田珂

（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院麻醉科 廣東 廣州 510515）

缺血性再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是引發(fā)急性腎損傷的主要原因，尤其是在腎臟移植的過(guò)程中，IRI情況無(wú)法避免，繼而當(dāng)此情況發(fā)生時(shí)，不僅會(huì)對(duì)術(shù)后腎功能恢復(fù)造成影響，還會(huì)影響移植腎的長(zhǎng)期存活[1-2]。因此，如何對(duì)IRI的生物學(xué)機(jī)制尋找有效保護(hù)與干預(yù)措施，在臨床一直當(dāng)做重要問(wèn)題進(jìn)行探究。在臨床探究的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）有修復(fù)與再生以及免疫調(diào)節(jié)功能，并且外源性MSC 可對(duì)急性腎損傷進(jìn)行減輕[3-4]。但臨床研究資料較少，存在爭(zhēng)議性，加之，近幾年的臨床中發(fā)現(xiàn)，外泌體（exosme）可作為細(xì)胞間相互作用的重要手段，exosme 會(huì)通過(guò)膜受體或是內(nèi)吞的方式進(jìn)入靶細(xì)胞，并向其傳遞exosme 中所攜帶的蛋白質(zhì)等細(xì)胞，產(chǎn)生信號(hào)復(fù)合體，激活相關(guān)分子信號(hào)通路[5-6]。因在MSC 所分泌的exosme 體積比較小，肉眼不能見(jiàn)到，不明確若大量提取MSC 所分泌的exosme 對(duì)IRI 所引起的急性腎損傷是否存在保護(hù)作用[7]，因而為證實(shí)這一依據(jù)，本次探究選取在我院實(shí)驗(yàn)室中的SPF 級(jí)雄性SD 大鼠21 只，探究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷保護(hù)作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取SPF 級(jí)雄性SD 大鼠21 只，均飼養(yǎng)于我院實(shí)驗(yàn)室中，時(shí)間2015 年4 月—2017 年7 月，大鼠重量范圍在200g ～250g，平均重量在（224.1±14.5）g，將實(shí)驗(yàn)室大鼠進(jìn)行分組、腎臟IRI 模型的建立：首先將21 只SD 雄性大鼠隨機(jī)數(shù)字分為3組，假手術(shù)組（Sham 組），缺血再灌注組（IR 組），MSC 來(lái)源exosme 處理組（IR+MSC-ex,100μgexosme/1mlPBS），每組7 只。

1.2 方法

首先建立大鼠腎臟IRI 模型：右側(cè)的輸尿管先進(jìn)行結(jié)扎，在將右腎與腎蒂進(jìn)行切除，繼而暴露左側(cè)腎臟，以無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉左腎蒂45min，取氣管從旁側(cè)行縱行切口對(duì)皮膚、肌肉進(jìn)行切開(kāi)，將左側(cè)頸動(dòng)脈進(jìn)行游離，以24G 靜脈穿刺針行頸動(dòng)脈穿刺，完成后使用套線對(duì)其固定，給予各組相應(yīng)注射治療，結(jié)扎頸動(dòng)脈。術(shù)后將每組大鼠分開(kāi)飼養(yǎng)，自由飲食。

其次進(jìn)行標(biāo)本收集與病理學(xué)檢測(cè)：48h 各組大鼠會(huì)因頸椎脫臼而被處死，使用相關(guān)儀器對(duì)血清肌酐尿素進(jìn)行查驗(yàn)與檢測(cè)，并將血清與大鼠中的腎組織當(dāng)作標(biāo)本。用4%甲醛對(duì)各組大鼠腎臟組織進(jìn)行固定，后使用石蠟包埋，常規(guī)HE 染色，在200 倍光鏡下，選取10 個(gè)腎小管在10 個(gè)視野中進(jìn)行評(píng)測(cè)，觀測(cè)過(guò)程中視野要在400 倍，數(shù)量選取20 個(gè)。然后對(duì)20 個(gè)視野下的腎小管細(xì)胞凋亡數(shù)量進(jìn)行記錄，并將其組織平均數(shù)進(jìn)行切片評(píng)分。

最后為組織蛋白提?。耗I臟組織勻漿裂解后提取蛋白，用β 肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照，每組實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)3 遍。

1.3 觀察指標(biāo)

血肌酐、尿素氮：觀察記錄三組實(shí)驗(yàn)白鼠術(shù)后48h 腎臟血肌酐、尿素氮水平并進(jìn)行對(duì)比。

腎組織病理改變：觀察記錄三組實(shí)驗(yàn)白鼠術(shù)后腎組織病理變化并進(jìn)行對(duì)比。

TUNEL 凋亡檢測(cè)：觀察記錄三組實(shí)驗(yàn)白鼠TUNEL 凋亡檢測(cè)結(jié)果并進(jìn)行對(duì)比。

腎組織蛋白水平：觀察記錄三組實(shí)驗(yàn)白鼠腎組織蛋白水平并進(jìn)行對(duì)比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用PSS23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。數(shù)值變量數(shù)據(jù)采用（）表示，采取t 檢驗(yàn)或F 檢驗(yàn)；無(wú)序分類(lèi)數(shù)據(jù)以百分比率（%）表示，采取χ2檢驗(yàn)；P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 Sham 組、IR+MSC-ex 術(shù)后48h 腎臟血肌酐、尿素氮水平與IR 組相比，均有明顯下降，且有明顯差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 觀察記錄三組實(shí)驗(yàn)白鼠術(shù)后48h 腎臟血肌酐、尿素氮水平并進(jìn)行對(duì)比（，μmol/L）

表1 觀察記錄三組實(shí)驗(yàn)白鼠術(shù)后48h 腎臟血肌酐、尿素氮水平并進(jìn)行對(duì)比（，μmol/L）

注：假手術(shù)組（Sham 組），缺血再灌注組（IR 組），MSC 來(lái)源exosme 處理組（IR+MSC-ex,100μgexosme/1mlPBS）。

組別 n 血肌酐 尿素氮Sham 組 7 88±25 7.38±0.91 IR 組 7 456±34 47.52±2.91 IR+MSC-ex 7 242±32 32.98±5.61 F-255.713 212.738 P-0.000 0.000

2.2 腎組織病理改變結(jié)果：Sham 組未見(jiàn)組織病理?yè)p害，IR組有明顯病理?yè)p害，即表現(xiàn)為腎小管結(jié)構(gòu)被破壞且細(xì)胞腫脹變性，腎小管管腔擴(kuò)張，可見(jiàn)管型，且伴有腎見(jiàn)出血、水腫現(xiàn)象，炎細(xì)胞被浸潤(rùn)。IR+MSC-ex 比IR 組損害較輕。

2.3 TUNEL 凋亡檢測(cè)結(jié)果：Sham 組未見(jiàn)明顯凋零亡細(xì)胞，IR 組凋亡腎小管上皮細(xì)胞明顯增多，管腔內(nèi)存在凋亡細(xì)胞。IR+MSC-ex 與IR 組比較，凋亡細(xì)胞明顯減少。

2.4 腎組織蛋白水平結(jié)果：IR組腎組織蛋白水平明顯增高，IR+MSC-ex 相較IR 組蛋白水平有明顯降低，Sham 組無(wú)變化。

3.討論

MSC 可分化為多種細(xì)胞，且所被分化的多種細(xì)胞中都存在潛在的多能干細(xì)胞，此外MSC 具有歸巢能力。Exosme 會(huì)存在與晚期MSC 細(xì)胞的多泡體中，呈現(xiàn)形式是以腔內(nèi)囊泡存在，在MSC 中可承擔(dān)旁分泌作用，即可在多泡體中與細(xì)胞壁融合釋放。Exosme 肉眼是無(wú)法看到的，較為規(guī)范的定義是為，直徑約在30～130mm，密度在1.13 ～1.21g/dl 之間，例如CD63/MHC 類(lèi)分子。在本實(shí)驗(yàn)中，是通過(guò)透射電鏡對(duì)exosme 進(jìn)行觀察，并提取exosme 中結(jié)構(gòu)，名為微囊小體結(jié)構(gòu)，即直徑在30 ～60mm 圓形或是橢圓形，大小基本一致，通過(guò)透射鏡觀察可判斷出exosme是MSC 所分泌的來(lái)源外泌體。

在本次實(shí)驗(yàn)中，正式MSC 所分泌的exosme 可對(duì)腎臟的TRI 形成保護(hù)作用，即在IRI 中，組織損傷的表現(xiàn)形式為細(xì)胞凋亡，繼而導(dǎo)致DNA 斷裂。在本次的實(shí)驗(yàn)中，在出現(xiàn)IRI 后，TUNEL 染色陽(yáng)性細(xì)胞就停留在腎小管上皮，由此可知，缺血再灌注會(huì)直接引起腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，而IR+MSC-ex 與IR組相比凋亡細(xì)胞有明顯的較少，由此可證明，MSC 所分泌的exosme 可對(duì)腎臟IRI 后腎小管上皮細(xì)胞形成保護(hù)作用。最后在本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，MSC 來(lái)源exosme 可有效抑制并減輕腎損傷，而IR+MSC-ex 對(duì)腎臟無(wú)明顯保護(hù)作用，由此可知exosme作用與來(lái)源有緊密聯(lián)系，并且MSC 還可通過(guò)旁分泌細(xì)胞因子等發(fā)揮其保護(hù)作用。

綜上，大鼠中的充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）來(lái)源外泌體（exosme）可對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，可降低凋亡水平，改善蛋白質(zhì)水平，改善腎臟水平。