅里葉紅外光譜儀(FTIR)，Varioskan LUX 酶標(biāo)儀(Thermo)，F(xiàn)V3000 激光共聚焦顯微鏡(Olympus)。

1.3 菁染料和PEG-炔基的制備

菁染料和PEG?炔基的制備反應(yīng)式如圖1所示。

1.3.1 合成化合物2 由文獻(xiàn)[27]方法制備化合物1，在N2保護(hù)下，化合物1(2.82 g，7.8 mmol)溶于干燥的DMF 中，將NaN3(0.76 g，11.7 mmol)加入上述溶液中，60℃下攪拌24 h[28]。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行減壓蒸餾除去DMF，對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行柱色譜提純，得到一種黃色的油性黏稠液體。

1.3.2 合成化合物4 由文獻(xiàn)[29]方法制備化合物3，N2保護(hù)下，化合物2 (1.2 g，3.46 mmol)，化合物3(0.299 g，1.73 mmol)和NaAc (0.167 g，2 mmol) 溶于40 ml 乙酸酐，室溫下攪拌2 h，反應(yīng)結(jié)束后，加入60 ml乙醚，得到墨綠色粗產(chǎn)物[30]，并對(duì)其進(jìn)行柱色譜提純(CH2Cl2∶CH3OH=8∶1,體積比)。

圖1 菁染料和PEG?炔基的制備反應(yīng)式Fig.1 Reaction equation of cyanine dyes and PEG alkynyl

1.3.3 合成化合物Cy 由文獻(xiàn)[31]方法，N2保護(hù)下，化合物4(0.124 g，0.2 mmol)溶于20 ml DMF，然后加入APTES (0.19 ml)，80℃下反應(yīng)2 h，減壓蒸餾后，得到藍(lán)色粗產(chǎn)物，對(duì)其進(jìn)行柱色譜提純(CH2Cl2∶CH3OH=10∶1,體積比)。

1.3.4 合成化合物PEG?炔基 根據(jù)文獻(xiàn)[32]，合成步驟為(附錄，圖A1)：在冰浴條件下，甲氧基聚乙二醇(33.11 g，6.62 mmol)，6?庚酸(0.76 g，6.02 mmol)和DMAP(62.7 mg，0.503 mmol)溶于100 ml CH2Cl2。然后，DCC(1.25 g，5.94 mmol)溶于20 ml CH2Cl2緩慢加入上述混合溶液中。室溫條件下，持續(xù)攪拌48 h，濾液加入乙醚，得到白色產(chǎn)物。

1.4 納米材料的制備

1.4.1 合成納米粒子DOX@HAP 根據(jù)文獻(xiàn)方法[11]，CTAB (3 mg)分散在乙醇和水的混合溶液中(60 ml，體積比為1∶1)，85℃下攪拌0.5 h，將DOX(35 mg)和Ca(NO3)2·4H2O(0.596 g)加入上述溶液中，用氨水調(diào)節(jié)pH 保持在10 左右，攪拌1 h。(NH4)2HPO4(0.0.198 g)溶于5 ml 去離子水中，緩慢加入上述混合溶液中，85℃下攪拌12 h，降溫至室溫，繼續(xù)攪拌24 h。離心后得到紫紅色沉淀，分別用乙醇和水混合溶液洗滌3 次，60℃真空干燥箱干燥過(guò)夜。

1.4.2 合成納米粒子DOX@HAP?Cy 根據(jù)文獻(xiàn)方法[31]，在N2保 護(hù) 下，DOX@HAP (100 mg)分 散 于40 ml 乙醇，然后加入0.2 ml NH4OH 和1ml 去離子水，40℃下攪拌1 h，將Cy(15 mg)溶于乙醇中，逐滴加入，攪拌24 h，離心后得到淺藍(lán)色沉淀，分別用乙醇和水混合溶液洗滌三次，60℃真空干燥箱干燥過(guò)夜。

1.4.3 合成納米粒子DOX@HAP?Cy?PEG 根據(jù)文獻(xiàn)方法[33]，合成步驟為(附錄，圖A2)：在N2保護(hù)下，DOX@HAP?Cy(40 mg)，CuSO4·5H2O(5 mg)和PEG?炔基(M=5000)(20 mg)溶于10 ml DMF，室溫條件下，攪拌2 h，然后，抗壞血酸鈉(60 mg)加入上述反應(yīng)溶液中，持續(xù)攪拌48 h。離心后得到淺藍(lán)色沉淀，去離子水洗滌三次，60℃真空干燥箱干燥過(guò)夜。

1.5 藥物負(fù)載量和釋藥曲線測(cè)定

在pH 3.0 下 持 續(xù) 攪 拌24 h，DOX@HAP?Cy?PEG 完全降解，測(cè)試500 nm 處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲 線A=16.27C + 0.0476(A 為 吸 光 度，C 為DOX 濃度)，得出納米制劑的藥物負(fù)載量。利用紫外?可見(jiàn)光譜法檢測(cè)納米載藥制劑DOX@HAP?Cy?PEG 的體外藥物釋放曲線。將DOX@HAP?Cy?PEG 分散于不同pH(7.4、6.5 和5.0)的PBS 中，37℃下攪拌24 h，離心并測(cè)試上清液500 nm 處的吸光度，得出藥物釋放曲線。

1.6 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將消化好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela 和HepG2 細(xì)胞制成1×105個(gè)/毫升的懸液，接種于96 孔板，每孔100 μl，貼壁生長(zhǎng)24 h 后，吸棄培養(yǎng)基，分別加入含DOX質(zhì) 量 濃 度 為0.25、0.5、1、25、50 和100 mg/ml 的DOX@HAP?Cy?PEG 納米粒子溶液，培養(yǎng)24 h，采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 菁染料的表征

2.1.1 化合物4 核磁及質(zhì)譜表征1H NMR (400 MHz,DMSO) δ 8.24 (d,J = 14.1 Hz,2H)，7.61 (d,J =7.4 Hz,2H)，7.42 (d,J = 5.6 Hz,4H)，7.29～7.24 (m,2H)，6.33 (d,J = 14.1 Hz,2H)，4.24 (t,J = 7.0 Hz,4H)，3.48 (t,J = 6.5 Hz,4H)，2.68 (dd,J = 17.6,11.9 Hz,4H)，2.01～1.93 (m,4H)，1.87 (s,2H)，1.65 (s,12H)。ESI?MS: [M]+621.32，found: 621.32(附錄，圖A3 和圖A4)。

2.1.2 Cy 核磁及質(zhì)譜表征1H NMR (400 MHz，MeOD) δ 7.78 (d,J = 13.0 Hz,2H)，7.38 (d,J = 7.4 Hz,2H)，7.33 (t,J = 7.7 Hz,2H)，7.11 (t,J = 8.5 Hz,4H)，5.93 (d,J = 12.7 Hz,2H)，4.05 (t,J = 6.8 Hz,4H)，3.84(ddd,J=19.9,10.0,5.3 Hz,8H)，3.50(t,J=6.1 Hz,4H)，2.59 (t,J = 6.4 Hz,2H)，2.03 (d t,J = 11.4,5.9 Hz,6H)，1.69 (s,12H)，0.95～0.82 (m,13H)，0.74～0.69 (m,2H)。ESI?MS: [M]+806.49，found: 806.45(附錄，圖A5 和圖A6)。

2.2 納米粒子表征

2.2.1 納米粒子形貌及粒徑分析 如圖2(a)、(b)所示，DOX@HAP 納米粒子為均一的納米棒，平均長(zhǎng)度、高度和寬度分別為200、50 和31 nm。圖2(c)分別為DOX@HAP、DOX@HAP?Cy 和DOX@HAP?Cy?PEG 納米粒子在水溶液中的流體力學(xué)直徑分布，平均粒徑為292、280 和414 nm，分布均勻。圖2(d)為DOX@HAP、DOX@HAP?Cy 和DOX@HAP?Cy?PEG的電勢(shì)電位，結(jié)果表明：DOX@HAP 與Cy 染料偶聯(lián)后，電勢(shì)電位由?0.351 mV 變?yōu)?8.4 mV，點(diǎn)擊反應(yīng)引入PEG 鏈后降為?8.39 mV，驗(yàn)證了納米粒子的成功制備。如圖2(e)所示，DOX@HAP 粒徑的PDI值為0.365，經(jīng)過(guò)PEG 鏈修飾后，降低到0.152。結(jié)果顯示：PEG 鏈的引入增加了無(wú)機(jī)納米材料在水溶液中的均一度和分散性，有利于該納米制劑在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。

2.2.2 納米粒子物相組成表征及紅外光譜分析如圖3(a)所示，XPS測(cè)試表明DOX@HAP納米粒子含有氧(O)、碳(C)、磷(P)和鈣(Ca)元素。此外，納米顆粒的Ca/P 比 為1.629 (附 錄，表A1)，處 于HAP(1.33～1.67)的報(bào)道范圍內(nèi)[2,34]，表明DOX@HAP 納米顆粒的成功制備。對(duì)DOX@HAP納米粒子進(jìn)行了粉末X射線衍射分析。如圖3(b)所示，DOX@HAP 的特征峰2θ 分別位于25.9°、31.9°、33°、34°和40°處，與HAP的標(biāo)準(zhǔn)參考(PDF#09?0432)相匹配，表明在DOX 摻雜后HAP沒(méi)有明顯的相變[35]。

如圖3(c)所示，對(duì)納米粒子HAP、DOX@HAP、DOX@HAP?Cy 和DOX@HAP?Cy?PEG 進(jìn)行紅外光譜測(cè)定，結(jié)果表明：HAP 的主要的特征峰位于1039、603 和567 cm?1處，歸屬于磷酸鹽(PO3?4)基團(tuán)的伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)。摻雜DOX后，在1585 cm?1處出現(xiàn)一個(gè)新的峰，歸屬于C C(Ar)的伸縮振動(dòng)，說(shuō)明成功合 成 了DOX@HAP。DOX@HAP?Cy 位 于2930 和1645 cm?1處的特征峰為C—H伸縮振動(dòng)和Cy的N—H彎曲振動(dòng)共同作用。經(jīng)PEG 化后，1270 cm?1處出現(xiàn)一個(gè)新峰，歸屬于C—O—C 的伸縮振動(dòng)，表明PEG鏈通過(guò)點(diǎn)擊反應(yīng)成功地接枝到DOX@HAP?Cy 納米粒子上。

2.3 納米粒子DOX@HAP-Cy-PEG 的光譜性質(zhì)

圖4 為DOX@HAP?Cy?PEG 的紫外可見(jiàn)吸收光譜和熒光光譜。如圖4(a)所示，DOX@HAP?Cy?PEG具有與Cy 染料相同的吸收光譜，位于610 nm 左右，而不具有摻雜的DOX 的吸收峰。如圖4(b)所示，在610 nm 激發(fā)下，DOX@HAP?Cy?PEG 具有與Cy染料相同的發(fā)射光譜，位于750 nm 左右。在488 nm 激發(fā)下，由于DOX 和HAP 納米棒之間的能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致DOX@HAP?Cy?PEG 納米粒子中DOX 熒光猝滅。結(jié)果表明Cy 染料成功偶聯(lián)到納米粒子表面。

2.4 藥物負(fù)載量和釋藥曲線

在pH 為3.0 條件下，通過(guò)紫外?可見(jiàn)吸收光譜[圖5(a)]來(lái)測(cè)定完全釋放的DOX含量，得到納米粒子DOX@HAP?Cy?PEG 的藥物負(fù)載量為90 mg·g?1[圖5(b)為標(biāo)準(zhǔn)曲線]。此外，對(duì)DOX@HAP?Cy?PEG 體外的藥物釋放行為進(jìn)行了研究。為了模擬生物條件，制備了不同pH(7.4、6.5和5.0)的PBS溶液。如圖5(c)所示，24 h 后，在pH 7.4 條件下，DOX 釋放量?jī)H為15.3%，表明DOX@HAP?Cy?PEG 具有較高的穩(wěn)定性，避免了藥物從納米載體的突釋?zhuān)瑴p少了毒副作用。在pH 5.0 和pH 6.5 條件下，DOX 的釋放總量顯著提升，分別提高至84%和50.4%。結(jié)果表明：在酸性環(huán)境下，HAP 納米結(jié)構(gòu)逐漸降解，減弱了HAP 納米顆粒與DOX 之間的相互作用[2]，從而DOX 可以有效釋放，進(jìn)一步證明pH 敏感的HAP 具有作為納米載體運(yùn)輸藥物的潛力。

圖2 DOX@HAP的TEM(a)和SEM(b)圖；DOX@HAP、DOX@HAP?Cy和DOX@HAP?Cy?PEG 的DLS圖(c)，電勢(shì)電位圖(d)和PDI值(e)Fig.2 TEM(a)and SEM(b)images of DOX@HAP.DLS analysis(c),zeta potential(d)and PDI values(e)of DOX@HAP，DOX@HAP?Cy and DOX@HAP?Cy?PEG

2.5 細(xì)胞毒性

采用MTT 法測(cè)定了DOX@HAP?Cy?PEG 納米制劑對(duì)于Hela和HepG2腫瘤細(xì)胞的生物毒性(圖6)。如圖6(c)所示，Hela 和HepG2 細(xì)胞隨著DOX@HAP?Cy?PEG 濃度(0.25、0.5、1、25、50 和100 μg/ml)的增加，24 h 后的細(xì)胞存活率逐漸下降，分別為63.4%、53.8%和45.7%。作為對(duì)照，與不同濃度的HAP 和HAP?Cy?PEG 孵育的癌細(xì)胞的存活率約為100%[圖6(a)和(b)]，實(shí)驗(yàn)表明以HAP構(gòu)建的納米載藥系統(tǒng)HAP?Cy?PEG 作為藥物載體，具有良好的生物相容性。

圖3 DOX@HAP的XPS(a)和XRD(b)譜圖；HAP、DOX@HAP，DOX@HAP?Cy和DOX@HAP?Cy?PEG 的FTIR譜圖(c)Fig.3 XPS(a)and XRD(b)patterns of DOX@HAP.FTIR spectra(c)of HAP，DOX@HAP，DOX@HAP?Cy and DOX@HAP?Cy?PEG

2.6 雙通道熒光成像

圖4 DOX@HAP?Cy?PEG 的紫外可見(jiàn)吸收光譜(a)和熒光光譜(b)Fig.4 The absorption spectra(a)and fluorescence spectra(b)of DOX，Cy and DOX@HAP?Cy?PEG

利用激光共聚焦顯微鏡(CLSM) 對(duì)納米制劑DOX@HAP?Cy?PEG 在Hela和HepG2細(xì)胞的攝取行為進(jìn)行雙通道熒光成像。如圖7所示，DOX@HAP?Cy?PEG 與Hela 和HepG2 細(xì)胞共孵育4 h 后，在Hela 和HepG2細(xì)胞中分別檢測(cè)到DOX(λex=488 nm，λem=530～620 nm)和Cy(λex=640 nm，λem=680～780 nm)的熒光信號(hào)，說(shuō)明該納米制劑被癌細(xì)胞成功攝取。表明納米制劑DOX@HAP?Cy?PEG 可以通過(guò)雙通道熒光成像來(lái)監(jiān)測(cè)其在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布。

3 結(jié) 論

本文采用水熱共沉淀制備納米粒子DOX@HAP，進(jìn)一步通過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)和點(diǎn)擊反應(yīng)，構(gòu)建了一例微酸響應(yīng)的納米載藥體系DOX@HAP?Cy?PEG，通過(guò)TEM、SEM、粒度分析儀，F(xiàn)TIR、XPS 和XRD 對(duì)該納米載藥體系的形貌、粒徑、物相組成進(jìn)行表征分析，為均一的納米棒狀結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步利用UV?Vis 分光光度計(jì)檢測(cè)了該納米材料的藥物負(fù)載率以及體外藥物釋放曲線，驗(yàn)證了納米體系為酸性響應(yīng)行為，并采用MTT 法研究了該納米制劑對(duì)Hela和HepG2 腫瘤細(xì)胞的生物抑制作用。同時(shí)，利用DOX 和Cy 雙通道熒光成像的模式，監(jiān)測(cè)DDSs 在Hela 和HepG2 細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)分布。 表明DOX@HAP?Cy?PEG 納米載藥體系有望作為一種新型的治療與示蹤一體化的抗癌納米制劑。

圖5 在pH 3.0的PBS條件下處理DOX@HAP 24 h后，上清液的吸收光譜(a)；DOX濃度與吸光度的線性關(guān)系(b)；在不同pH下，DOX@HAP?Cy?PEG 中DOX的藥物釋放率(c)Fig.5 The absorption spectra of the supernatant liquid of DOX@HAP treated with PBS at pH 3.0 for 24 h(a).The linear relationship between UV absorption(λab=500 nm)and concentrations of DOX:(A=16.27C+0.0476)(b).Release profiles of DOX from DOX@HAP?Cy?PEG in PBS buffer with different pH(5.0,6.5,7.4)in 24 h(c)

圖6 不同濃度下，HAP(a)、HAP?Cy?PEG(b)和DOX@HAP?Cy?PEG(c)對(duì)Hela和HepG2細(xì)胞的毒性Fig.6 Dose?dependent cytotoxicity of Hela and HepG2 treated with HAP(a)，HAP?Cy?PEG(b)and DOX@HAP?Cy?PEG(c)at various concentrations

圖7 DOX@HAP?Cy?PEG 在Hela和HepG2細(xì)胞中孵育4 h后，雙通道熒光成像(標(biāo)尺:400 μm)Fig.7 CLSM images of Hela and HepG2 cells incubated with DOX@HAP?Cy?PEG for 4 h by dual channels fluorescence imaging

圖A1 PEG-alkyne的合成路徑
Fig.A1 Synthetic route of PEG-alkyne

圖A2 DOX@HAP-Cy-PEG的合成路徑
Fig.A2 Synthetic route of DOX@HAP-Cy-PEG

圖A3 化合物4的ESI-MS譜圖
Fig.A3 ESI-MS spectrum of compound 4

圖A4 化合物4的1H NMR譜圖
Fig.A41H NMR spectrum of compound 4

圖A5 Cy的ESI-MS譜圖
Fig.A5 ESI-MS spectrum of Cy

圖A6 Cy的1H NMR譜圖
Fig.A61H NMR spectrum of Cy

表A1 DOX@HAP的XPS元素分析
Table A1 XPS elemental analysis of DOX@HAP

Element P Ca CO Peak binding energy/eV 132.75 346.88 284.49 530.89 Content/%(atom)8.96 14.6 27.75 48.7