徐彥芹，楊錫智，羅若詩，黃玉紅，霍鋒，王丹

（1 重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化工過程強(qiáng)化與反應(yīng)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，重慶400044；2中國科學(xué)院過程工程研究所，北京100190）

引 言

合成生物學(xué)（syntheticbiology）是一門顛覆性的新興交叉學(xué)科，使人類能夠?qū)崿F(xiàn)像組裝機(jī)器一樣組配生物，是生命科學(xué)領(lǐng)域的一次偉大革命。合成生物學(xué)是在現(xiàn)代生物學(xué)和系統(tǒng)科學(xué)基礎(chǔ)上，融入工程學(xué)思想，將分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)、工程技術(shù)和信息技術(shù)等綜合應(yīng)用的多學(xué)科交叉領(lǐng)域。它通過設(shè)計(jì)、構(gòu)建、調(diào)試、優(yōu)化的工程學(xué)循環(huán)思想，改造或創(chuàng)造出新的生物合成途徑。合成生物學(xué)已經(jīng)應(yīng)用于生物能源[1?5]、環(huán)境保護(hù)[6?12]、生物醫(yī)藥[13]、食品科學(xué)[14?20]和大宗化學(xué)品制造[21?28]等領(lǐng)域。目前，合成生物學(xué)已經(jīng)成為全球各國政府和生物科技公司重點(diǎn)關(guān)注、投入研發(fā)的熱點(diǎn)之一。塑料制品與人們生產(chǎn)、生活息息相關(guān)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療制品、食品包裝、汽車和通訊等行業(yè)。而在航空、航天、通訊工程和軍事領(lǐng)域，工程塑料作為金屬的替代品，可廣泛地作為工程結(jié)構(gòu)材料使用，在苛刻的化學(xué)、物理環(huán)境中展現(xiàn)出優(yōu)良的綜合性能?，F(xiàn)在使用的塑料制品大部分是由石油化工生產(chǎn)的石油基塑料，隨著石油資源逐步匱乏和突出的環(huán)保問題，以可再生的天然生物質(zhì)資源為原料，通過合成生物學(xué)構(gòu)建工程細(xì)菌或工程細(xì)胞來生產(chǎn)生物基塑料（表1），具有愈加廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景[39?42]。

1 合成生物學(xué)的發(fā)展現(xiàn)狀

1.1 合成生物學(xué)概念的提出

1910 年，合成生物學(xué)概念由法國科學(xué)家Stéphane Leduc 提出，并且預(yù)見了生命科學(xué)由描述、分析到合成的發(fā)展方向；1965 年，國際上首次人工合成具有生理活性的蛋白質(zhì)牛胰島素由我國科學(xué)家完成，是生命科學(xué)的里程碑事件；1974 年，波蘭科學(xué)家Waclaw Szybalski 提出將“應(yīng)用”注入合成生物學(xué)概念中；1980年，Hobom B提出合成生物學(xué)表述為基因重組技術(shù)；2003 年，國際上定義合成生物學(xué)為基于系統(tǒng)生物學(xué)的遺傳工程和工程方法的人工生物系統(tǒng)研究。

合成生物學(xué)與集成型建筑工程類似，采用工程化設(shè)計(jì)理念，工程學(xué)模塊化思想、系統(tǒng)設(shè)計(jì)理論，通過自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化的過程，改造或重建天然的生物體系，最終構(gòu)建出具有特定功能的可控生命體系[43?45]。21 世紀(jì)初，合成生物學(xué)突破了數(shù)年的自然進(jìn)化限制，開啟了從深入認(rèn)識(shí)和探索生命到設(shè)計(jì)和創(chuàng)造生命的新篇章，實(shí)現(xiàn)了所需品的可控定量表達(dá)與生產(chǎn)。因此，當(dāng)人類面臨能源、資源和環(huán)境等重大問題時(shí)，合成生物學(xué)可以為其提供新的解決途徑，目前合成生物學(xué)已經(jīng)在人類生產(chǎn)生活中實(shí)現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用（圖1）[46?47]。

1.2 合成生物學(xué)的重要技術(shù)

1.2.1 生物傳感器 合成生物學(xué)的發(fā)展讓人們?cè)诩?xì)胞天然傳感的基礎(chǔ)上可以進(jìn)行構(gòu)建、加工生物傳感器，用來感應(yīng)細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)靶向代謝產(chǎn)物的變化，實(shí)現(xiàn)特定信號(hào)的感應(yīng)和輸出。而人工構(gòu)建的生物傳感器又反過來作為一種常規(guī)化的技術(shù)，指導(dǎo)人們進(jìn)行代謝途徑的構(gòu)建、產(chǎn)物產(chǎn)量提高及工程酶的篩選。生物傳感器主要由生物識(shí)別元件和信號(hào)輸出元件組成。生物識(shí)別元件包括核糖開關(guān)、轉(zhuǎn)錄因子、核糖體干擾肽和壓力響應(yīng)啟動(dòng)子等。信號(hào)輸出元件感受到識(shí)別元件內(nèi)部的信號(hào)變化，以熒光信號(hào)或者代謝通路的開閉等不同的形式輸出[48]。生物傳感器在合成生物學(xué)中的應(yīng)用：例如高通量篩選高產(chǎn)量目標(biāo)產(chǎn)物的菌株，動(dòng)態(tài)調(diào)控代謝物在細(xì)胞內(nèi)的水平等。Binder 等[49]成功設(shè)計(jì)和開發(fā)出用于細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)堿性氨基酸、L?絲氨酸和O?乙酰絲氨酸的傳感器。首先，設(shè)計(jì)出合適的代謝物傳感器，在攜帶傳感器的細(xì)胞基因組中產(chǎn)生遺傳多樣性，通過FACS篩選突變文庫和選擇單個(gè)產(chǎn)生細(xì)胞，驗(yàn)證和鑒定突變體。通過從隨機(jī)誘變野生型（WT）細(xì)胞庫中分離獲得產(chǎn)生L?賴氨酸的細(xì)菌，對(duì)目標(biāo)細(xì)菌測(cè)序鑒定，證實(shí)了該方法的可行性。

表1 工程細(xì)菌或工程細(xì)胞生產(chǎn)生物基塑料應(yīng)用實(shí)例Table 1 Examples of applications of engineered bacteria or engineered cells to produce bio-based plastics

圖1 合成生物學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域Fig.1 Applied fields of synthetic biology

1.2.2 基因編輯技術(shù) 基因編輯技術(shù)最早是在同源序列間引入外源基因，實(shí)現(xiàn)基因編輯的同源重組技術(shù)（HR）。而后出現(xiàn)了人工核酸酶的基因編輯技術(shù)，主要有ZFN、TALEN、CRISPR/cas9 和單堿基編輯技術(shù)[50]。CRISPR/cas9 是適用性較強(qiáng)和打靶效率高的基因編輯技術(shù)，生物體基因組特定位點(diǎn)被精確地修飾，通過敲除、敲入和替換基因片段，生物體的特性或性狀被改變，此方法能夠?qū)崿F(xiàn)高通量基因編輯，且設(shè)計(jì)簡便、效率高、成本低，但也會(huì)出現(xiàn)脫靶問題。CRISPR/cas9 系統(tǒng)由內(nèi)切酶cas92 和gRNA 兩部分組成。工作原理為設(shè)計(jì)出預(yù)定目標(biāo)序列的gRNA，利用3'端序列與cas9結(jié)合以及5'端序列與靶基因互補(bǔ)配對(duì)，定位PAM 前3～5 個(gè)堿基的距離對(duì)其中任一序列進(jìn)行插入、敲除及突變等修飾（圖2）[51?52]，而 gRNA 可 以 通 過 在 線 網(wǎng) 站（OptimizedCRISPRDe?sign.com等）設(shè)計(jì)。

圖2 CRISPR/cas9 基因編輯技術(shù)Fig.2 CRISPR/cas9 gene editing technology

1.2.3 基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)也是合成生物學(xué)的重要技術(shù)，未知序列的核酸序列與已知序列的核酸探針雜交檢測(cè)，在固相支持物上原位合成（in situ synthesis）寡核苷酸或者直接將大量預(yù)先制備的DNA 探針以顯微打印的方式有序地固化在支持物表面構(gòu)成二維陣列，再將待測(cè)的標(biāo)記樣品基因按照堿基對(duì)配對(duì)原理進(jìn)行雜交，從而檢測(cè)待定基因。Ren等[53]研究了基因芯片對(duì)釀酒酵母中DNA 結(jié)合蛋白的功能和基因組的結(jié)合區(qū)域，通過釀酒酵母全部基因組信息的基因芯片技術(shù)，并結(jié)合經(jīng)過修正的染色質(zhì)免疫沉析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明此技術(shù)能夠有效發(fā)現(xiàn)釀酒酵母細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活子直接控制的基因。Zimmer 等[54]利用基因芯片技術(shù)比較了超水平表達(dá)的Ntrc 激活的突變菌株和野生型菌株的RNA水平，發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌中存在調(diào)節(jié)子Ntrc，大腸桿菌基因組中約有2%的基因表達(dá)被調(diào)節(jié)子Ntrc 控制?；蛐酒夹g(shù)具有高集成、高通量、自動(dòng)化和多樣化等優(yōu)點(diǎn)。雖然在技術(shù)與設(shè)備方面還存在一些不足，但是基因芯片技術(shù)已經(jīng)展現(xiàn)出較大價(jià)格下降空間，在合成生物學(xué)領(lǐng)域代謝途徑構(gòu)建中基因表達(dá)分析、DNA 測(cè)序和發(fā)現(xiàn)新基因等方面具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。

此外，在工程酶構(gòu)建、基因組信息分析、基因表達(dá)量調(diào)控等方面，合成生物學(xué)也發(fā)展了許多新技術(shù)，并且與目前的人工智能和機(jī)器學(xué)習(xí)等新技術(shù)相結(jié)合，促進(jìn)了可控生物體系構(gòu)建過程的自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化。

2 生物基塑料

塑料根據(jù)原料來源不同分為石油基塑料和生物基塑料。石油基塑料來源于不可再生的石油資源，生物基塑料原料為天然可再生生物資源。而隨著世界各國對(duì)石油資源的爭奪和日益顯著的環(huán)境問題，生物基塑料相比石油基塑料，具有原料種類豐富、可再生和生產(chǎn)過程環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。生物基塑料不等同于生物降解塑料，兩者本質(zhì)上是不同的，目前生物基塑料大部分是可降解塑料，有些生物基塑料是不可降解的。生物基塑料占據(jù)原料優(yōu)勢(shì)，采用合成生物學(xué)先進(jìn)技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)優(yōu)化合成過程，提高合成效率，得到精確化、多功能化及可控的合成途徑。因此，生物基塑料在推行低碳經(jīng)濟(jì)的當(dāng)今世界具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

2.1 市場(chǎng)發(fā)展?fàn)顩r

2017 年，歐洲生物塑料協(xié)會(huì)報(bào)告了生物基塑料行業(yè)市場(chǎng)（圖3）及預(yù)測(cè)。根據(jù)歐洲生物塑料行業(yè)協(xié)會(huì)分析報(bào)告[55]，2016 年全球塑料年產(chǎn)量約4 億噸，其中生物基塑料占當(dāng)年塑料年產(chǎn)量的1%，預(yù)測(cè)2016年至2021 年，全球生物基塑料將從416 萬噸增長至610 萬噸[56]。目前，隨著人們生活水平的提高，環(huán)保意識(shí)的增加，國家管理部門的政策性傾向，合成生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，市場(chǎng)需求量將會(huì)大幅增長，將會(huì)涌現(xiàn)出更多種類豐富、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物聚合物。就我國生物基塑料應(yīng)用市場(chǎng)與國外相比，歐洲市場(chǎng)增幅突顯，國內(nèi)市場(chǎng)目前尚方興未艾。

圖3 2017年生物基塑料的應(yīng)用市場(chǎng)分布Fig.3 Application market distribution of bio?based plastics in 2017

2.2 新型材料的發(fā)展

目前市場(chǎng)上生物基塑料商業(yè)化種類較多，占據(jù)較多的生物基塑料為可生物降解的PHA（聚羥基鏈烷酸酯）和PLA（聚乳酸）兩種創(chuàng)新型生物聚合物，也是生物基塑料制品增長的主要產(chǎn)品。PHA 作為聚合物家族的重要組成，技術(shù)較為成熟，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。PLA 被稱為工業(yè)萬能材料，可以替代PS（聚苯乙烯）、PP（聚丙烯）和ABS（丙烯腈丁二烯苯乙烯）等傳統(tǒng)材料。新型的生物質(zhì)材料PHA 和PLA 與傳統(tǒng)石油基塑料結(jié)構(gòu)完全相同，除生產(chǎn)原料外，生產(chǎn)設(shè)備的初始至終端均完全相同。此外，當(dāng)前國內(nèi)外市場(chǎng)上，技術(shù)成熟的生物基單體主要有丁二酸、丁二醇、乳酸和丙二醇等。為更好地推動(dòng)生物基塑料的發(fā)展，歐洲一些國家和組織通過立法推動(dòng)生物基塑料的應(yīng)用和市場(chǎng)發(fā)展。法國于2017年1月1日?qǐng)?zhí)行超市果蔬包裝袋和商業(yè)郵件塑料包裝制品必須為生物基材料，可降解袋和堆肥袋制品中生物基碳含量由2017年30%增長到2020年60%[56]。因此，塑料制品的市場(chǎng)發(fā)展方向?qū)⒂墒突芰现饾u轉(zhuǎn)向生物基塑料。

3 合成生物學(xué)在生物基塑料中的應(yīng)用

在過去的數(shù)百年里，合成有機(jī)化學(xué)主導(dǎo)著化學(xué)品的生產(chǎn)，合成的塑料制品為人類的生活帶來了極大的便利。合成有機(jī)化學(xué)消耗的是愈發(fā)匱乏的石油資源，且生產(chǎn)過程造成環(huán)境污染。世界各國因石油資源的爭奪戰(zhàn)爭不斷，石油基塑料的價(jià)格不斷上漲，企業(yè)的利潤明顯降低。生物基塑料采用取之不竭的綠色再生生物質(zhì)資源（如玉米、甘蔗、秸稈和木屑等）合成，避免了化石資源的依賴。隨著合成生物學(xué)的迅猛發(fā)展，采用微生物發(fā)酵制備生物基塑料得到各國政府、科研機(jī)構(gòu)及產(chǎn)業(yè)界的極大重視。合成生物學(xué)已經(jīng)發(fā)展成為制備生物基塑料的重要手段[57?59]，此應(yīng)用為人類工業(yè)制品的發(fā)展提供了新的方向，解除了對(duì)石油資源的依賴，解決了廢棄生物質(zhì)處理問題，緩解了日益嚴(yán)峻的環(huán)境問題，該方向也成為了當(dāng)前環(huán)境、材料領(lǐng)域?qū)W術(shù)研究的重點(diǎn)熱點(diǎn)之一。本文將綜述合成生物學(xué)在聚羥基烷酸酯（PHA）、尼龍家族工程塑料、聚乳酸（PLA）和聚丁二酸丁二醇酯（PBS）幾種典型生物基塑料的應(yīng)用。

3.1 聚羥基烷酸酯（PHA）

PHA 是一種結(jié)構(gòu)多樣化、生物可降解的高分子聚合物，具有光學(xué)活性、生物相容性、生物降解性、熱塑加工性和氣體相隔性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于塑料制品、人造醫(yī)用支架材料、藥物載體和電學(xué)材料等。PHA 材料單體為手性R 型的羥基脂肪酸，單體有多種側(cè)鏈，單體鏈長多數(shù)為3 ～14 個(gè)碳原子。單體的組合方式、聚合反應(yīng)方式和分子量等不同，使PHA 具有多樣性，常見的PHA 單體為3?羥基脂肪酸。PHA 材料的多種單體結(jié)構(gòu)采用合成生物學(xué)技術(shù)被成功設(shè)計(jì)和多種微生物合成，通過代謝途徑從頭構(gòu)建和改造工程菌，可以拓展PHA 的合成種類，當(dāng)前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了PHA的可控合成和可設(shè)計(jì)性。

2010 年，聚羥基脂肪酸酯（PHA）合成技術(shù)被達(dá)沃斯世界經(jīng)濟(jì)論壇評(píng)為全球最具創(chuàng)新力技術(shù)。PHA在我國的研究已有20多年歷史，清華大學(xué)陳國強(qiáng)課題組是我國PHA 的領(lǐng)先研究團(tuán)隊(duì)，依托此團(tuán)隊(duì)完成了5 t PHA的中試。Chen等[60]以葡萄糖為碳源，通過多種途徑合成多種PHA，并對(duì)鹽單胞菌（Halomonas）進(jìn)行改造，實(shí)現(xiàn)了PHA 的無滅菌開放連續(xù)發(fā)酵低成本合成，推動(dòng)PHA 的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。此外，兩種新的大片段基因組DNA 克隆技術(shù)被該團(tuán)隊(duì)開發(fā)。第一種是基于體外單鏈互補(bǔ)突出末端退火黏連的大片段基因簇調(diào)取方法（single?stranded overlapping annealing, SSOA）[61]，此技術(shù)應(yīng)用于克隆大腸桿菌基因組中的任意片段，效率都較高，克隆低于30 kb 的基因組片段，陽性率可達(dá)80%。第二種是體內(nèi)同源重組的大片段DNA 克隆技術(shù)，可以免除依賴抗性基因，此方法已經(jīng)應(yīng)用于PHA 材料聚β?羥基丁酸酯（PHB）的生產(chǎn)中[62]。具體過程為通過大腸桿菌過表達(dá)乙酰輔酶A 和（或）氫酶?3 基因簇，在厭氧情況下，產(chǎn)氫與PHB 的合成相偶聯(lián)，無論是否添加碳源乙酸，均能增加H2和PHB 的產(chǎn)量，H2含 量 提 高10 倍 以 上，PHB 產(chǎn) 量 提 高9 倍；PHB 產(chǎn)量由0.55 mg PHB/g 葡萄糖提高到5.34 mg PHB/g 葡萄糖。

目前，大部分常見的PHA 材料均可以葡萄糖為唯一碳源，運(yùn)用合成生物學(xué)和代謝工程技術(shù)合成。具體過程為通過調(diào)控基因的表達(dá)量和細(xì)胞的代謝網(wǎng)格優(yōu)化途徑，即通過調(diào)節(jié)核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS 翻譯強(qiáng)度或基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度達(dá)到PHA 代謝流的控制，進(jìn)一步提高PHA 的產(chǎn)量。Poblete?Castro 等[63]通過敲除葡萄糖脫氫酶基因gcd，獲得惡臭假單胞菌重組菌株，PHA 的合成能力比野生型惡臭假單胞菌提高了100%。CRISPR 及其衍生技術(shù)CRISPRi 能夠通過基因敲除、替換等抑制目標(biāo)基因的表達(dá)量達(dá)到調(diào)控代謝途徑的目的。Lv等[64]采用CRISPRi技術(shù)抑制琥珀酸半醛脫氫酶sad 基因，獲得不同抑制效果的大腸桿菌重組菌株，以葡萄糖為碳源，有效控制了合成4HB 的代謝流，合成了不同4HB 含量（4HB 的摩爾分?jǐn)?shù)1% ～9%）的P3HB4HB。進(jìn)一步抑制琥珀酸脫氫酶基因（sucC、sucD、sdhA 和sdhB）和琥珀酰輔酶A合成酶基因，P3HB4HB中4HB的含量調(diào)控范圍擴(kuò)大為1.4%～18.4%。

另一種常見的PHA 材料為3?羥基丁酸與3?羥基戊酸共聚酯[P(3HB?co?3HV)]，簡稱PHBV，具有高阻隔性、完全的生物相容性、耐沖擊能力強(qiáng)、較好的彈性和韌性等優(yōu)點(diǎn)。由于PHBV 的合成前體是丙酰輔酶A，因此，更多的研究目標(biāo)集中在丙酰輔酶A。如Yang 等[65]以葡萄糖為碳源，在大腸桿菌中成功構(gòu)建了兩條丙酰輔酶A 的代謝途徑來合成PHBV。

3.2 尼龍家族工程塑料

尼龍即聚酰胺，簡稱PA。常見的石油基尼龍種類為尼龍6 和尼龍66。生物基尼龍采用生物法制取，種類有尼龍66、尼龍46、尼龍6、尼龍5、尼龍56、尼龍11、尼龍1010、尼龍610和尼龍612等。生物基尼龍制備方法有生物發(fā)酵法和植物油裂解法。目前大多數(shù)企業(yè)選用植物汕裂解法作為生物基尼龍的主要生產(chǎn)路線。但是隨著合成生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，采用生物發(fā)酵法可大大降低尼龍單體的生產(chǎn)成本，具有較大的工業(yè)應(yīng)用潛力和發(fā)展空間。接下來介紹幾種合成生物學(xué)在尼龍家族工程塑料中的應(yīng)用實(shí)例。

3.2.1 尼龍66 和尼龍46 尼龍66（PA66），學(xué)名聚己二酰己二胺，簡稱聚酰胺66，是一種重要的熱塑性樹脂，具有機(jī)械強(qiáng)度大、硬度高，剛性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，作為一種新型工程塑料，廣泛應(yīng)用于機(jī)械設(shè)備、合成纖維、汽車配件和精密儀器等領(lǐng)域。工業(yè)上尼龍66的合成方法為己二酸和己二胺制成尼龍?66鹽后縮聚而得。尼龍46（PA46），學(xué)名聚己二酰丁二胺，簡稱聚酰胺46，與工程塑料與耐熱塑料相比，具有使用期長、耐疲勞性佳、耐摩擦和耐磨耗性均較好等優(yōu)點(diǎn)，適用于電子電器材料。己二酸是生產(chǎn)尼龍66和尼龍46的重要原料，是一種具有重要商業(yè)用途的脂肪族直鏈二羧酸。

己二酸不存在天然合成途徑，但可以通過工程酵母菌株產(chǎn)生的α 或ω 型氧化的長鏈正烷烴或脂肪酸等合成[66?68]。文獻(xiàn)報(bào)道熱帶念珠菌通過ω 型氧化途徑生產(chǎn)6?羥基己酸（6?hydroxycaproicacid）[69]，此反應(yīng)由NADPH 細(xì)胞色素P450 還原酶（CYP）和NADPH 細(xì)胞色素P450 還原酶(CRP)組成的細(xì)胞色素P450 羥化酶復(fù)合物引起，通過脂肪醇脫氫酶（ADH）或脂肪醇氧化酶（FAO）將6?羥基己酸轉(zhuǎn)化為6?氧代己酸（6?oxohexanoicacid），6?氧代己酸經(jīng)脂肪醇脫氫酶（AldDH）轉(zhuǎn)化為己二酸。Picataggio等[70]過表達(dá)熱帶念珠菌HexS、CPR、CYP450、ADH、FAO和AldDH基因，并對(duì)其他基因進(jìn)行了修飾，使更多的碳流被導(dǎo)入到構(gòu)建的己二酸代謝途徑中。經(jīng)過6 d 的培養(yǎng)，C. tropicalsAA580 以椰子油為原料可產(chǎn)生4 g/L 以上的己二酸。Picataggio 等[71]進(jìn)一步發(fā)展了發(fā)酵技術(shù)，己二酸的濃度在120 h 內(nèi)能夠提高到50 g/L以上，也是文獻(xiàn)報(bào)道的最高滴度。

己二酸也可由粘糠酸經(jīng)過化學(xué)催化加氫制得。Lin 等[72]以鄰氨基苯甲酸為前體，加入兩個(gè)外源酶，最后成功制得粘糠酸和兒茶酚；然后以分支酸經(jīng)異分支酸合成酶（ICS）和異分支酸丙酮酸裂解酶（IPL）催化合成水楊酸，水楊酸單加氧酶（SMO）和兒茶酚雙加氧酶（CDO）催化也可以生成粘糠酸。經(jīng)過條件優(yōu)化，粘糠酸產(chǎn)量能夠達(dá)到1.5 g/L，開辟了由粘康酸制備己二酸的新途徑。

尼龍66 的另一單體己二胺的生物合成未見文獻(xiàn)報(bào)道。

3.2.2 尼龍6 尼龍6，學(xué)名6?氨基己酸（6?aminocaproicacid，6ACA），是一種重要的工程塑料，廣泛應(yīng)用于機(jī)械、化工、儀表、汽車、醫(yī)療設(shè)備及針織品等領(lǐng)域。6ACA 也是一種重要的非蛋白質(zhì)直鏈氨基酸，也是臨床常用的止血藥，能抑制纖維蛋白的溶解而止血[73]。

6ACA 可作為己內(nèi)酰胺的前體，己內(nèi)酰胺單體聚合可合成出尼龍6。生物方法合成6ACA 的文獻(xiàn)報(bào)道較少，且均采用微生物體內(nèi)代謝途徑構(gòu)建法，前體來自于TCA循環(huán)。Turk等[74]構(gòu)建了兩條代謝途徑生產(chǎn)6ACA，一條代謝途徑為過表達(dá)3?oxoadipyl?CoAthiolase， 3?hydroxyadipyl?CoAdehydrogenase，enoyl?CoAhydratase，hexenoyl?CoA?reductase，kdcA和vfl 基因，由乙酰CoA 和丁二酰CoA 縮合經(jīng)己二酰CoA 制備6ACA，另一條途徑為過表達(dá)nifV，aksD，aksE，aksF，kdcA 和vfl 基因，由TCA 循環(huán)的中間產(chǎn)物α?酮戊二酸（AKG）經(jīng)碳鏈延伸得到酮庚二酸，最后經(jīng)脫羧和轉(zhuǎn)氨作用，得到6ACA，其濃度為160 mg/L。Chae 等[75]通過nifV，aksF，aksD，aksE，vfl 和kdcA 共表達(dá)，獲得6ACA 作為生產(chǎn)己內(nèi)酰胺的中間產(chǎn)物。Zhou 等[76]在pMB1 質(zhì)粒上構(gòu)建了兩個(gè)基于PT7 啟動(dòng)子的操縱子，表達(dá)nifV，aksF，aksD 和aksE，在pBBR1質(zhì)粒上構(gòu)建了基于PT7 啟動(dòng)子的操縱子，實(shí)現(xiàn)vfl 和kdcA共表達(dá)，6ACA的最終產(chǎn)量為48 mg/L。

近期，本課題組構(gòu)建了多酶分子機(jī)器RaiP+LeuABCD+KivD+PadA，見圖4。以大宗化學(xué)品賴氨酸為原料，通過賴氨酸脫氨基產(chǎn)物2?酮酸和乙酰輔酶A 聚合引發(fā)鏈延伸循環(huán)，實(shí)現(xiàn)了+1C 獲得產(chǎn)物6ACA[36]。但此循環(huán)反應(yīng)體系中，碳鏈不斷增長，實(shí)際產(chǎn)物中既出現(xiàn)了+2C 反應(yīng)產(chǎn)物7AHA，同時(shí)仍有大量未能成功+1C 的副產(chǎn)物5AVA 生成。最終產(chǎn)物為5AVA 99.2 mg/L，6ACA 47.0 mg/L，7AHA 4.78 mg/L，即總的非天然直鏈氨基酸（NNSCAAs）的產(chǎn)量為140.98 mg/L。下一步擬通過定向進(jìn)化和溶劑強(qiáng)化等技術(shù)，進(jìn)一步提高6ACA 的合成效率，并解析碳鏈延伸循環(huán)圈的作用機(jī)制。

3.2.3 尼龍5和尼龍56 尼龍5和尼龍56是兩種重要的新型工程塑料。 5?氨基戊酸（5?aminovalericacid，5AVA）是尼龍5 和尼龍56 的前體，也是合成5?羥基戊二酸、戊二酸和1,5?戊二醇的C5平臺(tái)化合物?；瘜W(xué)法和生物法合成均可合成5AVA，化學(xué)法合成過程復(fù)雜，產(chǎn)率較低，且造成環(huán)境污染。5AVA 的天然合成途徑存在于惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）中，5AVA 的人工合成途徑也已經(jīng)成功被構(gòu)建。Park 等[77]通過重組大腸桿菌WL3110 表達(dá)假單胞菌putidadavAB（基因編碼delta?aminovaleramidase） 和 賴 氨 酸 2?monooxygenase，成功制備出5?氨基戊酸鹽(5AVA)和戊二酸。Ma 等[78]設(shè)計(jì)了L?賴氨酸轉(zhuǎn)化為5AVA 的生物途徑，重組大腸桿菌過表達(dá)信號(hào)肽PelB 和DAP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CadB，可生產(chǎn)221 g/L 5AVA，5AVA 產(chǎn)量提高了12%。

圖4 產(chǎn)6ACA的回歸循環(huán)多酶分子機(jī)器[36]Fig.4 Regression cycle multienzyme molecular machine of 6ACA[36]

本課題組通過RaiP 的過表達(dá)，構(gòu)建了生產(chǎn)5AVA 異源途徑系統(tǒng)[79]，見圖5。首先，構(gòu)建了質(zhì)粒pCJ01，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE），獲得了在T7啟動(dòng)子作用下RaiP 過表達(dá)的工程菌株CJ01。賴氨酸在大腸桿菌中被賴氨酸脫羧酶CadA 天然降解為戊二胺。為了減少底物的降解和提高底物的利用率，將CadA進(jìn)行敲除，獲得了敲除CadA減少賴氨酸消耗的工程菌株ML03。L?賴氨酸可以被RaiP 氧化脫氨，得到2?酮?6?氨基己酸，隨后在氧化劑H2O2的作用下相繼脫羧和氧化為5AVA。菌株CJ00、CJ01和CJ02 在添加L?賴氨酸后產(chǎn)生了5?氨基戊酸。再利用4% 乙醇和10 mmol/L H2O2處理全細(xì)胞生物催化劑CJ02RaiP，催化L?賴氨酸HCl 反應(yīng)48 h 后，5?氨基戊酸的產(chǎn)量達(dá)到了50.62 g/L。

圖5 利用L?賴氨酸在微生物中合成5?氨基戊酸的各種途徑[79]Fig.5 Various routes of 5AVA biosynthesis from L?lysine in microorganisms[79]

3.3 聚乳酸（PLA）

聚乳酸（PLA）是一種新型的生物基材料，具有良好的生物降解性、生物相容性、熱穩(wěn)定性、抗溶劑性和易加工性等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于服裝制造、建筑和醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域，是合成生物學(xué)在材料領(lǐng)域的最早應(yīng)用之一。

PLA 的合成單體是乳酸（2?羥基丙酸），是一種具有較大市場(chǎng)空間和發(fā)展?jié)摿Φ幕ぴ希哂泻芨叩纳虡I(yè)價(jià)值。PLA 在發(fā)酵工業(yè)中用于控制pH，在食品行業(yè)中充當(dāng)調(diào)味劑。時(shí)夢(mèng)詢[37]采用原始菌株大腸桿菌BL21(DE3)，運(yùn)用染色體重組技術(shù)，構(gòu)建敲除乙酸激酶基因ackA 的自殺質(zhì)粒pRE112（圖6），抑制了葡萄糖到乙酸的代謝流，并且過表達(dá)乳酸脫氫酶基因LDH，增強(qiáng)了葡萄糖到乳酸的代謝流，高產(chǎn)乳酸菌E.coli BL21(DE3)△ackA/LDH?pTrcHis2B 被成功構(gòu)建，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為構(gòu)建的工程菌生產(chǎn)乳酸產(chǎn)量比野生菌高48.20%。Grabar 等[80]同時(shí)將pflB、富馬酸還原酶基因（frd）、adhE 和ackA 基因刪除，構(gòu)建的工程菌株在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵積累的D?乳酸（光學(xué)純度95%)達(dá)110 g/L，將甲基丙酮醛合成酶基因（mgsA）進(jìn)一步刪除，乳酸產(chǎn)量能夠增加到118 g/L，且達(dá)到99.9%的光學(xué)純度。周麗[81]通過單基因刪除和多基因組合刪除手段研究乳酸在大腸桿菌的代謝，為減少產(chǎn)物中的副產(chǎn)物，采用選擇性地組合方式刪除了野生型大腸桿菌中的8 個(gè)基因：ackA、pta、磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因（pps）、pflB、FAD依賴型D?乳酸脫氫酶基因（dld）、丙酮酸氧化酶基因（poxb）、adhE 和富馬酸還原酶基因（frdA），有效控制了多種副產(chǎn)物的含量，使產(chǎn)物D?乳酸產(chǎn)量達(dá)到125 g/L，光學(xué)純度大于99.9%。

3.4 聚丁二酸丁二醇酯（PBS）

聚丁二酸丁二醇酯（PBS）是一種典型的可完全生物降解的聚合物材料，具有良好的生物相容性和生物可吸收性，易被自然界中多種微生物或動(dòng)植物體內(nèi)的酶分解，代謝終產(chǎn)物為CO2和H2O。

PBS是由丁二酸和丁二醇單體聚合得到。其中單體丁二酸又稱琥珀酸，是一種基礎(chǔ)平臺(tái)化合物，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前丁二酸的產(chǎn)量無法滿足PBS產(chǎn)業(yè)化需求，通過生物質(zhì)生產(chǎn)丁二酸，丁二酸轉(zhuǎn)化丁二醇，合成的環(huán)保廉價(jià)生物基PBS 具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。自然界中存在丁二酸的天然合成途徑，在厭氧條件下，野生型大腸桿菌混合酸發(fā)酵可合成少量丁二酸，將大腸桿菌基因工程改造后，可將有機(jī)酸產(chǎn)物的競爭途徑消除，丁二酸的合成代謝流增強(qiáng)，大大提高大腸桿菌合成丁二酸的能力。Vemuri 等[38]重組大腸桿菌（失活丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl 和乳酸脫氫酶基因ldh）篩選出葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因ptsG 產(chǎn)生自發(fā)突變菌株AFP111，甲酸和乳酸在該突變株中將不再合成，再將AFP111 菌株導(dǎo)入丙酮酸羧化酶基因pyc，丁二酸的代謝途徑增強(qiáng)，經(jīng)過好氧-厭氧二階段發(fā)酵培養(yǎng)，丁二酸產(chǎn)量高達(dá)99.2 g/L，生產(chǎn)速率達(dá)1.3 g/(L·h)。此外，分子改造或進(jìn)化代謝選育手段能夠恢復(fù)或增強(qiáng)大腸桿菌菌株在厭氧條件下對(duì)五碳糖的利用能力[82?83]。

與國外相比，我國丁二酸發(fā)酵商業(yè)化還存在一定差距，但是中國科學(xué)院過程工程研究所、華東理工大學(xué)、南京工業(yè)大學(xué)和重慶大學(xué)等研究人員對(duì)丁二酸發(fā)酵研究已經(jīng)取得了豐碩的成果。

圖6 ackA基因敲除原理[37]Fig.6 Gene ackA knockout principle[37]

中國科學(xué)院過程工程研究所邢建民課題組[84]基于Red重組系統(tǒng)，采用“一步法”敲除了大腸桿菌菌株基因組上的染色體片段，將大腸桿菌菌株W3110的ldhA 和pflB 基因敲除，成功構(gòu)建出雙基因敲除菌株BS002[85?86]。根 據(jù)GenBank 公 布 的A.succinogenes 130ZPCK 序列，分別設(shè)計(jì)了引物pck?F 和pck?R，引物帶有BglII 和KpnI 酶切位點(diǎn)，通過PCR 擴(kuò)增獲得目的片段，進(jìn)行雙酶切處理PCK 基因片段和pTrcHisA 質(zhì)粒，連接后將表達(dá)質(zhì)粒pTrcHisA?130ZPCK 轉(zhuǎn)入BS002，成功構(gòu)建了重組菌株BS101。工程菌BS101發(fā)酵8.14 g/L葡萄糖可積累4.77 g/L丁二酸和2.65 g/L 丙酮酸，丁二酸產(chǎn)率達(dá)到0.90 mol/mol，比野生型大腸桿菌提高3 倍，此過程幾乎不產(chǎn)生甲酸、乙酸和乳酸。

華東理工大學(xué)吳輝課題組[87]采用醋酸鹽生產(chǎn)丁二酸。通過丁二酸脫氫酶（sdhABCD 編碼）的失活阻斷了TCA 循環(huán)，使葡萄糖在有氧條件下積累丁二酸。由于乙醛酸旁路成為丁二酸生物合成的主要途徑，其中aceBAK 操縱子的IcR 抑制子抑制乙醛酸旁路，IeR 的缺失促進(jìn)了葡萄糖產(chǎn)生丁二酸。因此，菌株MG02 在MG01 中敲除iclR。與MG01 相比，MG02 在72 h 內(nèi)多消耗了一點(diǎn)乙酸鹽（12.4 mmol/L），產(chǎn)生了更多的丁二酸鹽（2.81 mmol/L）。

本課題組[88]研究了厭氧誘導(dǎo)的PSnirB 啟動(dòng)子替代外源誘導(dǎo)劑，工程菌株生產(chǎn)丁二酸的情況。以葡萄糖、混合糖或者紅薯渣水解液為直接碳源，與IPTG 誘導(dǎo)的Trc 啟動(dòng)子調(diào)控下的工程菌SD133 和SD134 相比，在厭氧誘導(dǎo)的PSnirB 啟動(dòng)子調(diào)控下的工程菌HD133 和HD134 可以獲得更高濃度的丁二酸。以紅薯渣水解液為直接碳源搖瓶發(fā)酵48 h 后，工程菌HD133 和HD134 可分別產(chǎn)生16.73 g/L 和18.65 g/L 的丁二酸，與SD133 和SD134 合成的16.01 g/L 和17.18 g/L 丁二酸相比，產(chǎn)量分別提高了4.50%和8.56%，且無須添加昂貴的外源誘導(dǎo)劑IPTG。

4 展 望

隨著合成生物學(xué)相關(guān)技術(shù)迅速發(fā)展到日益成熟，合成生物學(xué)在生物基塑料領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣泛。生物基塑料原料豐富且可再生，過程綠色智能可控，條件轉(zhuǎn)換溫和，產(chǎn)品的種類也越來越豐富。合成生物學(xué)除了合成出可降解的生物基塑料PHA、尼龍家族、PLA等，也合成了一些非生物降解的生物基塑料PE、PET 和多元醇聚氨酯等。當(dāng)前生物基塑料的發(fā)展也面臨一些挑戰(zhàn)，原料多采用糧食作物，采用農(nóng)業(yè)廢棄物或者生活廢棄物等原料將是未來發(fā)展方向；生產(chǎn)成本還存在普遍偏高，且有些生物基塑料的綜合性能難以全面替代石油基塑料，有些需要進(jìn)一步改性才能滿足需求。因此，開發(fā)低成本、高性能生物基塑料將是生物基塑料未來發(fā)展的方向。生物基塑料價(jià)格控制可從多方面降低成本，如選擇價(jià)格低廉的糖類化合物或者廢棄物為底物；利用代謝工程對(duì)微生物改造，開發(fā)新的代謝途徑，通過從細(xì)胞的整體代謝網(wǎng)絡(luò)著手，調(diào)控和優(yōu)化代謝途徑，提高底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率；選用特殊底盤菌如嗜鹽菌等可抑制其他細(xì)菌的生長，可節(jié)省滅菌消耗的高溫高壓蒸汽的能量費(fèi)用和高溫高壓設(shè)備需求的成本，使發(fā)酵生產(chǎn)過程中的耗能降低?？傊锘芰系陌l(fā)展前景具有極大潛力和生機(jī)活力，市場(chǎng)潛力也是無可估量的。