陳加榮，沈洪園，李憑躍

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是膝關(guān)節(jié)內(nèi)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，對維持膝關(guān)節(jié)功能極為重要。ACL斷裂常導(dǎo)致嚴重膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，或繼發(fā)膝關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨及半月板損傷，其有效治療方法是進行ACL重建[1]。目前，同種異體骨-髕腱-骨（bone-patellar tendon-bone，BPTB）是重建ACL的常用肌腱移植物[2]，重建術(shù)后這些移植物將經(jīng)歷壞死、細胞長入和塑形的過程[3]。移植物再血管化直接影響細胞長入及塑形過程，最終影響移植物生物力學(xué)特性的恢復(fù)，是決定移植物成活質(zhì)量的關(guān)鍵因素[4]。

血管生成相關(guān)因子在血管化過程中發(fā)揮重要作用，其中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是已知活性最強、特異性最高的血管生成因子[5]，其他血管生成因子大都通過增強VEGF表達來發(fā)揮作用。但單純VEGF在體內(nèi)擴散快，易被蛋白酶分解而喪失生物學(xué)效應(yīng)。因此，尋找一種能夠保證VEGF緩慢釋放并發(fā)揮作用的無免疫原性載體系統(tǒng)，能更好地促進血管和細胞長入，提高移植物的成活質(zhì)量。

作為一種藥物緩釋劑，透明質(zhì)酸鈉（sodium hyaluronate，SH）可延緩藥物的釋放速度，對一些生物大分子藥物還可能具有生物黏附作用[6]。本研究探討VEGF復(fù)合SH對同種異體BPTB重建兔ACL術(shù)后再血管化的影響，為提高ACL重建術(shù)后移植物愈合質(zhì)量提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

重組人VEGF（PeproTech公司，美國）；小鼠抗人CD31單克隆抗體（Neomaker公司，美國）；SH（Sigma公司，美國）；FITC標記山羊抗鼠IgG（北京中杉金橋公司）；4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）穿細胞膜藍色熒光染料C1002（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；PBS液（Gibco公司，美國）；速眠新Ⅱ注射液（吉林圣達動物藥品有限公司）。Olympus BX51研究級正置顯微鏡（Olympus公司，美國）；Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)（Media Cybernetics Inc，美國）。

1.2 實驗動物

36只健康成熟新西蘭大白兔由南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物室提供（動物許可證號：SYXK 2019-0100），平均體重2～3 kg，6～8月齡，雌雄不限。

1.3 實驗方法

1.3.1 同種異體BPTB移植物制備 12只成熟新西蘭大白兔于取材前30 min以速眠新Ⅱ注射液（0.1 g/kg）肌注麻醉。固定后雙后肢脫毛，常規(guī)消毒鋪巾。取髕前內(nèi)側(cè)切口，顯露髕腱，切斷髕骨側(cè)連帶部分股四頭肌腱，脛骨側(cè)鋸斷脛骨連同其前部約1.5 cm骨組織，止血后逐層閉合創(chuàng)口。將獲取的BPTB進一步修整成股骨段骨長1 cm、寬4 mm，脛骨段骨長1 cm、寬4 mm，髕腱寬4 mm。以Co射線處理后裝入無菌瓶中，置于-80℃深低溫冰箱保存3個月以上待用。

1.3.2 同種異體BPTB術(shù)前處理 術(shù)前30 min向裝有同種異體BPTB移植物的無菌瓶內(nèi)，分別注入30 mL VEGF 溶液（30 μg/mL）、30 mL SH溶液（100 μg/mL）、15 mL SH溶液（100 μg/mL）和15 mL VEGF溶液（30 μg/mL）、30 mL PBS溶液。

1.3.3 實驗動物分組及同種異體BPTB重建ACL動物模型制作 將24只新西蘭大白兔隨機分成A、B兩組，每組12只，雙膝均用于實驗。麻醉、肢體固定及消毒方法與前述移植物取材制備步驟相同。取髕前內(nèi)側(cè)切口，將髕骨向外側(cè)脫位，暴露ACL并剪斷。鉆頭于ACL脛骨止點依次鉆出脛骨隧道和股骨隧道。

A組（24膝）隨機選擇兔一側(cè)膝關(guān)節(jié)植入前述經(jīng)VEGF、SH復(fù)合處理的BPTB（SH-VEGF組），另一側(cè)植入僅由PBS處理的BPTB（空白對照組）；B組（24膝）同法隨機選擇兔一側(cè)膝關(guān)節(jié)植入經(jīng)VEGF處理的BPTB（VEGF組），另一側(cè)植入經(jīng)SH處理的BPTB（SH組）。

將BPTB由任一端穿過骨隧道后牢固縫合于骨隧道口周圍筋膜組織上，懸吊式固定，徹底止血后逐層閉合創(chuàng)口。術(shù)后所有術(shù)肢均不予固定，自由活動，予青霉素10萬U/kg，2次/d，連續(xù)注射3 d。分籠飼養(yǎng)，標準飼料，自由飲水。術(shù)后2、4、8周A、B兩組分別安樂處死4只新西蘭大白兔。

1.4 觀察及評估指標

術(shù)后2、4、8周處死動物后對其雙膝關(guān)節(jié)進行解剖，觀察移植物表面及腱骨表面血管化情況。

對移植物進行蘇木精-伊紅染色及血管內(nèi)皮特異性標記抗體CD31免疫組化染色，觀察血管內(nèi)皮細胞數(shù)量及分布；100倍光鏡下觀察免疫組化切片中移植物新生血管分布的大致規(guī)律，400倍光鏡下隨機選取50個視野進行圖像分析，運用Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)測算平均灰度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，手術(shù)前后比較采用重復(fù)測量的方差分析，各組之間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 解剖學(xué)大體觀察

不同時相點關(guān)節(jié)內(nèi)BPTB移植物均為白色致密纖維束狀結(jié)構(gòu)（圖1A）。術(shù)后2周，SH組、空白對照組移植物表面未見明顯滑膜包裹；VEGF組、SH-VEGF組可見移植物脛骨端、股骨端有少量滑膜包裹（圖1B），隧道內(nèi)移植物與骨道壁之間以疤痕組織相連。

術(shù)后4周，SH組、空白對照組移植物表面有少量血管及滑膜包裹，以脛骨端與股骨端為主；VEGF組兩端及體部均有部分滑膜包裹，隧道內(nèi)口及隧道內(nèi)疤痕組織密集，移植物被疤痕組織包繞，難以分離，移植物與骨隧道之間仍有縫隙；SH-VEGF組移植物骨端可見大量血管及滑膜包裹，體部有部分滑膜包裹，骨隧道內(nèi)口連接緊密，隧道內(nèi)可見沿骨隧道排列的軟骨樣組織，移植物與骨隧道之間無縫隙，形成穩(wěn)定的組織連接（圖1C）。

術(shù)后8周，SH組、空白對照組兩骨端有大量滑膜包裹，隧道內(nèi)口見少量疤痕組織，部分隧道內(nèi)口呈橢圓形，移植物與隧道壁之間充滿疤痕組織；VEGF組、SH-VEGF組兩骨端滑膜較4周前減少，移植物與骨隧道間填充大量軟骨樣組織，連接緊密（圖1D）。

2.2 組織學(xué)觀察

2.2.1 蘇木精-伊紅染色 術(shù)后2周，各組BPTB移植物表面已覆蓋部分血管內(nèi)皮細胞，但SH組、空白對照組細胞量較少，移植物深部未見明顯血管形成；術(shù)后4周，血管內(nèi)皮細胞由移植物表面逐漸進入深部（圖2A），進入深部的細胞數(shù)量SH組和空白對照組遠少于VEGF組和SH-VEGF組；術(shù)后8周，4組細胞均到達移植物深部，且初步形成管腔樣結(jié)構(gòu)（圖2B）。

圖1 SH-VEGF組移植物大體解剖觀察 1A完整取出，為白色致密纖維束狀結(jié)構(gòu) 1B術(shù)后2周 1C術(shù)后4周 1D術(shù)后8周

2.2.2 免疫組化染色 術(shù)后2周，SH組、空白對照組移植物CD31免疫組化染色可見極少量棕色顆粒；VEGF組移植物脛骨端與股骨端有較多散在棕色顆粒著色，未見血管腔形成；SH-VEGF組可見少量血管腔形成。術(shù)后4周，SH組、空白對照組移植物有少量棕色顆粒著色，在脛骨端與股骨端可見少量血管腔形成，SH-VEGF組移植物陽性著色由兩端向體部逐步長入（圖2C）。術(shù)后8周，空白對照組移植物脛骨端、股骨端有較多棕色顆粒著色，可見血管腔形成，體部邊緣有少量散在棕色顆粒，向深部逐步減少；SH-VEGF組可見移植物脛骨端、股骨端血管較4周前減少，體部深部可見較多散在棕色染色，并有血管腔形成（圖2D）。

2.2.3 CD31染色灰度值 如表1所示，術(shù)后2、4及8周SH-VEGF組、VEGF組、SH組及空白對照組之間灰度值比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后2、4、8周SH-VEGF組CD31陽性細胞多于其他3組，VEGF組高于SH組及空白對照組（P＜0.05），而術(shù)后不同時相點SH組與空白對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

圖2 SH-VEGF組移植物組織學(xué)觀察（×400）2A，2B 蘇木精-伊紅染色 2C，2D CD31免疫組化染色

表1 同種異體BPTB重建兔ACL術(shù)后移植物CD31染色灰度值（±s，n=4）

表1 同種異體BPTB重建兔ACL術(shù)后移植物CD31染色灰度值（±s，n=4）

注：BPTB：骨-髕腱-骨；ACL：前交叉韌帶；SH：透明質(zhì)酸鈉；VEGF：血管內(nèi)皮生長因子；*與SH-VEGF組相比，P ＜0.05；#與VEGF組相比，P ＜0.05；

組別SH-VEGF組VEGF組SH組空白對照組F值P值2周79.1±7.9 63.4±8.5*21.4±5.1*#20.9±6.1*#37.568 0.006 4周198.7±9.0 88.3±4.8*49.2±4.3*#49.5±3.2*#28.783 0.008 8周126.6±7.7 126.6±3.6*95.0±10.3*#84.9±4.5*#51.022 0.001 F值33.086 50.076 35.089 31.011 P值0.005 0.001 0.005 0.005

術(shù)后4周各組灰度值均高于術(shù)后2周，術(shù)后8周SH-VEGF組灰度值較4周有所下降，而其他3組術(shù)后8周灰度值均較術(shù)后4周時有所上升（P＜0.01）。

如圖3所示，VEGF組、SH組及空白對照組在術(shù)后隨時間推移，平均灰度值逐漸增加；SH組與空白對照組無明顯差異；SH-VEGF組先增后減，峰值出現(xiàn)在術(shù)后4周。

3 討論

3.1 同種異體BPTB的處理

同種異體韌帶和肌腱組織的抗原性主要來自于纖維細胞上的主要組織相容性抗原。異體韌帶經(jīng)深低溫冷凍處理后其主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）遭到破壞，移植物抗原性有所降低[7]。Arnoczky等[8]對新鮮及低溫冰凍處理后BPTB進行對比研究，發(fā)現(xiàn)前者排斥反應(yīng)明顯，后者排斥反應(yīng)不明顯。張培等[9]運用深低溫冷凍異體ACL進行移植，術(shù)后未檢測到任何免疫排斥反應(yīng)；有學(xué)者將手、肩及膝關(guān)節(jié)等部位的冷凍異體軟組織用于移植，未發(fā)現(xiàn)明顯的排斥反應(yīng)[10-11]；Shino等[12]應(yīng)用低溫冷凍保存的BPTB異體移植重建ACL，也未檢測到任何排斥現(xiàn)象。但Pinkowski等[11]對低溫冷凍同種異體髕腱移植重建ACL患者進行臨床研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1例嚴重排斥反應(yīng)。本研究所用同種異體BPTB均在-80℃深低溫冰箱內(nèi)儲存3個月，目的就是為了徹底破壞細胞成分并降低抗原性，盡量減少排斥反應(yīng)對再血管化可能造成的影響。

圖3 不同時間點移植物CD31染色平均灰度值變化趨勢

3.2 生長因子VEGF與韌帶愈合

韌帶愈合是由許多分子啟動、控制、終止的復(fù)雜過程，多種生長因子在韌帶正常愈合過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[13-14]。VEGF是1989年Ferrara和Henzel[15]在牛垂體濾泡星形膠質(zhì)細胞體外培養(yǎng)液中分離純化出來的一種糖蛋白，其主要生物學(xué)功能是促進新生血管形成和增加血管通透性。正常情況下內(nèi)皮細胞并不表達VEGF，缺氧時可迅速誘導(dǎo)VEGF mRNA的表達。在正常氧狀態(tài)下，VEGF半衰期是30～45 min，轉(zhuǎn)變?yōu)榈脱鯛顟B(tài)后半衰期可延長至6～8 h。

本實驗中VEGF在兔體內(nèi)表現(xiàn)出良好的生物學(xué)效應(yīng)。免疫組化染色觀察發(fā)現(xiàn)，復(fù)合30 μg/mL VEGF溶液組BPTB移植重建ACL后，無論在新血管形成時間、數(shù)量，還是血管長入韌帶的時間、深度，都優(yōu)于空白對照組。同時發(fā)現(xiàn)，SH-VEGF染色組血管形成高峰期在第4周，第8周已呈下降趨勢，原因可能有以下三方面：①一次性外源VEGF的生物學(xué)效應(yīng)消失；②機體自身調(diào)節(jié)作用；③正常ACL內(nèi)缺乏血管，新生血管必然退化。而VEGF組則可能由于一次性外源性VEGF過早失效，其血管形成與對照組相似，相對延后。

3.3 SH-VEGF的促移植物血管化作用

作為藥物制劑輔料，SH及其鈉鹽是人體自身固有物質(zhì)，具有良好的可吸收性、生物相容性和黏膜黏附性，可以抑制藥物的擴散、沉降和對流，并黏附在作用部位，緩慢釋放藥物作用。Matsumoto等[16]在嗎啡腸道栓劑中加入3%SH，經(jīng)兔直腸給藥后發(fā)現(xiàn)，該栓劑具有緩釋作用；Surendrakumar等[17]將10%（w/w）重組人胰島素加入SH并噴霧干燥成可吸入性微粒，犬吸入后胰島素平均停留時間和半衰期均較單純胰島素干燥微粒長；SH還可通過共價鍵修飾脂質(zhì)體，借助吸附、靜電作用包裹納米球，從而延長藥效，滿足緩釋要求。

研究表明，聯(lián)合使用具有緩釋作用的SH，VEGF可能更接近生理濃度，并持續(xù)促進血管再生形成[18]。本實驗結(jié)果提示，VEGF復(fù)合SH后對移植物新生血管內(nèi)皮細胞生長的促進作用明顯優(yōu)于單純VEGF組，而單純SH組與空白對照組無明顯差異（P＞0.05），說明在VEGF中加入SH能促進移植物的血管化，而這種促再血管化作用并不是單純由SH引起的，其與VEGF之間可能存在協(xié)同作用。課題組下一步將對SH與VEGF之間的具體結(jié)合方式及作用機制進行深入研究。