孫廣玉 王淑燕 李九州 張萍 張瑩瑩

（山東省濱州市人民醫(yī)院 山東 濱州 256600）

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，具有侵襲性和復發(fā)性，早期難以通過影像診斷而被發(fā)現(xiàn)。目前膠質(zhì)瘤的治療以手術(shù)切除為主，輔以化療放療及免疫治療和生物治療等措施。這些方法的治療效果并不令人滿意，主要是治療后易復發(fā)，復發(fā)后的腫瘤其惡性程度進一步增加。因此，尋找一種新的、更有效的生物治療方法，是當前臨床迫切需要解決的問題[1]。最近的研究表明，色素上皮衍生因子（PEDF）可以誘導分化并抑制幾種腫瘤的血管生成[2]。然而，PEDF 在膠質(zhì)瘤中的角色仍需進一步研究。在腫瘤血管生成過程中，血管生成相關(guān)因子發(fā)揮重要的調(diào)控作用。這些細胞因子可分為兩大類：一類為促進因子如血管內(nèi)皮生成因子VEGF，另一類為抑制因子例如PEDF、血小板反應蛋白TSP-1[3]。這兩類因子在膠質(zhì)瘤發(fā)展過程中是否具有相互調(diào)控作用尚不清楚，了解它們之間的調(diào)控關(guān)系將在抗血管生成方面為腦膠質(zhì)瘤的有效治療提供有力證據(jù)。因此，本文著重探討色素上皮衍生因子（PEDF）在腦膠質(zhì)瘤患者組織中的表達與臨床病癥的相關(guān)性及其對膠質(zhì)瘤血管生成方面的調(diào)控作用。

1.資料與方法

1.1 一般資料

在患者知情同意下，選擇2017 年5 月—2018 年12 月我院收治的80 例腦膠質(zhì)瘤患者，收集它們的臨床資料。術(shù)后的腦膠質(zhì)瘤組織行免疫組織化學染色檢測PEDF 的表達。在進行PEDF 的表達與臨床病理特征相關(guān)性分析時，主要從性別、年齡、臨床分期等方面進行評估。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞樣品的獲得 將重組蛋白rPEDF 加入腦膠質(zhì)瘤細胞A172 中（A172PEDF），同時以未加入PEDF 蛋白的腦膠質(zhì)瘤細胞作為對照（A172con），24 小時后取培養(yǎng)液并收集細胞分別檢測VEGF、TSP-1 胞外分泌量和細胞內(nèi)表達量。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附實驗 根據(jù)試劑盒說明書，取細胞培養(yǎng)液加入單抗包被的檢測孔內(nèi)，經(jīng)過孵育、加生物素標記的二抗、孵育、加反應液和終止液等步驟，在酶標儀上測定每孔吸光度（A）值，按標準曲線計算蛋白濃度。

1.2.3 蛋白免疫印跡 收取的細胞加入RIPA 裂解液冰上裂解30min 后，BCA 法進行總蛋白定量后，變性并煮沸后的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育第一抗體和第二抗體步驟后，顯色檢測蛋白表達情況。蛋白條帶用Image J 軟件進行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism7 軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料行χ2檢驗，采用n（%）表示，計量資料行t 檢驗，采用（）表示，P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2.結(jié)果

2.1 PEDF 的表達與腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病理特征分析

為了研究PEDF 在腦膠質(zhì)瘤發(fā)展中的作用，我們對80 份膠質(zhì)瘤組織切片行免疫組織化學染色以測定PEDF 的表達。通過配對患者的臨床資料特征后，我們將PEDF 的陽性表達與患者的臨床病癥進行相關(guān)性分析。數(shù)據(jù)分析表明，腦膠質(zhì)瘤患者的PEDF的表達與性別、年齡無關(guān)，而與膠質(zhì)瘤的臨床分期有一定的相關(guān)性（P ＜0.05）。這一結(jié)果提示，PEDF 在惡性程度較低的患者腦膠質(zhì)瘤組織中表達相對豐富，見表1 和圖1。

表1 PEDF 的表達與腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病理特征分析

圖1 PEDF 的表達與腦膠質(zhì)瘤患者臨床分期的相關(guān)性

2.2 PEDF 對腦膠質(zhì)瘤細胞中的VEGF 和TSP-1 表達的調(diào)控

為了進一步探討PEDF 對腦膠質(zhì)瘤發(fā)展的調(diào)控作用，我們用體外重組蛋白rPEDF 處理膠質(zhì)瘤細胞，并檢測血管生成相關(guān)因子的表達。經(jīng)免疫吸附法測定后，相比于A172con，A172PEDF 細胞培養(yǎng)液中VEGF 含量有所減少，TSP-1 的含量有所增加（P ＜0.05）。蛋白免疫印跡實驗可以得到類似的結(jié)果，相比于對照組，在A172PEDF 細胞中，VEGF 的表達顯著降低，而TSP-1 的表達則顯著上升，見表2 和圖2。我們的結(jié)果表明，PEDF 可通過調(diào)控血管生成關(guān)鍵因子的表達發(fā)揮抗腫瘤作用。

表2 rPEDF 對腦膠質(zhì)瘤細胞中VEGF 和TSP-1 表達的影響（）

表2 rPEDF 對腦膠質(zhì)瘤細胞中VEGF 和TSP-1 表達的影響（）

注：（細胞外分泌，單位μg/ml）

檢測項目 A172con A172PEDF VEGF 1.23±0.06 0.66±0.09 TSP-1 346±87 1848±142 P＜0.05 ＜0.05

圖2 rPEDF 對腦膠質(zhì)瘤細胞中VEGF 和TSP-1 表達的影響（細胞內(nèi)，A172con 為對照）

3.討論

本研究中，通過對腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病癥與他們膠質(zhì)瘤組織中PEDF的表達進行相關(guān)性分析證實PEDF的表達與患者性別、年齡無關(guān)，而與臨床分期有一密切的關(guān)系（P ＜0.05）。同時，通過分子生物學手段探究了PEDF 對腦膠質(zhì)瘤細胞中某些癌癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)分子表達的調(diào)控作用，證實PEDF 可調(diào)節(jié)VEGF 的下調(diào)表達，同時上調(diào)TSP-1 的表達（P ＜0.05）。

臨床研究證明，PEDF 在正常腦組織的表達量是膠質(zhì)瘤組織中的數(shù)倍[4]。這與我們的研究結(jié)果有相似之處，即惡性程度低的膠質(zhì)瘤組織中PEDF 蛋白表達陽性率反而更高。PEDF 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用主要包括促進神經(jīng)元細胞存活、充當視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，因此在膠質(zhì)瘤組織中PEDF 的低表達可能是導致膠質(zhì)瘤發(fā)展的重要因素[5]。此外研究證實，PEDF 既是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，又是一種內(nèi)源性新生血管抑制劑[6]。與PEDF 抑制新生血管生成、抗腫瘤和促進腫瘤細胞分化等多種功能不同的是，VEGF 可促進血管內(nèi)皮細胞增殖、分化從而促進新生血管形成，在腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用。最新的研究也顯示它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[7]。TSP-1 作為首先被發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性抗血管生成因子之一，它具有抑制內(nèi)皮細胞增殖、遷移和毛細血管形成的功能。我們的研究證實，在膠質(zhì)瘤細胞中，PEDF 可顯著調(diào)控VEGF 和TSP-1 的表達。這樣，PEDF可以在抑制血管生成方面發(fā)揮抑制腫瘤的作用。然而，本研究仍然存在不足，例如缺乏體內(nèi)實驗的依據(jù)。我們計劃下一步開展PEDF 對裸鼠膠質(zhì)瘤模型的治療研究。

綜上所述，基于臨床分析和細胞學實驗結(jié)果表明，PEDF 與腦膠質(zhì)瘤患者疾病嚴重程度密切相關(guān)，同時是影響腫瘤新生血管形成的主要調(diào)控因子。PEDF 表達情況與膠質(zhì)瘤的惡性程度及血管生成呈負相關(guān)，PEDF有可能成為膠質(zhì)瘤生物學治療的一種有效的新方法。