何家垣，蔣壯飛，馬蓉蓉，楊莉莉，李清瑤，譚玲，陳志濤，張起輝

（1 重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400044； 2 重慶大學(xué)藥學(xué)院，重慶400044）

引 言

紅車軸草（Trifolium pretense L.）藥用價值高，其提取物中富含芒柄花黃素、大豆素和鷹嘴豆芽素等多種黃酮類成分[1?4]。其中，芒柄花黃素具有預(yù)防癌癥、抗動脈粥樣硬化和抗氧化等作用[5?7]，還具有預(yù)防前列腺癌[8?10]和結(jié)腸癌[11]等藥理活性。作為黃酮類化合物，芒柄花黃素不但能夠防治多種癌癥和炎癥，而且還表現(xiàn)出更為廣泛的藥理作用和低毒性。然而，目前主要采用制備液相色譜和柱色譜來進(jìn)行芒柄花黃素的分離和預(yù)富集，而這些方法步驟煩瑣，且分離成本較高，這將會直接限制其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用[12?13]。

分子印跡聚合物（MIPs）是一種預(yù)設(shè)性固相吸附劑[14?17]，其制備過程簡便，擁有良好的穩(wěn)定性及較高的特異性吸附能力，特別適用于分離和富集中藥天然產(chǎn)物中的特定種類的物質(zhì)[18?20]。環(huán)境響應(yīng)型MIPs 的溶解性、聚合物連接方式和表面結(jié)構(gòu)會對所處環(huán)境中pH、磁性、光、溫度以及電等信號的改變做出響應(yīng)，因此會對吸附物質(zhì)表現(xiàn)出不同的吸附效果[21?27]。環(huán)境響應(yīng)型MIPs 中溫度響應(yīng)MIPs 與磁響應(yīng)MIPs 應(yīng)用廣泛，目前已成功應(yīng)用在藥物傳輸、色譜分離以及傳感器等領(lǐng)域[28?29]。

磁性分子印跡聚合物（MMIPs）是通過在磁性納米顆粒如Fe3O4或γ?Fe3O4的表面上涂覆MIP 膜來制備的，從而使MMIPs 結(jié)合了分子識別和快速磁分離的優(yōu)點[30]。此外，熱響應(yīng)分子印跡聚合物可以通過環(huán)境溫度變化來實現(xiàn)目標(biāo)分子的選擇性識別和釋放。聚N?異丙基丙烯酰胺（pNIPAM）被認(rèn)為是一種熱響應(yīng)性聚合物，并表現(xiàn)出優(yōu)異的熱響應(yīng)性，這是由于在33℃左右最低共溶溫度（LCST）附近存在可溶（親水）?不溶（疏水）可逆轉(zhuǎn)變[31]。NIPAM 的熱響應(yīng)行為可用于設(shè)計智能MIP，這可能是根據(jù)溫度變化更有效地吸附和釋放模板分子的理想方法[32]。

本文以納米Fe3O4作為支撐材料，模板選用芒柄花黃素，溫敏功能單體和輔助功能單體分別選用N?異丙基丙烯酰胺（NIPAM）和甲基丙烯酸（MAA），制備出磁性和溫度雙響應(yīng)型分子印跡材料（MTMIPs），隨后對MTMIPs 形貌進(jìn)行表征，并結(jié)合高效液相色譜法（HPLC）將其用于芒柄花黃素的定向萃取研究中，為探究新的天然產(chǎn)物富集方法奠定基礎(chǔ)。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗藥材

紅車軸草藥材購買于北京同仁堂（保存于保干器內(nèi)）。

1.2 MTMIPs制備

1.2.1 Fe3O4納米粒子的合成 磁性Fe3O4的合成方法為溶劑熱法[33]，具體操作步驟如下：量取30 ml 乙二醇于單頸燒瓶，加入1.35 g FeCl3·6H2O，磁力攪拌，形成溶液；然后將其放置于油浴鍋內(nèi)，加入400 mg 檸檬酸鈉與3.1 g 無水醋酸鈉，150℃的條件下磁力攪拌0.5 h；停止反應(yīng)后移入反應(yīng)釜中于200℃烘箱內(nèi)反應(yīng)8 h。終止反應(yīng)后用去離子水和乙醇反復(fù)多次洗滌Fe3O4產(chǎn)物,洗至中性后真空干燥（50℃）8 h。

1.2.2 制備Fe3O4@SiO2納米粒子 配制無水乙醇和超純水的混合溶液（4∶1，體積比）50 ml 于單頸燒瓶，加入0.1 g Fe3O4納米粒子后超聲20 min；隨后加入1 ml NH3·H2O 與500 mg 正硅酸乙酯于上述溶液中，冰水浴條件下超聲60 min。終止反應(yīng)后，用水和乙醇反復(fù)多次洗滌Fe3O4@SiO2產(chǎn)物，洗至中性后真空干燥（50℃）8 h。

1.2.3 制備磁性溫敏分子印跡材料（MTMIPs） 準(zhǔn)確稱取90 mg 芒柄花黃素超聲溶于900 μl 二甲亞砜中，形成溶液；隨后加入70 mg MAA、0.1 g NIPAM 與150 ml 乙醇后超聲溶解，避光反應(yīng)12 h；加入0.2 g Fe3O4@SiO2室溫振蕩60 min，再加入0.8 g 乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）與0.12 g 引發(fā)劑偶氮二異丁腈，搖勻后充氮氣保護(hù)，放置于恒溫振蕩搖床上，先后在40℃和60℃的條件下分別反應(yīng)6 h 和18 h。終止反應(yīng)后，利用外加磁場分離產(chǎn)物，隨后用洗脫液（甲醇?醋酸，9∶1，體積比）反復(fù)多次洗脫模板芒柄花黃素，隨后將聚合物用甲醇和水洗至中性，真空干燥（45℃）后將制備好的TMMIP 密封保存，上述步驟如圖1所示。

圖1 磁性溫敏MTMIPs的合成過程Fig.1 Schematic diagram of the synthesis process of magnetic temperature?sensitive MTMIPs

非分子印跡聚合物（MTNIPs）的制備過程同上所述，唯一差別是在制備MTNIPs 的過程中不加入模板分子。

1.3 吸附實驗

1.3.1 溫敏性能考察 以80%甲醇為溶劑溶解芒柄花黃素標(biāo)準(zhǔn)品配制芒柄花黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液（20～400 μg/ml），分 別 向 其 中 加 入3 mg MTMIPs 和3 mg MTNIPs，在搖床上以90 r/min的轉(zhuǎn)速，分成三組（25、35、45℃）平行吸附12 h。吸附終止后，在磁場的作用下分離材料后取上清液過濾待測，每組平行實驗三次。HPLC 進(jìn)行定量分析，通過測定上清液中芒柄花黃素濃度和其初始濃度，分別求得各組MTMIPs與MTNIPs的吸附量。計算公式如式（1）：

式中，Q 為吸附量，mg/g；C0為芒柄花黃素初始濃度，μg/ml；Ce為平衡后上清液中芒柄花黃素的濃度，μg/ml；V 為加入的芒柄花黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，ml；m為加入的印跡材料的質(zhì)量，mg。

1.3.2 靜態(tài)吸附實驗 以80%甲醇為溶劑溶解芒柄花黃素標(biāo)準(zhǔn)品配制芒柄花黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液（20～400 μg/ml），分 別 向 其 中 加 入3 mg MTMIPs 和3 mg MTNIPs，在恒溫振蕩搖床上以90 r/min 的轉(zhuǎn)速、35℃的條件下吸附12 h。吸附終止后，在磁場的作用下分離材料后取上清液過濾待測，每組平行實驗3次。HPLC 進(jìn)行定量分析，通過濾液和母液中的芒柄花黃素濃度，利用式（1）分別求得MTMIPs 與MTNIPs的吸附量。

1.3.3 吸附動力學(xué)實驗 以80%甲醇溶液為溶劑配制80 μg/ml 的芒柄花黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別向其中加入3 mg MTMIPs和3 mg MTNIPs，在恒溫振蕩搖床上以90 r/min 的轉(zhuǎn)速，在35℃的條件下，分別振蕩5、10、20、30、40、60、80 和100 min。吸附終止后，在磁場作用下分離材料后取上清液過濾待測，每組平行實驗3次。HPLC進(jìn)行定量分析，通過濾液和母液中的芒柄花黃素濃度，利用式（2）分別求得MTMIPs 和MTNIPs的吸附量。計算公式如式（2）：

式中，Q 為聚合物的吸附量，mg/g；Ct為吸附后模板濃度，μg/ml；C0為初始模板分子濃度，μg/ml；V為芒柄花黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；m為加入的印跡材料的質(zhì)量，mg。

1.4 選擇性實驗

選取大豆苷元和染料木素為競爭性干擾物質(zhì)，考察制備的聚合物對芒柄花黃素的選擇性以及特異性吸附能力。將3 mg MTMIPs 或3 mg MTNIPs 加入含有80 μg/ml 大豆苷元、芒柄花黃素和染料木素的混合溶液中，隨后放置于搖床（35℃，90 r/min）上吸附12 h。終止吸附后，在磁場作用下分離材料后取上清液過濾待測，每組平行實驗三次，HPLC 進(jìn)行定量分析。

1.5 紅車軸草提取及MTMIPs的應(yīng)用

1.5.1 紅車軸草提取 將100 ml 的70%乙醇加入到20 g已過二號篩的藥材干燥粉末中，提取3次，過濾后取濾液繼續(xù)用等體積量的石油醚連續(xù)萃取3次，減壓蒸餾上層溶液，濃縮得浸膏。甲醇溶解浸膏待用。大孔樹脂（D101）裝柱，取上述浸膏溶液上柱，吸附后依次用20%、40%、60%、80%和95%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，而后選取60%乙醇的洗脫液，將其進(jìn)行減壓濃縮即得浸膏。

1.5.2 MTMIPs 的實際應(yīng)用 取6 mg 浸膏溶于3 ml甲醇中，加入10 mg MTMIPs，在恒溫振蕩搖床（35℃）上以90 r/min的轉(zhuǎn)速吸附12 h。終止吸附后，利用外加磁場將聚合物材料與溶液分離開。用1 ml洗脫液（甲醇?醋酸，9∶1，體積比）超聲1 min 洗脫MTMIPs，重復(fù)三次，合并上述洗脫液，再利用HPLC進(jìn)行定量分析。

1.5.3 HPLC 分析 HPLC 分析條件：Agilent 1260，色譜柱為TC?C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm)，進(jìn)樣量為10 μl，流速0.6 ml/min，柱溫30℃，以水（A）和甲醇（B）作為流動相梯度洗脫，0～35 min, 55%～75% B;35～40 min,75%～95%B;40～45 min,95%～55%B。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 MTMIPs的形貌表征

Fe3O4@SiO2納米粒子和MTMIPs的SEM、TEM表征圖如圖2 所示。由圖2(a)可知Fe3O4@SiO2納米粒子粒徑較均一（250 nm），表面光滑度較高，呈現(xiàn)為單分散的球形顆粒。包裹聚合層后，MTMIPs 呈現(xiàn)為表面較粗糙的球形顆粒，大小粒徑相對均勻，直徑約450 nm[圖2(b)]。由圖2(c)可知，制備得到的MTMIPs 核殼結(jié)構(gòu)明顯，可以清晰看到100 nm 左右的SiO2殼層已經(jīng)成功均勻地包裹在磁性Fe3O4核上。

2.2 MTMIPs的結(jié)構(gòu)特性

2.2.1 紅外光譜分析 Fe3O4@SiO2與MTMIPs 的FT?IR圖如圖3(a)，圖中1095 cm?1處出現(xiàn)SiO2殼層中Si—O 的 伸 縮 振 動 峰，且591 cm?1處 有Fe3O4核 中Fe—O 的伸縮振動峰，圖中證據(jù)表明載體Fe3O4已成功包裹上SiO2。MTMIPs紅外光譜圖中，1730 cm?1處的峰為EGDMA 中C O 的伸縮振動峰，這表明EGDMA 已經(jīng)成功包裹在材料表面，MTMIPs 成功合成。

2.2.2 TGA 分析 圖3(b)是MTMIPs 的熱重分析（TGA）曲線。剛開始MTMIPs 的質(zhì)量減少了5.02%（25～400℃），這是由MTMIPs 中以物理方式結(jié)合水分與游離水分的損失所致[34]。100～240℃時MTMIPs質(zhì)量損失非常少，表明此溫度范圍內(nèi)，MTMIPs 非常穩(wěn)定。240～500℃，MTMIPs質(zhì)量損失約為75%，是由該印跡材料表面的有機物完全分解所致。因此證實制備得到的MTMIPs的熱穩(wěn)定性良好。

2.2.3 磁學(xué)性質(zhì)表征 Fe3O4和MTMIPs磁化曲線如圖3(c)所示。Fe3O4與MTMIPs 納米粒子均具有超順磁性，由圖可知其飽和磁化強度為Fe3O4（61.91 emu/g）與MTMIPs（5.33 emu/g）。在 磁 場 的 作 用 下，MTMIPs 從樣品基質(zhì)中分離僅需50 s，證明MTMIPs適用于磁性萃取分離。

2.2.4 X 射線衍射表征 在Fe3O4的XRD 譜圖中，2θ=62.87°,53.39°,43.17°,43.17°,35.66°,30.45°處的峰分別為Fe3O4納米粒子（440）、（511）、（422）、（400）、（311）、（220）晶面衍射特征峰[35]。Fe3O4經(jīng)二氧化硅修飾后以及MTMIPs的XRD譜圖的特征衍射峰未消失，并且沒有出現(xiàn)其他雜質(zhì)峰，證明在MTMIPs 的合成過程中，納米Fe3O4的晶體結(jié)構(gòu)沒有被破壞。

2.3 MTMIPs的溫敏性考察

圖2 Fe3O4@SiO2和MTMIPs 電鏡表征圖：Fe3O4@SiO2掃描電鏡圖（a）；MTMIPs 掃描電鏡圖（b）；MTMIPs 透射電鏡圖（c）Fig.2 SEM images of Fe3O4@SiO2NPs(a),MTMIPs(b),and TEM of MTMIPs(c)

圖3 MTMIPs與Fe3O4@SiO2的FT?IR圖（a）；MTMIPs 的TGA分析曲線（b）；MTMIPs與Fe3O4的磁性分析（VSM）曲線（1 Oe=79.5775 A/m）（c）；Fe3O4、MTMIPs與Fe3O4@SiO2的XRD譜圖（d）Fig.3 FT?IR spectra of MTMIPs and Fe3O4@SiO2(a);TGA analysis curves of MTMIPs(b);Magnetization curves of MTMIPs and Fe3O4 nanoparticles(c);XRD pattern of Fe3O4,Fe3O4@SiO2 and MTMIPs nanoparticles(d)

圖4 MTMIPs的溫敏吸附圖Fig.4 Temperature?sensitive adsorption spectra of MTMIPs

MTMIPs 溫敏吸附曲線如圖4 所示。當(dāng)聚合物材料吸附達(dá)到平衡后，MTMIPs 不同溫度下的吸附量為11.34 mg/g（25℃）、16.43 mg/g（35℃）和9.31 mg/g（45℃）。35℃時MTMIPs的吸附量明顯優(yōu)于25℃和45℃；45℃條件下的吸附量最小。最大吸附容量在35℃時達(dá)到，接近聚N?異丙基丙烯酰胺（pNIPAM）的最低共溶溫度(LCST)33℃，這是因為此時聚合物的空腔達(dá)到了印跡狀態(tài)。當(dāng)溫度降至低于LCST 的25℃時，TMMIPs 具有高度親水性，水分子容易擴散到TMMIPs 中，導(dǎo)致聚合物溶脹，因此，模板和聚合物之間的距離隨著氫鍵相互作用的減弱而增加；但是，當(dāng)溫度達(dá)到比LCST 高的45℃時，聚合物具有相同的趨勢，因為與35℃相比，其吸附量較小，因此，聚合物變得疏水和收縮，導(dǎo)致塌陷狀態(tài)。由于吸附效率的原因，以下實驗選擇了35℃作為最佳溫度。上述結(jié)果證明制備得到的MTMIPs 納米粒子具有明顯的溫敏吸附特性，適用于溫敏型萃取分離。

2.4 MTMIPs的靜態(tài)吸附

MTMIPs 和MTNIPs 的靜態(tài)吸附實驗發(fā)現(xiàn)合成的聚合物芒柄花黃素的吸附量隨著芒柄花黃素初始濃度的增加而增加。當(dāng)聚合物材料的吸附達(dá)到動態(tài)平衡后，平衡時MTMIPs 的吸附量16.43 mg/g 是MTNIPs（6.96 mg/g）的2.4 倍。這表明MTMIPs 表面形成的模板分子特異性空穴對其更高吸附量提供了貢獻(xiàn)。

Langmuir 與Freundlich 方程用于上述實驗結(jié)果的擬合分析，方程如式(3)～式(4)所示：

式中，Qe為MTMIPs 和MTNIPs 平衡時的吸附量，mg/g；Ce為模板分子的濃度，mg/g；Qm為材料的最大吸附量，mg/g。得到的平衡常數(shù)和相關(guān)參數(shù)如表1 所示，Langmuir 模型相較于Freundlich 模型有更高的R2（0.994），因此本文制備得到的MTMIPs 更符合Langmuir 吸附模型，通常Langmuir 模型被認(rèn)為是單層吸附理論，而Freundlich 模型則被認(rèn)為是單層吸附和多層吸附相結(jié)合，表明本實驗的MTMIPs 對模板分子的吸附是以單層吸附為主要吸附方式的復(fù)雜吸附。

表1 等溫吸附模型擬合參數(shù)Table 1 The fitting parameters of isothermal adsorption model

2.5 MTMIPs的動力學(xué)特性

MTMIPs 和MTNIPs 的吸附動力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MTMIPs 和MTNIPs 對芒柄花黃素的吸附量隨著時間的增加而增加。經(jīng)過1 h 的吸附過程MTMIPs 和MTNIPs 全部達(dá)到平衡吸附。相較于MTNIPs，由于MTMIPs 具有特異性的模板分子空穴，其花費更長時間達(dá)到吸附平衡，此外MTMIPs 對芒柄花黃素的吸附量遠(yuǎn)高于MTNIPs，表明MTMIPs 對靶標(biāo)分子具有更大的親和力。

進(jìn)一步對MTMIPs 和MTNIPs 進(jìn)行二級動力學(xué)數(shù)據(jù)模擬，結(jié)果如式(5)～式(6)

式中，K1代表一級動力學(xué)常數(shù)，min?1；K2代表二級動力學(xué)常數(shù)，g/(mg·min)；t 代表吸附時間，min；Qe和Qt分別代表在平衡時的吸附量和時間t 的最大吸附量，mg/g。相關(guān)參數(shù)如表2所示，相較于準(zhǔn)一級動力學(xué)，準(zhǔn)二級動力學(xué)具有較高的相關(guān)系數(shù)，更符合MTMIPs 對芒柄花黃素的吸附。這也進(jìn)一步表明，化學(xué)吸附是MTMIPs吸附過程中的決速步驟。

表2 吸附動力學(xué)模型擬合參數(shù)Table 2 The fitting parameters of adsorption kinetics model

2.6 MTMIPs的選擇性實驗及方法學(xué)考察

2.6.1 選擇性實驗 MTMIPs 和MTNIPs 對芒柄花黃素的選擇性考察如圖5 所示，選取芒柄花黃素及其結(jié)構(gòu)類似物如染料木素和大豆苷元等作為競爭性吸附物質(zhì)。從圖中可知，MTMIPs 對芒柄花黃素的吸附量（6.91 mg/g）最大，計算得到印跡材料對芒柄花黃素、染料木素和大豆苷元的印跡因子（imprinting factor，IF=QMIP/QNIP,QMIP和QNIP分別為MIP和NIP 對目標(biāo)物質(zhì)的吸附量）分別為1.56、1.15、0.83，其中印跡材料對芒柄花黃素的印跡因子最高，表明MTMIPs 對芒柄花黃素具有選擇性吸附特性。而MTNIPs 由于對芒柄花黃素沒有選擇性，所以其對芒柄花黃素、大豆苷元以及染料木素的吸附量差別沒有MTMIPs大。

2.6.2 選擇性研究的方法學(xué)考察 表3列出了本實驗選擇性研究的方法學(xué)考察數(shù)據(jù)，日間和日內(nèi)精密度、標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍、定量限（LOQ）和檢出限（LOD）以及相關(guān)系數(shù)如表所示。由表可知，MTMIPs的選擇性實驗中模板分子及其結(jié)構(gòu)類似物的線性范圍為5～100 μg/ml，相關(guān)系數(shù)都大于0.99。

表3 選擇性研究中的方法學(xué)考察數(shù)據(jù)Table 3 Data of methodological examination in selective research

圖5 MTMIPs選擇性考察的HPLC圖（a）;MTMIPs和MTNIPs對芒柄花黃素、染料木素和大豆苷元選擇性考察（b）Fig.5 HPLC diagrams of MTMIPs selectivity study(a);Selection adsorption of formononetin,genistein and daidzein by MTMIPs and MTNIPs(b)

3 MTMIPs的實際應(yīng)用

紅車軸草粗提物用MTMIPs 萃取后的分析結(jié)果如圖6 所示。制備的MTMIPs 納米粒子萃取粗提物后，洗脫液中芒柄花黃素的液相峰相較其他液相峰明顯，且萃取后粗提物中其他液相峰未發(fā)現(xiàn)有明顯變化，說明磁性溫敏聚合物MTMIPs 能夠選擇性地從粗提物中萃取目標(biāo)物質(zhì)，具備從復(fù)雜基質(zhì)中特異性磁性萃取分離模板芒柄花黃素的特性。

圖6 MTMIPs實際應(yīng)用HPLC圖：（1）芒柄花黃素母液HPLC圖;（2）洗脫液的HPLC圖;（3）粗提物經(jīng)萃取后的HPLC圖;（4）粗提物的HPLC圖Fig.6 HPLC diagrams of the MTMIPs practical application:(1)HPLC diagram of the formononetin mother solution;(2)The HPLC diagram of MTMIPs eluents;(3)HPLC diagram of crude extracts after MTMIPs absorbed;(4)HPLC diagram of crude extracts from Trifolium pratense L.

4 結(jié) 論

本研究采用磁性和溫度環(huán)境響應(yīng)策略，以低成本和綠色化學(xué)理念，利用表面分子印跡技術(shù)成功制備出具有芒柄花黃素特異性識別能力的磁性溫敏分子印跡材料MTMIPs，該聚合物具有良好的磁性、熱穩(wěn)定性以及溫敏特性，具有較強的選擇性。文中利用MTMIPs 成功實現(xiàn)了從紅車軸草粗提物復(fù)雜體系中，高效富集和分離目標(biāo)化合物芒柄花黃素，表明MTMIPs 可用于復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)物質(zhì)的選擇性磁性萃取分離，具有較高的實用前景。綜上所述，本文為研究中藥材中的天然活性成分提供了一種良好的固相萃取填料。