徐彥芹，秦釗，王燁，曹淵，陳昌國(guó)，王丹

（1重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶401331；2重慶大學(xué)煤礦災(zāi)害動(dòng)力學(xué)與控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶401331）

引 言

介孔材料（mobil composition of matters, MCM?41）具有可調(diào)可控的孔道、高比表面積等特點(diǎn)，使其在吸附[1]、催化[2]、傳感技術(shù)[3]及藥物輸送[4]等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。其中，利用介孔材料作為實(shí)現(xiàn)藥物緩控釋功能的載體，是近年來藥物遞送系統(tǒng)載體材料研究熱點(diǎn)之一[5]。MCM?41 作為載體應(yīng)用在緩釋給藥系統(tǒng)時(shí)，具有可調(diào)節(jié)的孔徑和粒徑、比表面積大、易于功能化、高度的生物相容性[6?9]等優(yōu)點(diǎn)，可控制藥物分子的吸附和釋放達(dá)到更好的緩釋給藥效果[10]。自2001年Vallet?Regi等[11]首次將MCM?41作為釋藥載體之后，越來越多的智能響應(yīng)（如：pH 響應(yīng)[12]、溫度響應(yīng)[13]、光響應(yīng)[14]、磁性[15]）的藥物載體被研發(fā)出來，具有良好的生物相容性、較高的載藥量、零提前釋放、可控的釋藥行為等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)[16]。

pH 響應(yīng)性MCM?41 是目前研究熱門的智能響應(yīng)藥物載體，能彌補(bǔ)化療缺乏專一性的缺陷，給癌癥的靶向治療提供了新的轉(zhuǎn)機(jī)[17?20]。如Gui 等[21]將溶菌酶分子修飾在MCM?41 納米球上，研究了RhB的pH 響應(yīng)性釋放行為；Zhao 等[22]將β?環(huán)糊精修飾在MCM?41上，研究了pH和光雙控的藥物響應(yīng)性釋放行為。pH 響應(yīng)性MCM?41 通常是在MCM?41 介孔孔道或者材料表面上，引入巰基、氨基、羧基等官能團(tuán)[23?25]，使其具有pH 響應(yīng)性。其中，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，氨基化MCM?41 主要通過嫁接法合成并研究其吸附性能，如Yue 等[26]將介孔材料浸漬在TEPA 中，制備氨基功能化材料，用于對(duì)CO2的吸附；Goscianska等[27?29]通過嫁接法將氨基官能團(tuán)負(fù)載在材料表面，通過回流制備氨基功能化介孔材料，對(duì)CO 和CO2有很好的吸附效果。而在孔道內(nèi)接枝有機(jī)官能團(tuán)的藥物載體及其釋藥性能的研究鮮見報(bào)道。MCM?41的有機(jī)修飾趨于復(fù)雜，藥物釋放效果有待提高。

本文將通過共縮聚法合成介孔MCM?41 納米微球，氨基化后再通過接枝法在NH2?MCM?41 孔道內(nèi)引入有機(jī)修飾后的苯胺基團(tuán)，得到改性的R?Ph?NH?MCM?41（其 中—R：—OH、—CH3、—COOH、

—CHO）藥物載體。羅丹明（RhB）是一種熒光染料，常用作載藥性能研究的模型藥物[30]，因此本文將采用RhB作為模型載藥，其釋藥示意圖如圖1所示。通過配制三種不同pH 的模擬體液，模擬人體胃部（pH 為0.9～1.5）、小腸（pH 為4.8～8.2）、口腔（pH 為6.6～7.1）[31]三種環(huán)境，研究不同—R 基團(tuán)藥物載體中氨基在不同pH 環(huán)境下的質(zhì)子化作用[12,32?33]，來達(dá)到控制藥物釋放的目的。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

N,N?二甲基甲酰胺(DMF)、鹽酸、氨水、甲醇、碳酸鉀，成都科龍化工試劑廠；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正硅酸乙酯（TEOS），天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；3?氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），阿拉丁試劑（上海）有限公司；羅丹明B（RhB），湖南湘中地質(zhì)研究所；以上均為分析純。對(duì)氯苯甲酸（99%）、對(duì)氯苯酚（98%）、對(duì)氯甲苯（97%）、對(duì)氯甲醛（98%），均來自阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 MCM-41的制備

將1.0 g CTAB 溶于100 ml 去離子水和70 ml 氨水的混合溶液中，加熱攪拌，待溫度到達(dá)60℃后，緩慢滴加5 ml TEOS，繼續(xù)攪拌7 h。室溫下放置7 h晶化，過濾，用去離子水及無水乙醇洗滌。60℃下真空干燥24 h 后，取1.0 g 產(chǎn)物加入到100 ml 質(zhì)量比為2.5%的鹽酸乙醇溶液回流24 h，以去除模板劑，洗滌至中性，真空干燥，制得純介孔二氧化硅，記為：MCM?41[34]。

1.3 NH2-MCM-41的制備

將1.0 g CTAB 溶于100 ml 去離子水和70 ml 氨水的混合溶液中，加熱攪拌，待溫度到達(dá)60℃后，緩慢滴加5 ml TEOS，1 h 后，緩慢滴加1.0 ml APTES，繼續(xù)攪拌6 h。室溫下放置7 h晶化，過濾，用去離子水及無水乙醇洗滌，60℃下真空干燥24 h。取1.0 g產(chǎn)物加入到100 ml 質(zhì)量比為2.5%的鹽酸乙醇溶液回流24 h，以去除模板劑，洗滌至中性，真空干燥，制得氨基改性介孔二氧化硅，記為：NH2?MCM?41[35]。

1.4 pH響應(yīng)型MCM-41的制備

1.4.1 Me?Ph?NH?MCM?41 的制備合成 取2 g NH2?MCM?41 溶于50 ml 甲醇溶液中，加入1 ml 對(duì)氯甲苯，在60℃下水浴反應(yīng)8 h，過濾，用甲醇溶液洗滌，60℃下真空干燥12 h，得到樣品，記為：Me?Ph?NH?MCM?41。

1.4.2 OHC?Ph?NH?MCM?41 的制備合成 取1.0 g 對(duì)氯苯甲醛溶于50 ml 甲醇溶液中，攪拌1 h 后，加入2 g NH2?MCM?41，在60℃下水浴反應(yīng)8 h，過濾，用甲醇溶液洗滌后加入到稀鹽酸溶液中攪拌0.5 h，過濾，洗滌，60℃下真空干燥12 h，得到樣品，記為：OHC?Ph?NH?MCM?41。

1.4.3 HO?Ph?NH?MCM?41 的制備合成 取3 g 碳酸鉀和1.5 g 對(duì)氯苯酚加入到50 ml 無水DMF 中，攪拌1 h 后，加入2 g NH2?MCM?41，在60℃下水浴反應(yīng)8 h，過濾，用乙醇溶液洗滌，后用稀鹽酸溶液和水溶液反復(fù)洗滌，真空60℃干燥12 h，得到樣品，記為：HO?Ph?NH?MCM?41。

1.4.4 HOOC?Ph?NH?MCM?41的制備合成 取3 g碳酸鉀和1.5 g 對(duì)氯苯甲酸加入到50 ml 無水DMF中，攪拌1 h 后，加入2 g NH2?MCM?41，在50℃下水浴反應(yīng)8 h，過濾，用乙醇溶液洗滌，后用稀鹽酸溶液和水溶液反復(fù)洗滌，60℃下真空干燥12 h，得到樣品，記為：HOOC?Ph?NH?MCM?41。

1.5 載藥介孔二氧化硅的制備

取50 mg上述的產(chǎn)物分別放入到含有1 mg羅丹明B（RhB）的4 ml 甲苯與乙醇的混合溶液（甲苯∶乙醇= 4∶1）中，超聲分散4 h，過濾洗滌后，將產(chǎn)物在60℃下真空干燥至恒重，得到負(fù)載RhB 的載藥介孔二氧化硅，分別記為：RhB@Me?Ph?NH?MCM?41、RhB@OHC?Ph?NH?MCM?41、 RhB@HO?Ph?NH?MCM?41、RhB@HOOC?Ph?NH?MCM?41。

1.6 材料的表征

采用X 射線衍射儀（XRD，日本島津，XRD?6000）、紅外光譜儀（FT?IR，Nicolet 公司，MagnaIR55 0II）、比表面積測(cè)定儀（BET，Micromeritics 公司，ASAP2020M）、馬爾文激光粒度分析儀（Malvern 公司，Zetasizer Nano）、掃描電子顯微鏡（SEM，F(xiàn)EI 公司，JSM?6490LV）對(duì)材料進(jìn)行表征。XRD 掃描范圍為2°～5°，掃描速度為0.5(°)/min，表征MCM?41 的晶體結(jié)構(gòu)及晶型。BET 表征將樣品置于180℃下脫氣12 h，并在77 K下進(jìn)行氮?dú)馕矫摳?，測(cè)算其比表面積、孔徑分布和孔容。FT?IR 采用KBr 壓片法，掃描波長(zhǎng)范圍為：450～4000 cm?1。馬爾文激光粒度儀測(cè)量材料的Zeta電位值以及SEM觀察材料表面形貌。

1.7 吸附性能測(cè)試

使用紫外可見熒光光譜儀（日本島津，RF5301?PC）通過熒光光度分析法來測(cè)定藥物載體對(duì)RhB 的吸附量。首先建立RhB 紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線，以無水乙醇為溶劑配制質(zhì)量濃度為250 μg/ml的RhB?無水乙醇溶液。掃描范圍為：551～572 nm，吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線為：ρ=0.00187Int+0.00441（其中ρ為RhB溶液質(zhì)量濃度（mg/L），Int 為溶液的熒光強(qiáng)度）。通過測(cè)定溶液中RhB 的濃度，根據(jù)式（1）和式（2）分別計(jì)算介孔二氧化硅的吸附量AC（adsorption capacity）和載藥量LC（loading capacity）。

式中，m0為RhB 的質(zhì)量，mg；ρ1為載體吸附后RhB 溶液的質(zhì)量濃度，mg/L；V1為吸附后RhB 溶液的體積，L；m為MCM?41的質(zhì)量，g。

1.8 釋藥性能測(cè)試

通過熒光光度分析法測(cè)定介孔二氧化硅對(duì)RhB的累積釋藥率Ri。稱取一定質(zhì)量M（40 mg）的RhB@SiO2樣品，加入到50 ml 不同pH 的緩沖溶液中，37℃下恒溫振蕩，間隔一定的時(shí)間（t）取3 ml，同時(shí)加入緩沖溶液3 ml。繪制吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線。建立RhB 在鹽酸（pH = 1.2）、磷酸二氫鉀?檸檬酸（pH =4.0）和硼砂?硼酸（pH=7.4）三種緩沖溶液體系的工作 曲 線 分 別 為 ：ρ=0.00555Int?0.02869、ρ=0.00283Int?0.00432、ρ=0.00198Int?03774。繪制t?Ri曲線，得到介孔二氧化硅的釋藥動(dòng)力學(xué)曲線，計(jì)算公式如式(3)：

式中，ρi為第i次移出液中測(cè)定的質(zhì)量濃度，mg/L；M為樣品質(zhì)量。

為了進(jìn)一步探究樣品在不同pH 下的釋藥行為 ，通 過 Zero?order、First?order、Hihuchi 和Korsmeyer?Peppas 等動(dòng)力學(xué)模型方程對(duì)不同pH 下的累積釋藥量和時(shí)間進(jìn)行擬合[36]，各動(dòng)力學(xué)模型方程如下。為t 時(shí)間內(nèi)的累積釋藥量；Q0為初始濃度；K0為所對(duì)應(yīng)的動(dòng)力學(xué)釋藥模型的動(dòng)力學(xué)常數(shù)；n為釋放指數(shù)。

在上述模型中，Korsmeyer?Peppa 釋藥模型是目前應(yīng)用最多的模型，結(jié)合了擴(kuò)散作用和溶蝕作用，認(rèn)為這兩種的協(xié)同作用是控制藥物釋放的關(guān)鍵。釋放指數(shù)n 值是作為Korsmeyer?Peppa 釋藥模型中控制藥物釋放作用的判斷依據(jù)，當(dāng)n＜0.45 時(shí)，藥物

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 X射線衍射譜圖（XRD）分析

圖2 分別是NH2?MCM?41、Me?Ph?NH?MCM?41、OHC?Ph?NH?MCM?41、HO?Ph?NH?MCM?41、HOOC?Ph?NH?MCM?41 的X 射 線 衍 射 譜 圖，從NH2?MCM?41 的 譜 圖 中，可 以 看 到 典 型 的 晶 面（100）的特征衍射峰，還有晶面（200）的特征衍射峰，可以判斷出NH2?MCM?41 屬于長(zhǎng)程有序的六方相孔結(jié)構(gòu)。對(duì)于其他的四條譜線，可以看到明顯的屬于MCM?41 的晶面（100）特征峰，為六方相孔結(jié)構(gòu)。

圖2 NH2?MCM?41和四種藥物載體的XRD譜圖Fig.2 XRD patterns of NH2?MCM?41 and four drug carriers

2.2 氮?dú)馕?脫附分析

圖3 分別是NH2?MCM?41、Me?Ph?NH?MCM?41、OHC?Ph?NH?MCM?41、HO?Ph?NH?MCM?41、HOOC?Ph?NH?MCM?41 的氮?dú)馕?脫附等溫線及孔徑分布圖。在低壓區(qū)樣品的吸附脫附等溫線呈現(xiàn)快速上升狀態(tài)，在中壓區(qū)上升趨勢(shì)有所緩解，在高壓區(qū)又出現(xiàn)快速上升趨勢(shì)。五種吸附?脫附等溫線都屬于Langmuir Ⅳ型吸附等溫線。圖中出現(xiàn)了回滯環(huán)，吸附?脫附等溫線屬于H4 型，根據(jù)回滯環(huán)的類型分析，得知孔屬于狹窄孔道結(jié)構(gòu)[37]?？捉Y(jié)構(gòu)參數(shù)見表1。

2.3 傅里葉紅外光譜（FT-IR）分析

圖3 NH2?MCM?41和四種藥物載體的氮?dú)馕?脫附等溫線和孔徑分布圖Fig.3 N2 adsorption/desorption isotherm and pore size distribution of NH2?MCM?41 and four drug carriers

表1 NH2-MCM-41和四種藥物載體的孔結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 The pore structural parameter of NH2-MCM-41 and four drug carriers

圖4為NH2?MCM?41及四種藥物載體的紅外光譜圖。從圖中可知5 個(gè)譜線在波長(zhǎng)為1080 cm?1為Si—O—Si 硅氧鍵的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，在800 cm?1為Si—O—Si 硅氧鍵的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，在950 cm?1為Si—O 硅羥基的彎曲振動(dòng)峰，以上均為二氧化硅的特征峰。而在2917 cm?1和2850 cm?1為亞甲基的伸縮振動(dòng)峰，1384 cm?1為C—H 彎曲振動(dòng)峰，1508 cm?1處為—NH—的振動(dòng)峰，在800 cm?1處同時(shí)也為苯環(huán)對(duì)位取代的特征峰，基本可以確定結(jié)構(gòu)—NH?Ph?R 的存在，在1645 cm?1處為樣品中水的彎曲振動(dòng)峰及C O 伸縮振動(dòng)峰，在譜線d 和e 中1205 cm?1處有一峰為C—O 伸縮振動(dòng)峰，從以上分析說明目標(biāo)載體已經(jīng)成功接枝上了響應(yīng)官能團(tuán)。

圖4 NH2?MCM?41和四種藥物載體的FT?IR譜圖Fig.4 FT?IR spectra of NH2?MCM?41 and four drug carriers

2.4 SEM分析

圖5 為四種藥物載體的SEM 圖。從SEM 圖中可以看出四種藥物載體形貌為六方棱柱，其中主要以短棱柱為主。四種不同的藥物載體是以NH2?MCM?41 為反應(yīng)底物制備的，本身形貌并沒有太大的差異，均為六方短棱柱形貌。

2.5 電位分析

表2中列出了NH2?MCM?41和四種藥物載體的Zeta 電位值。由表可以看出NH2?MCM?41 以及四種藥物載體的Zeta 電位值分別為+29.2、+8.1、+4.2、?15.7 和?31.4 mV。由于NH2?MCM?41 結(jié)構(gòu)中存在著氨基，氨基在水中呈現(xiàn)出正電荷，所以NH2?MCM?41 的Zeta 電位值為+29.2 mV。Me?Ph?NH?MCM?41、OHC?Ph?NH?MCM?41 中 的 —CH3、—CHO 兩種基團(tuán)在水中都呈現(xiàn)中性，但其Zeta 電位值分別為+8.1、+4.2 mV，這是因?yàn)榉磻?yīng)前體是NH2?MCM?41，反應(yīng)不能完全進(jìn)行，導(dǎo)致了氨基的殘留，所以在水中呈現(xiàn)正電荷。而對(duì)于HO?Ph?NH?MCM?41、HOOC?Ph?NH?MCM?41，其Zeta 電位值分別為?15.7、?31.4 mV，這是由于—OH、—COOH兩種基團(tuán)在水中都呈現(xiàn)電負(fù)性，且羧基的酸性比羥基的酸性強(qiáng)。綜上所述，可以得知基于不同苯胺基團(tuán)響應(yīng)體系已經(jīng)反應(yīng)接枝完成。

圖5 四種藥物載體電鏡圖Fig.5 SEM images of four drug carriers

表2 NH2-MCM-41和四種藥物載體的Zeta電位值Table 2 Zeta potential of NH2-MCM-41 and four drug carriers

表3 NH2-MCM-41和四種載藥載體的吸附量及載藥量Table 3 The adsorption capacity and drug loading capacity of four drug carriers and NH2-MCM-41

2.6 吸附及載藥分析

表3為NH2?MCM?41和四種不同載藥載體的吸附量和載藥量[計(jì)算方式詳見1.7 節(jié)中式（1）、式（2）]，RhB@NH2?MCM?41、RhB@Me?Ph?NH?MCM?41、RhB@OHC?Ph?NH?MCM?41、RhB@HO?Ph?NH?MCM?41、RhB@HOOC?Ph?NH?MCM?41 的 載藥量分別為16.60、12.94、13.27、12.94、12.65 mg/g。相比于NH2?MCM?41，四種載藥載體的載藥量減少，這是因?yàn)樵诤铣蛇^程中，內(nèi)部孔道壁上結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，孔道變小，孔容積變小，這使得載藥量有所降低。

2.7 釋藥分析

2.7.1 四種載藥載體的釋藥分析 四種藥物載體的累積釋藥百分比如表4所示，可以看出在pH=7.4的中性環(huán)境下累積釋藥量極低，而在pH = 4.0 以及pH=1.2 的酸性環(huán)境中累積釋藥量較高。說明載藥載體在中性非響應(yīng)環(huán)境下，幾乎沒有釋藥行為；而在酸性響應(yīng)環(huán)境下，釋藥性能較好，且酸性越強(qiáng)，累計(jì)釋藥量越高。

2.7.2 四種載藥載體的釋藥動(dòng)力學(xué)分析 從表5擬合結(jié)果中的相關(guān)系數(shù)R2來看，四種藥物載體的藥物釋放均符合Korsmeyer?Peppa 動(dòng)力學(xué)釋藥模型，且釋放指數(shù)n 值在不同pH 環(huán)境下都小于0.45，可以判斷出四種藥物載體藥物釋放主要是Fick 擴(kuò)散作用控制。

表4 四種載藥載體累積釋藥百分比Table 4 Cumulative drug release percent of four drug carriers

表5 四種藥物載體藥物釋放曲線擬合結(jié)果Table 5 Results of drug release curve fitting of four drug carriers

2.7.3 釋藥性能對(duì)比分析 圖6 是四種載藥載體RhB@Me?Ph?NH?MCM?41、 RhB@OHC?Ph?NH?MCM?41、RhB@HO?Ph?NH?MCM?41、RhB@HOOC?Ph?NH?MCM?41 在pH = 1.2、4.0 和7.4 時(shí)的釋藥曲線。由于四種不同載藥載體的藥物釋放主要作用是無規(guī)則的Fick 擴(kuò)散機(jī)制，那么對(duì)于四種不同的載體，影響其釋藥的主要原因是—R 基團(tuán)的作用。在pH=7.4 時(shí)，四種不同載體的釋藥量相差不大，均接近零釋放；而pH=4.0下的各載體釋藥量較pH=1.2下低，且不同—R 基團(tuán)的藥物載體釋藥量在同一pH環(huán)境下相差較大。可以得出：R?Ph?NH?MCM?41中的—R 基團(tuán)在中性的非響應(yīng)環(huán)境中，不同—R 基團(tuán)對(duì)載體釋藥量影響不大；而—R 基團(tuán)在酸性的響應(yīng)環(huán)境中，由于存在氨基質(zhì)子化作用，不同—R基團(tuán)對(duì)載體釋藥量影響較大，如在pH=1.2 時(shí)，RhB@Me?Ph?NH?MCM?41 釋 藥 百 分 比 為 34.63%，而RhB@HOOC?Ph?NH?MCM?41 釋 藥 百 分 比 為57.87%，后者為前者的1.67倍。因此，—R基團(tuán)只在酸性環(huán)境中發(fā)生作用，且酸性越強(qiáng)，影響越大，達(dá)到了緩控釋的效果。

3 結(jié) 論

以3?氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）修飾介孔二氧化硅，通過共縮聚合法合成NH2?MCM?41，再與對(duì)氯甲苯等有機(jī)物反應(yīng)得到R?Ph?NH?MCM?41藥物載體。通過表征、載藥和釋藥性能測(cè)試，表明材料具有良好的藥物控釋pH 敏感性。將Me?Ph?NH?MCM?41、OHC?Ph?NH?MCM?41、HO?Ph?NH?MCM?41、HOOC?Ph?NH?MCM?41 四種載體裝載RhB，載藥性能良好。通過體外釋藥模擬發(fā)現(xiàn)，四種載體都具有pH 響應(yīng)性，其中在pH=1.2的響應(yīng)條件下，由于存在氨基質(zhì)子化作用，四種載體累積釋藥量較高，分別為34.63%、52.03%、43.94%、57.87%；而在pH = 7.4 的非響應(yīng)條件下累積釋藥量極低，分別為3.21%、3.12%、3.06%、3.09%，幾乎達(dá)到零釋放。因此可通過調(diào)節(jié)pH 來達(dá)到藥物控釋的目的，其中HOOC?Ph?NH?MCM?41 藥物載體在用于藥物智能控釋材料方面具有一定的應(yīng)用潛力。