李平 龍清孟 張蕓 陳大芳 譚曉山 周迪 李瀟蒙 李俊 馮文武

摘要：以貴州黑山羊、酉州烏羊和努比亞3個品種為試驗群體，采用PCR產(chǎn)物直接測序技術(shù)檢測NPY-Y1R基因的多態(tài)性，并探討其多態(tài)性對山羊繁殖性狀的影響，為山羊繁殖力的標(biāo)記輔助選擇和育種提供理論依據(jù)。利用Excel計算基因頻率、基因型頻率;利用POPGEN軟件計算遺傳多態(tài)性參數(shù)純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量并對Hardy-wein-berg平衡狀態(tài)進行分析;用SPSS軟件對3個山羊群體NPY-Y1R基因多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，NPY-Y1R基因外顯子中檢測到1個單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點，NPY-Y1R基因在外顯子2處存在突變位點G1141A，3個山羊群體在此突變位點處均存在2種基因型，分別為AG、GG;貴州黑山羊、酉州烏羊和努比亞χ2均未達到顯著水平，處于Hardy-Wein-berg平衡狀態(tài)，貴州黑山羊和努比亞表現(xiàn)為低度多態(tài)，酉州烏羊表現(xiàn)為中度多態(tài)。AG基因型個體在貴州黑山羊、酉州烏羊、努比亞群體中產(chǎn)羔數(shù)顯著高于GG基因型個體（P<0.05），呈現(xiàn)出AG>GG趨勢。AG基因型個體的山羊在后續(xù)的試驗中待進一步認(rèn)證，結(jié)果可為初步判定山羊NPY-Y1R基因的突變與繁殖性能的研究奠定試驗基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：貴州黑山羊;酉州烏羊;努比亞山羊;NPY-Y1R基因多態(tài)性;繁殖性能

中圖分類號：S827.3 ??文獻標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0171-03

神經(jīng)肽Y1受體（NPY-Y1R）是含有36個氨基酸殘基的一種單鏈多肽，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)，與YY肽和胰多肽一起構(gòu)成多肽家族[1-2]?？蒲腥藛T在小鼠上研究發(fā)現(xiàn)，NPY-Y1R基因敲除能夠損害小鼠促性腺軸，使小鼠對能量貯存感知的能力下降[3-4]，同時發(fā)現(xiàn)NPY-Y1R基因在下丘腦中的表達受身體能量平衡變化的影響[5]，NPY-Y1R基因在生殖功能調(diào)節(jié)與性發(fā)育中有重要作用，可能是影響山羊產(chǎn)羔數(shù)性狀的一個主效基因[6]。儲明星等在山東濟寧青山羊上研究發(fā)現(xiàn)NPY-Y1R基因的EF型濟寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)比EE型多0.58只（P<0.01），并且F等位基因與濟寧青山羊性早熟和高繁殖力相關(guān)[1]。樊奇在貴州白山羊和川東白山羊2個群體中發(fā)現(xiàn)，AB基因型山羊產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AA基因型（P<0.05），而在古藺馬羊、貴州白山羊和川東白山羊3個群體中AA型和AB型之間的初生質(zhì)量最小二乘均值沒有顯著差異（P>0.05）[2]。目前，NPY-Y1R基因在山羊上的研究并不是很多，本研究以貴州黑山羊、酉州烏羊、努比亞3個山羊群體為研究對象，利用分子遺傳標(biāo)記輔助選擇手段，研究NPY-Y1R基因在3個山羊群體中的多態(tài)性及對繁殖性狀的影響，旨在為選育山羊高產(chǎn)仔率品種和培育高繁殖性狀羊群提供理論依據(jù)，并應(yīng)用于在實踐生產(chǎn)中。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗樣品采集自貴州省黔西南布依族苗族自治州冊亨縣冗渡鎮(zhèn)貴州領(lǐng)頭羊山地草牧業(yè)科技有限公司。采取前腔頸靜脈采血方式，采集93只經(jīng)產(chǎn)貴州黑山羊、72只酉州烏羊、63只努比亞的血液，于-20 ℃保存血液備用。整理收集3個品種山羊產(chǎn)仔記錄數(shù)據(jù)。

1.2 血液DNA提取

血液樣本DNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒，用1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA質(zhì)量進行檢測。通過超微量紫外分光光度計NanoDrop-ONE檢測DNA D260 nm/D280 nm比值。

1.3 引物設(shè)計與合成

引物參照儲明星等的引物設(shè)計方法[1]，合成NPY-Y1R基因2個外顯子的引物序列見表1。引物由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 PCR擴增

以貴州黑山羊、酉州烏羊和努比亞基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中PCR Mixture 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，加蒸餾水至反應(yīng)體系為20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，退火（退火溫度見表1）30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán);72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。

1.5 PCR產(chǎn)物測序

用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。選擇條帶單一、清晰明亮、產(chǎn)量高的PCR產(chǎn)物送上海立菲生物技術(shù)有限公司進行雙向測序。用DNAStar軟件中的SeqMan對序列結(jié)果進行分析。

1.6 遺傳多態(tài)性分析

應(yīng)用數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件計算NPY-Y1R基因的基因頻率、基因型頻率。利用POPGEN軟件計算遺傳多態(tài)性參數(shù)純合度（Ho）、雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC），并對Hardy-Wein-berg平衡狀態(tài)進行分析。

1.7 NPY-Y1R基因與產(chǎn)仔數(shù)關(guān)聯(lián)性分析

利用SPSS軟件對3個品種山羊群體NPY-Y1R基因多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)進行關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA檢測結(jié)果

提取的貴州黑山羊、酉州烏羊和努比亞血液基因組DNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰明亮，無RNA和蛋白質(zhì)等污染（圖1）。利用超微量紫外分光光度計Nano Drop-ONE檢測DNA，D260nm/D280 nm值在1.8～2.0之間，說明DNA提取效果好，純度高。結(jié)合圖像及檢測結(jié)果判斷提取的DNA純度與質(zhì)量可滿足后續(xù)試驗要求。

2.2 PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果

NPY-Y1R基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別在187、219 bp處有清晰條帶，與預(yù)期片段大小一致。

2.3 測序結(jié)果分析

經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)3個山羊群體在NPY-Y1R基因的第2外顯子2上的G1141A位點處有突變，并且3個山羊群體均存在2種基因型，分別為AG、GG型，存在多態(tài)性見圖2。3個山羊群體在NPY-Y1R基因第2外顯子1上，均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。

2.4 NPY-Y1R基因的基因型頻率和等位基因頻率

3個品種山羊群體NPY-Y1R基因在G1141A位點上，不同基因型的基因型頻率、等位基因頻率和群體遺傳多態(tài)性見表2。3個群體NPY-Y1R基因的G1141A位點G等位基因頻率高于A等位基因頻率，G為優(yōu)勢等位基因;GG基因型頻率高于AG，GG為優(yōu)勢基因型。3個品種山羊群體χ2均未達到顯著水平， 處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。3個品種的基因純合度均較高。根據(jù)多態(tài)信息含量的標(biāo)準(zhǔn)：PIC≥0.50為高度多態(tài)，0.50>PIC≥0.25為中度多態(tài)，PIC<0.25為低度多態(tài)，貴州黑山羊和努比亞表現(xiàn)為低度多態(tài)，酉州烏羊表現(xiàn)為中度多態(tài)。

2.5 NPY-Y1R基因不同基因型對不同品種羊產(chǎn)羔數(shù)的影響

利用SPSS軟件對3個山羊群體NPY-Y1R基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)進行相關(guān)性分析。從表3可以看出，貴州黑山羊NPY-Y1R基因AG、GG這2種基因型群體的的平均產(chǎn)羔數(shù)分別為1.75、1.15只，AG型產(chǎn)羔數(shù)比GG型多0.60只，2個基因型之間產(chǎn)羔數(shù)差異顯著;酉州烏羊NPY-Y1R基因AG、GG這2種基因型群體平均產(chǎn)羔數(shù)分別為1.63、1.15只，AG型產(chǎn)羔數(shù)比GG型多0.48只，2個基因型之間產(chǎn)羔數(shù)差異顯著;盧比亞NPY-Y1R基因AG、GG 2種基因型群體平均產(chǎn)羔數(shù)分別為1.50、1.17只，AG型產(chǎn)羔數(shù)比GG型多0.33只，2個基因型之間產(chǎn)羔數(shù)差異顯著。

3 結(jié)論與討論

近些年，研究人員不斷地挖掘NPY-Y1R基因的突變位點，并且有研究發(fā)現(xiàn)NPY-Y1R基因可能是影響山羊產(chǎn)羔數(shù)性狀的一個主效基因。國內(nèi)外對NPY-Y1R基因在山羊上的研究較少。儲明星等在濟寧青山羊、波爾山羊、安哥拉山羊和內(nèi)蒙古絨山羊上對NPY-Y1R基因進行多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，在G1141A位點處4個山羊品種中都存在突變，為CC型與CD型2種基因型，CC和CD基因型濟寧青山羊上的產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著;在C1330T位點處濟寧青山羊上存在突變，為EE型、EF型2種基因型，EF型濟寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)均值比EE型多0.58只，表明NPY-Y1R基因的F等位基因可能與濟寧青山羊性早熟和高繁力相關(guān)[1]。

本試驗在3個山羊群體NPY-Y1R基因外顯子中檢測到1個單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點，NPY-Y1R基因在外顯子2處存在突變位點G1141A，在此突變位點處3個山羊群體均存在2種基因型，分別為AG、GG。產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析顯示，G1141A位點與貴州黑山羊、努比亞試驗群體繁殖性狀顯著相關(guān)，具體表現(xiàn)為貴州黑山羊、酉州烏羊、努比亞AG基因型個體的產(chǎn)羔數(shù)均高于GG基因型個體，本試驗推斷AG基因型可能是貴州黑山羊、酉州烏羊、努比亞繁殖性能的優(yōu)勢基因型，NPY-Y1R基因的G1141A位點可望作為貴州黑山羊、酉州烏羊、努比亞等繁殖性能選擇的遺傳標(biāo)記而應(yīng)用于山羊的分子選育。

參考文獻：

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