蔣壯飛，何家垣，馬蓉蓉，李清瑤，楊莉莉，譚玲，張起輝

（1 重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400044； 2 重慶大學(xué)藥學(xué)院，重慶400044）

引 言

在蕓香科柑橘屬植物中，檸檬是常見的一種，其化學(xué)成分主要包括維生素類、黃酮類和生物堿類化合物。檸檬整株植物以根與果最有藥用價值，故常以這兩個部分入藥，具有化痰止咳，緩解支氣管炎和抗炎抗氧化等作用。在醫(yī)療過程中，檸檬還可以用于預(yù)防和治療高血壓、心臟病等[1?3]。中國柑橘類水果年產(chǎn)量僅次于巴西，大多數(shù)柑橘被直接作為鮮果食用，但由于銷售總量有限，許多新鮮水果腐爛變質(zhì)，經(jīng)濟損失巨大。為了解決這些問題，柑橘類水果主要往榨汁的方向發(fā)展，但是榨汁所引起的“后苦味”影響了果汁的口感。水果自身不苦，“后苦味”是指在榨汁和儲存期間，水果生成了具有苦味的物質(zhì)，使果汁帶有苦味。研究表明，檸檬汁的苦味主要是由其中的吳茱萸內(nèi)酯引起的。其原理是：在酸性條件下，當(dāng)檸檬果肉組織處于冰凍狀態(tài)或受到機械碰撞時，在內(nèi)酯環(huán)水解酶的存在下，苦味物質(zhì)前體被水解，轉(zhuǎn)化為苦味物質(zhì)吳茱萸內(nèi)酯（C26H30O8，分子量：470.53，白色、味苦，結(jié)晶狀，易溶于酯性有機溶劑，難溶于水，在甲醇、乙醇中溶解度較大），使果汁變苦[4?7]。

目前，檸檬汁苦味的去除包括物理、化學(xué)和生物方法，如吸附技術(shù)[8]、膜分離技術(shù)[9?10]、包埋法[11]、酶法脫苦[12]、微生物脫苦、pH 調(diào)節(jié)、超臨界流體CO2萃取和酶解等[8,13?16]。其中，吸附技術(shù)因其經(jīng)濟效益高而得到最廣泛的應(yīng)用。吸附劑的性質(zhì)好壞是影響吸附效果強弱的重要因素之一。目前市場上常用的吸附劑有樹脂和鍵合硅膠等。這些吸附劑面臨著耗時、不完全去除苦味物質(zhì)和非特異性等問題。因此，開發(fā)一種高效、快速、特異性的吸附劑是去除檸檬汁中吳茱萸內(nèi)酯的迫切需要。

近年來，分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）由于其高特異性而得到了廣泛的關(guān)注。在含有模板分子的溶液中，加入功能單體和交聯(lián)劑，在特定的條件下聚合，并用適當(dāng)?shù)南疵搫┤コ０宸肿右垣@得MIPs。然而，本體分子印跡聚合物的應(yīng)用受到識別位點數(shù)量有限以及大多數(shù)印跡位點嵌入高剛性聚合物基質(zhì)中這一事實的限制。表面分子印跡聚合物（surface molecularly imprinted polymers，SMIPs）的出現(xiàn)解決了傳統(tǒng)分子印跡聚合物分離效率低和分離費時的問題[17]。SMIPs 是指在支撐材料表面上的分子印跡層聚合形成了核殼結(jié)構(gòu)的聚合物，提高了印跡效率并加快傳質(zhì)速度[18]。本研究選擇穩(wěn)定性良好，生物兼容性穩(wěn)定，易于制備和功能化的SiO2納米顆粒作為支持材料[19?26]。

本文采用表面印跡法合成吳茱萸內(nèi)酯的分子印跡聚合材料，優(yōu)化反應(yīng)條件，并通過透射電子顯微鏡（TEM）和傅里葉紅外（FT?IR）對所得分子印跡聚合物材料進行表征。最后，通過高效液相色譜（HPLC）測定檸檬汁中吳茱萸內(nèi)酯在吸附前后的含量，結(jié)果表明SMIPs 能夠很好地吸收檸檬汁中的吳茱萸內(nèi)酯。

1 實驗部分

1.1 實驗藥材

從四川安岳購買的新鮮檸檬，在4℃條件下榨汁并保存。

1.2 二氧化硅粒子的合成及修飾

用斯托伯法（St?ber）合成均相SiO2顆粒[27]，室溫下在平底燒瓶中加入49 ml 乙醇，4 ml 水和3.2 ml 氨水。在上述混合溶液中加入51 ml 乙醇和6 ml 原硅酸乙酯，繼續(xù)攪拌24 h，高速離心后得到白色沉淀，用乙醇和水分別洗滌3 次，于真空條件下干燥12 h，得到白色SiO2顆粒。

通過對二氧化硅顆粒進行兩步改性制備了丙烯酰胺（APTES）改性的二氧化硅。首先，將APTES接枝到SiO2的表面。 將0.4 g SiO2顆粒超聲分散在100 ml新蒸無水甲苯中。加入8 ml APTES，在N2環(huán)境下回流12 h，得到APTES修飾的SiO2顆粒，隨后用無水甲苯洗滌，然后再次分散在無水甲苯中。將8 ml 丙烯酰氯和100 ml 無水甲苯與APTES 改性的SiO2懸浮液混合，并加入適量的無水碳酸鉀作為催化劑。在室溫下，于N2環(huán)境中磁力攪拌12 h，然后在10000 r/min 的條件下離心10 min。其次，依次用甲苯、水和乙醇洗滌所得產(chǎn)物3次，并在50℃下真空干燥12 h，以獲得表面具有雙鍵的改性SiO2顆粒。

1.3 制備分子印跡材料

將100 μl 甲基丙烯酸MAA（功能單體），235 mg吳茱萸內(nèi)酯（模板）溶于100 ml 乙腈中，預(yù)聚合6 h。加入100 mg 改性SiO2、1688 mg 乙二醇二甲基丙烯酸酯EGDMA（交聯(lián)劑），10 mg 偶氮二異丁腈AIBN（引發(fā)劑）和40 mg 無水碳酸鉀（催化劑）后，N2脫氧10 min，在冰水浴中浸泡10 min，然后在磁力攪拌下于60℃反應(yīng)6 h 和70℃反應(yīng)24 h。離心得到的聚合物材料，依次用乙醇和水洗滌3 次并于50℃真空干燥。在甲醇∶冰醋酸（9∶1）混合洗滌溶液中，用索氏提取回流洗脫吳茱萸內(nèi)酯24 h。最后，將含有吳茱萸內(nèi)酯孔穴的SMIPs 用水清洗，并在真空干燥箱中于45℃干燥24 h。

非分子印跡聚合物（NIPs）即在不存在模板分子吳茱萸內(nèi)酯的情況下，用上述同樣方法制備。

1.4 吸附實驗

植物中吳茱萸內(nèi)酯的含量約為40 μg/ml，因此選擇該濃度作為動態(tài)吸附溶劑的濃度。將10 mg SMIPs 或NIPs加入到6 ml 40 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)吳茱萸內(nèi)酯溶液中?；旌衔镌跉庠『銣卣袷幤髦幸?05 r/min，35℃分別吸附10、20、40、60、80、100、120、180、240 min，每組平行實驗3 次。每組樣品取上清液進行HPLC分析。吸附量（Q）用式(1)計算：

其中，Q代表吸附量;Ci(μg/ml)和Ce(μg/ml)分別代表吳茱萸內(nèi)酯吸附前后的濃度;V 代表萃取的體積;m代表SMIPs或NIPs的質(zhì)量。

靜態(tài)吸附實驗的操作與上述實驗相似。在6 ml吳茱萸內(nèi)酯溶液中添加10 mg SMIPs 或NIPs，其中，吳茱萸內(nèi)酯的濃度范圍是5～500 g/ml?；旌衔锶匀灰?05 r/min 和35℃在振蕩器上吸附60 min，每組實驗平行進行3次。通過HPLC分析各組的上清液，并根據(jù)式(1)計算吸附量。

1.5 選擇性實驗

以諾米林和黃柏酮為競爭性干擾物質(zhì)，研究了分子印跡聚合物對吳茱萸內(nèi)酯的選擇性和特異性吸附能力。將15 mg SMIPs或NIPs加入含有300 μg/ml 吳茱萸內(nèi)酯、諾米林和黃柏酮的混合溶液中，在振蕩器上吸附60 min，取上清液，用HPLC 檢測吳茱萸內(nèi)酯、諾米林和黃柏酮吸附前后的濃度，根據(jù)式（1）計算出SMIPs 和NIPs 對各個物質(zhì)的吸附量，每組平行實驗3次。

1.6 印跡聚合物的應(yīng)用

將檸檬榨汁，于4℃保存過夜，隨后15000 r/min離心15 min，加入適量甲醇以沉淀檸檬汁中的蛋白質(zhì)。然后，將50 mg SMIPs 加入5 ml 上述制備檸檬汁中，在振蕩器上吸附60 min。吸附完全后，通過離心收集SMIPs，用2 ml 甲醇超聲洗脫吸附的吳茱萸內(nèi)酯。洗脫液揮干，用3 ml 甲醇復(fù)溶，HPLC 檢測吳茱萸內(nèi)酯的濃度[28]，每組平行實驗3次。

1.7 高效液相分析

HPLC分析條件：采用Agilent 1260系統(tǒng)，色譜柱為TC?C18柱子（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速0.6 ml/min，柱溫30℃。以55%的乙腈和45%的0.1%磷酸水溶液作為流動相。進樣量10 μl，檢測波長210 nm。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 分子印跡聚合物的制備

分子印跡聚合物合成過程如圖1 所示。首先，對SiO2進行化學(xué)修飾，得到含有雙鍵的SiO2納米粒子；然后，在SiO2表面聚合上分子印跡層；最后，洗脫模板，得到具有印跡空穴的SMIPs。

圖1 表面分子印跡材料的合成示意圖及其脫苦步驟Fig.1 Schematic representation of the preparation of surface molecularly imprinted materials and the process of debitterization

為了提高SMIPs的吸附效率，本文考察了模板、功能單體和交聯(lián)劑之間的比例，每組平行實驗3次。在預(yù)聚合過程中，MAA 的羧基與吳茱萸內(nèi)酯通過氫鍵結(jié)合。在預(yù)聚合過程中，功能單體越多，越容易和模板分子之間形成氫鍵，然而，過量的功能單體會使非特異結(jié)合位點的數(shù)量增加，并且自身會結(jié)合，使得有效的結(jié)合位點數(shù)量下降。本文考察了不同模板與功能單體的比例（1∶1～1∶5）,如圖2（a）所示，在吳茱萸內(nèi)酯與MAA 摩爾比為1∶2 時，合成的SMIPs 具有最大的吸附量。類似地，功能單體和交聯(lián)劑的比例影響SMIPs 吸附效果。交聯(lián)劑過少會導(dǎo)致交聯(lián)度不夠，識別能力降低，而過度交聯(lián)則會導(dǎo)致聚合物過于剛性，難以達到吸附平衡，且模板移除不徹底。本文考察了功能單體和交聯(lián)劑1∶4～1∶7 的摩爾比，結(jié)果如圖2（b）所示，最好的摩爾比為1∶6。

圖2 合成條件的優(yōu)化Fig.2 Optimization of synthesis conditions

2.2 SMIPs表征

改性SiO2、SMIPs 的紅外光譜和透射電子顯微鏡結(jié)果如圖3 所示。根據(jù)TEM 圖像顯示[圖3(b)、(c)]，改性SiO2表面光滑，直徑約50 nm，相比之下，SMIPs 表面粗糙，且直徑更大，這說明分子印跡聚合層成功聚合到二氧化硅表面。透射電鏡結(jié)果表明SMIPs 具有清晰的核?殼結(jié)構(gòu)，證明SMIPs 成功合成。

SiO2、改性SiO2、SMIPs 和NIPs 的紅外譜圖如圖3（a）所示。SiO2在1106 cm?1處有明顯的不對稱Si—O—Si 伸縮振動，在800 cm?1處有對稱Si—O—Si伸縮振動，在944 cm?1處有Si—OH 振動。改性的二氧化硅粒子在1740 cm?1、1446 cm?1峰分別對應(yīng)于酯鍵的C O 和氨基基團。這說明丙烯酰氯和APTES成功修飾到二氧化硅表面。SMIPs和NIPs紅外譜圖中位于2945 cm?1和1263 cm?1的峰分別對應(yīng)于來自EGDMA 的—CH3和C—O—C，且MIPs 和NIPs 的紅外譜圖類似。綜上，紅外譜圖也證明了表面分子印跡材料的成功合成。

圖3 表面分子印跡材料的表征Fig.3 Characterization of surface molecularly imprinted materials

2.3 SMIPs吸附實驗

圖4 材料的吸附性能Fig.4 Adsorption capacity of materials

2.3.1 動態(tài)吸附 SMIPs和NIPs的動態(tài)吸附曲線如圖4（a）所示。SMIPs對吳茱萸內(nèi)酯的吸附量隨著吸附時間的增加而逐漸增加，直至60 min 達到平衡，最大的吸附量為5.76 mg/g。相比于SMIPs，NIPs 在40 μg/ml 吳茱萸內(nèi)酯濃度下，其吸附量基本保持不變，且吸附量很低。這表明在低濃度條件下，NIPs由于其表面沒有特異性識別位點存在，對吳茱萸內(nèi)酯基本沒有吸附作用。采用一級動力學(xué)模型和二級動力學(xué)模型來分析動態(tài)吸附過程：

式中，K1(min?1)和K2(g/(mg·min))分別代表一級動力學(xué)常數(shù)和二級動力學(xué)常數(shù)；t 代表吸附時間；Qt和Qe分別代表在時間t 時的最大吸附量和平衡時的吸附量。相關(guān)參數(shù)如表1 所示。結(jié)果表明，實驗數(shù)據(jù)更符合二級動力學(xué)，說明吸附過程由化學(xué)吸附所控制，Qe?MIP和Qe?NIP分別為6.667 mg/g 和0.233 mg/g。2.3.2 靜態(tài)吸附 圖4（b）表示的是SMIPs/NIPs 靜態(tài)吸附曲線。隨著吳茱萸內(nèi)酯溶液濃度的增加，SMIPs 吸附量快速上升，并在400 μg/ml 濃度時達到飽和吸附。飽和時SMIPs的吸附量為27.72 mg/g，吸附 量 是NIPs 的3.4 倍。Langmuir 和Freundlich 方 程用于描述本文靜態(tài)吸附實驗，方程如下所示[29]:

表1 一級和二級動力學(xué)模型擬合參數(shù)Table 1 Relevant parameters of pseudo-first-order and pseudo-second-order model

式 中，KL代 表Langmuir 常 數(shù)；KF和n 表 示Freundlich 常數(shù)；Qm和Qe分別代表最大吸附量和在Ce濃度時的平衡吸附量；Ce表示吳茱萸內(nèi)酯的濃度。兩種模型相關(guān)參數(shù)計算如表2 所示，Langmuir 模型（R2=0.958）比Freundlich模型（R2=0.919）更符合實驗數(shù)據(jù)。一般地，Langmuir 模型被認為是單層吸附理論，而Freundlich 模型則被認為是單層吸附和多層吸附相結(jié)合。根據(jù)Langmuir 模型相關(guān)參數(shù)所得，理論上SMIPs 和NIPs 的最大吸附量為29.412 mg/g 和

12.345 mg/g。

表2 Langmuir和Freundlich 方程擬合參數(shù)Table 2 Relevant parameters of Langmuir and Freundlich equation

2.4 選擇性實驗

諾米林和黃柏酮結(jié)構(gòu)與吳茱萸內(nèi)酯類似，被選為競爭性干擾物質(zhì)。選擇性實驗結(jié)果如圖4（c）所示，SMIPs 對吳茱萸內(nèi)酯的吸附量為20.88 mg/g，而對諾米林和黃柏酮的吸附量僅1.87 mg/g 和4.31 mg/g。SMIPs 對吳茱萸內(nèi)酯的吸附量分別是諾米林和黃柏酮的11.16倍和4.84倍，這表明SMIPs材料內(nèi)部存在吳茱萸內(nèi)酯模板分子印跡空穴。為了更好地說明SMIPs 的特異性，印跡因子（α）和選擇性因子（β）用于評價SMIPs的選擇性和專一性。α 和β的計算公式如下：

式中，QMIP和QNIP分別表示SMIPs 和NIPs 的吸附能力;αtem和αana分別表示模板分子和類似物的印跡因子。吳茱萸內(nèi)酯、諾米林和黃柏酮的印跡因子分別是4.33、1.57 和2.37。吳茱萸內(nèi)酯相對于諾米林和黃柏酮的選擇性因子是2.75和1.83。上述結(jié)果表明SMIPs對吳茱萸內(nèi)酯有更好的選擇性。

2.5 SMIPs的應(yīng)用

檸檬汁脫苦前后的色譜圖如圖5所示。在加入SMIPs 前，檸檬汁色譜圖中有吳茱萸內(nèi)酯的峰，加入SMIPs 進行脫苦處理后，可明顯看出吳茱萸內(nèi)酯的峰消失了。而洗脫液色譜圖中出現(xiàn)吳茱萸內(nèi)酯的峰，這說明檸檬汁中的吳茱萸內(nèi)酯已經(jīng)被吸附到了SMIPs 上。此外，其他柑橘屬果汁，如橘汁、柚子汁等也含有大量的吳茱萸內(nèi)酯，推測SMIPs 能夠應(yīng)用于柑橘類果汁的脫苦處理中。簡言之，SMIPs 可作為一種優(yōu)良的吸附劑，用于柑橘類果汁的脫苦處理。

圖5 表面分子印跡材料對檸檬汁的脫苦過程的液相色譜圖Fig.5 Liquid chromatogram of demitoring process of lemon juice by surface molecularly imprinted materials

3 結(jié) 論

本研究以SMIPs為吸附劑從檸檬汁中去除吳茱萸內(nèi)酯，從而達到對檸檬汁的脫苦效果，TEM 和FT?IR 均可表明分子印跡聚合物的合成。此外，由于SiO2顆粒具有化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性，且SMIPs具有核殼?結(jié)構(gòu)，吸附動力學(xué)快，結(jié)合力強，基于二氧化硅顆粒的SMIPs可以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中果汁的脫苦過程。不同于傳統(tǒng)的脫苦方法，該方法操作簡單、省時、脫苦效率高，1 h 內(nèi)即可達到飽和吸附，且吸附量可達27.72 mg/g。在果汁中加入SMIPs后，檸檬汁中的吳茱萸內(nèi)酯幾乎全部被提取出來。本研究為工業(yè)生產(chǎn)中果汁的脫苦提供了一個方向。