段海瀟，楊俊寒，王 琳，王潤楊, 張紫怡，鄒宗幸, 胡 翰，汪 洋, 劉濱磊

(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068)

結(jié)直腸癌是人類長期以來難以攻克的惡性腫瘤，對人類的生命安全構(gòu)成極大的威脅[1]。結(jié)腸癌研究需建立實時觀測的動物模型，而熒光蛋白作為標(biāo)記分子的技術(shù)為生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究提供了重要手段。與傳統(tǒng)的標(biāo)記分子相比，近紅外光域的熒光蛋白(如iRFP713、iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP720)特異性更強，示蹤背景更弱，且無需底物或輔助因子參與。其中iRFP720熒光蛋白使用成本低，激發(fā)光譜連續(xù)且范圍廣，熒光較強，穩(wěn)定性良好，用于熒光成像時在活體動物中穿透能力強，具有檢測靈敏度高和操作簡便等優(yōu)點[2]，可以快速檢測到穩(wěn)定表達(dá)iRFP720的靶細(xì)胞。

本研究旨在構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)iRFP720的CT26細(xì)胞，建立BALB/c[3]小鼠的CT26-iRFP720皮下腫瘤模型，并在動物活體成像設(shè)備中進(jìn)行觀測[4]。

1 實驗材料

iRFP720基因由金斯瑞生物合成，插入到質(zhì)粒PiggyBac Dual Promoter(pPBDP)，構(gòu)建pPBDP-iRFP720作為供體質(zhì)粒，Super PiggyBac Transposase(pSPBT)作為輔助質(zhì)粒，上述材料由System Biosciences公司獲得。CT26細(xì)胞購于北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞資源中心，CT26細(xì)胞和構(gòu)建成功的CT26-iRFP720細(xì)胞所用的培養(yǎng)基是DME/F-12(HyClone, USA)，MEM(HyClone, USA)用于稀釋質(zhì)粒，胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司。Lipofectamine 3000試劑盒(含Lipofectamine 3000和P3000)從Thermo Fisher Scientific公司購買；Western Blot IP細(xì)胞裂解液、PMSF、BCA蛋白定量試劑盒和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天生物；硝酸纖維素濾膜購于Millipore；脫脂乳購于BD；PD-L1鼠單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體購自武漢三鷹生物公司；ECL化學(xué)發(fā)光顯色液購自Bio-sharp。

2 實驗方法

2.1 嘌呤霉素篩選CT26細(xì)胞并確定致死濃度

CT26細(xì)胞消化后計數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整至2×105/mL，每孔500 μL接種于24孔板，于37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，次日將不同濃度的嘌呤霉素加入到CT26細(xì)胞中，連續(xù)6 d對細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行觀察記錄，其間含嘌呤霉素的培養(yǎng)基每2 d更換一次，用移液槍小心吸除死亡的細(xì)胞，再加入含嘌呤霉素的細(xì)胞培養(yǎng)基，第4天通過觀察細(xì)胞全部死亡對應(yīng)的嘌呤霉素濃度確定最低致死濃度[5]。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗

首先準(zhǔn)備需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞CT26，以密度為2×105/mL加入24孔板, 每孔500 μL，放入37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將質(zhì)粒pPBDP-iRFP720和質(zhì)粒pSPBT以質(zhì)量比為5∶1混合后，用含 MEM培養(yǎng)基稀釋 P3000的 A管再去稀釋質(zhì)粒，將 Lipofectamine3000用 MEM培養(yǎng)基稀釋后放入到B管，A管和B管的終體積為25 μL。兩管均勻混合后，室溫靜置10 min，再將復(fù)合物加入到細(xì)胞中[6]，于37℃，5%的CO2條件下培養(yǎng)72 h后觀察GFP的表達(dá)情況。如果GFP的表達(dá)率大于30%，即可繼續(xù)進(jìn)行下游實驗，用嘌呤霉素篩選。

2.3 CT26-iRFP細(xì)胞單克隆挑取

嘌呤霉素篩選完成后，將剩余的細(xì)胞消化并計數(shù)，以10倍梯度稀釋并調(diào)整細(xì)胞密度為5×102/ mL，接種于96孔板，每孔100 μL[7]，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后觀察細(xì)胞，記錄下僅有單個細(xì)胞的孔。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測CT26-iRFP細(xì)胞純度

將CT26細(xì)胞作為對照細(xì)胞，篩選出的細(xì)胞培養(yǎng)至6孔板中，消化后用100 μL的PBS重懸后上樣，用流式細(xì)胞儀檢測CT26-iRFP720中GFP的表達(dá)率[8]。

2.5 Western Blot檢測CT26-iRFP720細(xì)胞上PD-L1表達(dá)

將CT26細(xì)胞和CT26-iRFP720細(xì)胞接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)24 h，加入IP裂解液[9]置冰上裂解細(xì)胞15 min，于12000 r/min 4℃離心20 min，吸取上清，按照BCA說明書定量分析蛋白濃度。配8%的SDS-PAGE分離膠與濃縮膠，靜置30 min,待膠凝固后即可使用。將40 μL的5×蛋白上樣緩沖液加入到160 μL蛋白上清中，加熱100 ℃，10 min，再置于冰盒內(nèi)，冷卻后在上樣槽內(nèi)加入待檢蛋白，先用80 V電泳至Marker有明顯分層，接著調(diào)整電壓至120 V電泳[10]，待溴酚藍(lán)移行至分離膠底部時，停止電泳，將PAGE膠進(jìn)行切割后放置于NC膜上，用濾紙夾住后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，其間將配好的TBST[11]作為含5%脫脂奶粉的封閉液溶劑，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后于25 ℃封閉1 h，用TBST洗膜3次，用含5% BSA的TBST以1∶1000稀釋一抗對膜孵育，4 ℃，過夜，24 h后用含5%脫脂奶粉的TBST以1∶10000比例配制二抗后與膜孵育1 h，其間搖床震蕩，TBST洗膜3次，最后加入ECL顯色液，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中拍攝顯色結(jié)果。

2.6 活體成像系統(tǒng)檢測iRFP720表達(dá)

將1×106個CT26-iRFP720細(xì)胞注射入BALB/c小鼠皮下[12]，每只小鼠注射100 μL細(xì)胞，建立腫瘤模型，在第24天用動物活體成像系統(tǒng)拍攝。

3 實驗結(jié)果

3.1 CT26-iRFP720細(xì)胞系構(gòu)建

如圖1所示，iRFP720 cDNA序列全長951 bp，將該目的基因插入到PiggyBac(PB)載體質(zhì)粒的，通過 CMV啟動子啟動轉(zhuǎn)錄，Puro和GFP基因通過短肽T2A序列鏈接，連接后的序列由EF1α啟動子啟動，獲得pPBDP-iRFP720質(zhì)粒。

圖1 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)質(zhì)粒

3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CT26細(xì)胞

轉(zhuǎn)座子載體質(zhì)粒pPBDP-iRFP720和輔助質(zhì)粒pSPBT轉(zhuǎn)染CT26細(xì)胞，可見發(fā)綠色熒光的CT26-iRFP720，說明轉(zhuǎn)染成功。將30 μg/mL的嘌呤霉素加入轉(zhuǎn)染后的CT26細(xì)胞，4 d，未轉(zhuǎn)染的CT26細(xì)胞死亡(圖2)，存活的發(fā)綠色熒光的細(xì)胞為CT26-iRFP細(xì)胞。

圖2 PBDP-iRFP720轉(zhuǎn)染CT26

3.3 CT26-iRFP720單克隆細(xì)胞挑取

收集CT26-iRFP720細(xì)胞，稀釋至5×102/mL并接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)48 h可見單克隆細(xì)胞。圖3a為在培養(yǎng)48 h后用倒置顯微鏡分別在白光下和綠光下拍攝的CT26-iRFP720單克隆細(xì)胞。

圖3 不同光線下拍攝的 CT26-iRFP720單克隆挑取圖

3.4 流式細(xì)胞儀檢測CT26-iRFP720單克隆細(xì)胞

CT26細(xì)胞作為對照組和 CT26-iRFP720細(xì)胞作為實驗組，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測兩組細(xì)胞 GFP的表達(dá)(圖4)，顯示 CT26-iRFP720中 GFP表達(dá)率達(dá)到98.1%。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測CT26-iRFP720單克隆細(xì)胞純度

3.5 Western Blot檢測CT26-iRFP720細(xì)胞 PD-L1的表達(dá)

收集CT26和CT26-iRFP720細(xì)胞，分別提取蛋白后進(jìn)行Western Blot檢測。圖5顯示CT26和CT26-iRFP720兩組細(xì)胞中的目的蛋白PD-L1均有較高表達(dá)，改造后的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系CT26-iRFP720的PD-L1表達(dá)量與CT26無明顯差異。

圖5 Western Blot檢測CT26-iRFP720細(xì)胞PD-L1表達(dá)

3.6 BALB/c模型建立

為了證明 CT26-iRFP細(xì)胞系能夠在小鼠體內(nèi)表達(dá) iRFP720，在小鼠右側(cè)背部植入 CT26-iRFP720細(xì)胞(圖6)。在第24天時，用活體成像系統(tǒng)觀察到植瘤部位有明顯的腫瘤生長，且 iRFP720表達(dá)顯著。

圖6 動物活體成像拍攝CT26-iRFP720圖

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒pPBDP-iRFP720-GFP和pSPBT轉(zhuǎn)入CT26細(xì)胞中，用嘌呤霉素作為篩選試劑，通過顯微鏡觀察熒光及流式細(xì)胞儀檢測，獲得GFP高純度表達(dá)的CT26-iRFP720單克隆細(xì)胞株，經(jīng)Wstern Blot檢測，CT26和CT26-iRFP720中PD-L1的表達(dá)表達(dá)無明顯差異。

在動物實驗中，將構(gòu)建成功的CT26-iRFP720細(xì)胞于BALB/c小鼠背部右側(cè)皮下植瘤,活體成像檢測到較強的iRFP720信號，說明已構(gòu)建成功的CT26-iRFP720細(xì)胞株在動物體內(nèi)成功表達(dá)，因此，CT26-iRFP720細(xì)胞株既可以用于體外試驗，也可以開展動物體內(nèi)研究。