劉寧 陳華 呂文（通訊作者）

（深圳市人民醫(yī)院急診科 廣東 深圳 518000）

結(jié)腸癌是一種常見消化道惡性腫瘤，致死率較高，且預(yù)后差、腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)為致死重要原因[1]。當(dāng)前，臨床尚未具體明確結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制，影響疾病早期診治。微小RNAs（miRNAs）屬于生物體內(nèi)一種內(nèi)源性非編碼小核糖核酸，可直接靶向作用于mRNA 互補(bǔ)序列3'-UTR，經(jīng)由對(duì)靶基因翻譯進(jìn)行降解、控制，發(fā)揮抑制靶基因表達(dá)作用[2]。而miR-320a 是一類經(jīng)典抑癌基因，在多種腫瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。FOXQ1 在人體細(xì)胞代謝、凋亡、癌變等生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用，且與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，特別是在結(jié)腸癌中，受多種因子調(diào)控。本研究就該問題進(jìn)行分析，探討結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞中miR-320a生物學(xué)行為，并分析對(duì)癌基因FOXQ1的靶向調(diào)控機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用ATCC 細(xì)胞庫提供的人HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞株。試劑包括福麥斯生物科技有限公司PCR 熒光定量試劑盒、美國(guó)Abcam 公司FOXQ1、武漢博士德公司McCoy's 5A 培養(yǎng)基、上海吉馬公司人miR-320a mimics 及陰性對(duì)照小干擾RNA 等。儀器包括日本Nikon 公司倒置常規(guī)顯微鏡、美國(guó)Applied Biosystems 公司熒光定量PCR 儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）細(xì)胞株培養(yǎng)、傳代及轉(zhuǎn)染：HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞株以McCoy's 5A 培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞融合80%～90%，經(jīng)EDTA 胰酶消化，行常規(guī)傳代培養(yǎng)。根據(jù)脂質(zhì)體2000 試劑說明書，將人miR-320a mimics 轉(zhuǎn)染miR-320a 低表達(dá)HCT116 細(xì)胞，對(duì)照組為NC 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染完成后6h，調(diào)整成完全培養(yǎng)基。

（2）miR-320a 表達(dá)檢測(cè)：HCT116-mimics、HCT116-NC 組結(jié)直腸細(xì)胞總RNA 均經(jīng)Trizol 法提取。根據(jù)cDNA 合成試劑盒，實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用定時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)miR-320a 表達(dá)，采用qPCR SuPerMix 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)，U6 為檢測(cè)miR-320a 指標(biāo)，GAPDH 為檢測(cè)FOXQ1 指標(biāo)。各樣本中miR-320a、FOXQ1 相對(duì)表達(dá)量采用目的基因表達(dá)量=2-△△△計(jì)算，各組檢測(cè)3個(gè)復(fù)孔取均值。

（3）細(xì)胞增殖、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染24h，在96 孔板上接種HCT116 細(xì)胞，各孔均加入溶液，置入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，共48h。細(xì)胞活力以CCK-8 法檢測(cè)，各組檢測(cè)3 個(gè)復(fù)孔取均值。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116 細(xì)胞制備為單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)成103個(gè)細(xì)胞，在6cm2培養(yǎng)皿內(nèi)接種2 周，甲醇固定，1g/L 結(jié)晶紫染色，計(jì)算肉眼可見克隆形成數(shù)，形成率為（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

（4）細(xì)胞侵襲及熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)：取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，培養(yǎng)24h，制備成單細(xì)胞懸液，在Traswell 小室內(nèi)接種，以無血清McCoy's 5A 培養(yǎng)基200μL 加入上室，以含10% FBS的McCoy's 5A 培養(yǎng)基500200μL 加入下室，置入37℃培養(yǎng)箱24h；結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)，各組檢測(cè)3 個(gè)復(fù)孔取均值。并行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，觀察并記錄數(shù)據(jù)，各組檢測(cè)3 個(gè)復(fù)孔取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.結(jié)果

2.1 miR-320a 對(duì)HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用

轉(zhuǎn)染miR-320a mimics 后HCT116 細(xì)胞數(shù)少于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見表1。HCT116-mimics 組細(xì)胞活力低于HCT116-NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見表2。

表1 miR-320a mimic 組、陰性對(duì)照組HCT116 細(xì)胞數(shù)對(duì)比（）

表1 miR-320a mimic 組、陰性對(duì)照組HCT116 細(xì)胞數(shù)對(duì)比（）

組別 例數(shù) HCT116 細(xì)胞數(shù)miR-320a mimics 組 3 43.51±14.26陰性對(duì)照組 3 228.58±18.67 t-13.654 P-0.000

表2 HCT116-mimics 組、HCT116-NC 組細(xì)胞活力對(duì)比（）

表2 HCT116-mimics 組、HCT116-NC 組細(xì)胞活力對(duì)比（）

組別 例數(shù) 細(xì)胞活力HCT116-mimics 組 3 0.51±0.13 HCT116-NC 組 3 1.03±0.15 t-4.537 P-0.005

2.2 miR-320a 對(duì)HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲的作用

HCT116-mimics 組穿膜細(xì)胞數(shù)少于HCT116-NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見表3。

表3 HCT116-mimics 組、HCT116-NC 組穿膜細(xì)胞數(shù)對(duì)比（）

表3 HCT116-mimics 組、HCT116-NC 組穿膜細(xì)胞數(shù)對(duì)比（）

組別 例數(shù) 穿膜細(xì)胞數(shù)HCT116-mimics 組 3 0.38±0.05 HCT116-NC 組 3 1.02±0.11 t 9.174 P 0.000

2.3 HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-320a 與FOXQ1 間關(guān)系

miR-320a mimics 組熒光酶活性低于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見表4。Western blot 實(shí)驗(yàn)顯示，上調(diào)miR-320a可促使HCT116細(xì)胞內(nèi)FOXQ1蛋白表達(dá)水平降低，見圖1。

表4 miR-320a mimics 組、陰性對(duì)照組熒光酶活性對(duì)比（）

表4 miR-320a mimics 組、陰性對(duì)照組熒光酶活性對(duì)比（）

組別 例數(shù) 熒光酶活性miR-320a mimics 組 3 0.41±0.03陰性對(duì)照組 3 1.01±0.09 t-10.954 P-0.000

圖1 上調(diào)miR-320a 可抑制HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)FOXQ1 蛋白表達(dá)

3.討論

結(jié)腸癌是一種常見病、多發(fā)病，全世界每年新診斷病例達(dá)60 萬，國(guó)內(nèi)惡性腫瘤中患病率、死亡率均居第四位[4]。而臨床探索參與結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，探尋與增殖、侵襲相關(guān)新型靶基因，以指導(dǎo)治療方案制定，提升患者生存率，具有重要意義。miRNA 屬于18-24 核苷酸長(zhǎng)度小片段非編碼RNA，能對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行抑制，或促進(jìn)靶基因降解。較多研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中存在較多miRNA 異常表達(dá)，且參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[5-7]。而miR-320a 是一種新近發(fā)現(xiàn)的miRNA，被證實(shí)在多種癌癥（含結(jié)腸癌）中存在表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象，認(rèn)為其可經(jīng)多通路抑制結(jié)腸癌發(fā)展進(jìn)程[8]。

FOXQ1 為叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在人體多組織及器官內(nèi)廣泛分布，主要定位于人類染色體6P25.3，編碼一種功能性氨基酸蛋白，參與人體細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、凋亡或癌變等生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXQ1 激活可對(duì)下游基因產(chǎn)生影響，在腫瘤細(xì)胞生成、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，且在結(jié)直腸癌、乳腺癌等較多腫瘤中存在高表達(dá)[9]。結(jié)腸癌中，F(xiàn)OXQ1 受多種因子調(diào)控，如TGF-β 等，但臨床就結(jié)腸癌中miR-320a 是否也為FOXQ1 調(diào)控因子，尚無明確定論。而生物信息軟件提示，F(xiàn)OXQ1 3'端非翻譯區(qū)存在miR-320a 潛在結(jié)合位點(diǎn)。故本研究提出結(jié)腸癌中上調(diào)miR-320a 可抑制FOXQ1 表達(dá)的假設(shè)，并進(jìn)行驗(yàn)證。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-320a mimics 后HCT116 細(xì)胞數(shù)明顯較陰性對(duì)照組少，說明上調(diào)miR-320a 表達(dá)，能對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖進(jìn)行抑制。而且，HCT116-mimics 組細(xì)胞活力較HCT116-NC 組低，也提示miR-320a mimics 可抑制HCT116 細(xì)胞活力。此外，HCT116-mimics 組穿膜細(xì)胞數(shù)較HCT116-NC 組少，提示miR-320a mimics可降低HCT116 細(xì)胞侵襲能力。本研究還實(shí)施雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，以驗(yàn)證FOXQ1 是否為miR-320a 直接靶基因，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，miR-320a mimics 組熒光酶活性低于陰性對(duì)照組，而上調(diào)miR-320a 可促使HCT116 細(xì)胞內(nèi)FOXQ1 蛋白表達(dá)水平降低，這說明FOXQ1為miR-320a一個(gè)直接靶標(biāo)，與湯增秋等[10]結(jié)果相符。因此，筆者認(rèn)為，miR-320a 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)功能調(diào)控中，靶向抑制FOXQ1 基因也是一個(gè)重要途徑，能為結(jié)腸癌中miR-320a 作用機(jī)制提供新方向。

綜上所述，結(jié)腸癌中，miR-320a可抑制腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲，且作用機(jī)制可能與靶向抑制FOXQ1基因有關(guān)，值得進(jìn)行深入研究。