劉璐 劉蕓伯 佟佳欣 閆彤 徐洪偉 周曉馥

摘要：為了探究牛皮杜鵑在低溫脅迫下MAPK級聯(lián)途徑參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制，通過轉(zhuǎn)錄組測序的方法對4 ℃低溫處理組和25 ℃正常對照組牛皮杜鵑進(jìn)行研究。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄組測序共得到6.40 Gb clean data，低溫組篩選出12 261個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因和下調(diào)基因的數(shù)量分別為6 811個和5 450個。對關(guān)鍵基因進(jìn)行KEGG注釋發(fā)現(xiàn)，共有228個差異表達(dá)基因富集到MAPK信號通路-植物通路，其中ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中大部分差異表達(dá)基因發(fā)生上調(diào)，說明該信號通路在低溫脅迫下被激活。推測牛皮杜鵑在低溫脅迫下可激活MAPK級聯(lián)途徑中相關(guān)基因的表達(dá)來參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，進(jìn)而應(yīng)對低溫環(huán)境所帶來的不利影響。

關(guān)鍵詞：牛皮杜鵑;低溫脅迫;MAPK級聯(lián)途徑;ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo);基因表達(dá)分析

中圖分類號：S685.210.1 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0059-06

牛皮杜鵑（Rhododendron chrysanthum Pall. ）別稱牛皮茶，杜鵑花科杜鵑屬，是世界上最珍貴的種質(zhì)資源之一，由于具有重要的觀賞及藥用價值[1]，因此極具開發(fā)潛力。

低溫作為一種主要的逆境脅迫，嚴(yán)重影響植物的地理分布和品質(zhì)[2]。脫落酸（ABA）既是一種植物激素也是一種信號傳導(dǎo)物質(zhì)，在植物逆境研究方面具有重要意義[3]。有研究證實(shí)，低濃度的ABA處理冬小麥幼苗會促使其生長，而高濃度的ABA則會抑制幼苗的光合作用效率，引起生物量積累下降[4]。 MAPK（mitogen activated protein kinase）級聯(lián)途徑包括MAPKKK-MAPKK-MAPK 3個組分，這3個組分既可獨(dú)自發(fā)揮作用也可彼此協(xié)作發(fā)揮作用，使植物及時作出相應(yīng)的反應(yīng)以抵御逆境脅迫帶來的危害，該途徑也被認(rèn)為是植物細(xì)胞將胞外刺激轉(zhuǎn)換成胞內(nèi)反應(yīng)的主要途徑之一[5-7]。大量研究表明，MAPK級聯(lián)途徑的3個組分均可直接或間接地參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，ABA信號也可調(diào)控MAPK級聯(lián)途徑中相關(guān)組分基因的表達(dá)[8]，但是對兩者相互作用的分子機(jī)制卻鮮有研究。

近年來，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)應(yīng)用廣泛，它可不依賴參考基因組，這為牛皮杜鵑等無內(nèi)參的非模式生物的轉(zhuǎn)錄組研究提供了新方法[9]。本研究以牛皮杜鵑為試驗(yàn)材料，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序的方法研究在 4 ℃ 低溫脅迫下牛皮杜鵑MAPK級聯(lián)途徑參與ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的基因表達(dá)情況，旨在從分子水平上探究二者相互作用的分子機(jī)制，為植物抗逆境脅迫研究提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

牛皮杜鵑采自長白山，用1/4 MS培養(yǎng)基置于吉林師范大學(xué)吉林省植物資源科學(xué)與綠色生產(chǎn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室模擬高山植物智能人工氣候室中正常培養(yǎng)[光—暗周期14 h—10 h;晝溫25 ℃，夜溫18 ℃;光子通量密度50 μmol/（m2·s）]，選取8個月大的牛皮杜鵑組培苗為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 2018年9月20日選擇8個月大長勢一致且良好的牛皮杜鵑隨機(jī)分成2組，每組12棵。隨機(jī)選擇其中1組置于智能人工培養(yǎng)箱[光—暗周期14 h—10 h;晝溫25 ℃，夜溫18 ℃;光子通量密度50 μmol/（m2·s ）]中，記為對照組;另外1組移至4 ℃ 低溫環(huán)境下，記為低溫組。24 h后取出2組牛皮杜鵑于液氮中速凍后置于低溫冰箱中保存?zhèn)溆?，每組3次重復(fù)。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析 mRNA文庫構(gòu)建委托華大基因完成。對得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，去除不符合要求的reads，以保證結(jié)果的可靠性。使用RPKM值衡量基因的表達(dá)量，用以差異基因表達(dá)量的確定和分析，并篩選差異表達(dá)基因及功能注釋。

1.2.3 統(tǒng)計分析 使用SPSS 16.0進(jìn)行單向ANOVA，運(yùn)用LSD檢驗(yàn)差異性。采用Sigmaplot 12.5進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量檢測

經(jīng)華大基因檢測，對試驗(yàn)組和對照組樣品總RNA進(jìn)行質(zhì)量評價，符合建庫標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 數(shù)據(jù)組裝和質(zhì)量分析

通過高通量測序獲得原始數(shù)據(jù)，統(tǒng)計原始數(shù)據(jù)測序量。使用BUSCO數(shù)據(jù)庫對組裝的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行產(chǎn)量評估。結(jié)果顯示，Q30均在95% 以上，GC含量接近50%，N50值在1 k左右，說明測序數(shù)據(jù)可以用于組裝（表1）。

對過濾后符合要求的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，得到clean reads數(shù)。如表2所示，2組中的clean reads均占原始raw reads的85 % 以上，說明數(shù)據(jù)組裝和測序精確度較好。

2.3 差異表達(dá)基因的篩選與注釋

2.3.1 差異表達(dá)基因的篩選 為了研究低溫脅迫下ABA調(diào)控MAPK信號在牛皮杜鵑中的作用，對低溫處理組和對照組牛皮杜鵑進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。將差異表達(dá)量大于2倍的基因視為差異表達(dá)基因。在此標(biāo)準(zhǔn)下，低溫組共篩選出12 261個差異表達(dá)基因，包括6 811個上調(diào)基因和5 450個下調(diào)基因。

2.3.2 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析 根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫，低溫組篩選出的差異表達(dá)基因中有7 031個基因被注釋在細(xì)胞過程、環(huán)境進(jìn)化過程、遺傳進(jìn)化過程、新陳代謝和有機(jī)系統(tǒng)這五大類代謝通路的19個小類中（圖1）。其中，在2組牛皮杜鵑的差異基因KEGG分類中，448個差異基因參與了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)這一途徑。

在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，有228個差異表達(dá)基因富集到MAPK信號通路-植物通路，對這部分差異基因進(jìn)一步富集分析，以Qvalue最小的前20個GO Term作圖（圖2）。分別為MAPK信號通路-植物、植物-病原互作、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基糖和核苷酸糖代謝、蛋白酶體、色氨酸代謝、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、乙醛酸和二羧酸代謝、過氧化物酶體等。

由圖3可見，牛皮杜鵑PYR/PYL-PP2C-SnRK2信號通路在響應(yīng)低溫脅迫的過程中，差異基因的表達(dá)量發(fā)生顯著改變，且大部分的差異基因表達(dá)量發(fā)生上調(diào)（表3），由圖4可知，低溫脅迫下SnRK2促使下游AREB/ABF家族中的差異基因表達(dá)量發(fā)生顯著變化，推測在低溫脅迫下牛皮杜鵑激活了ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)氣孔關(guān)閉、種子休眠。

2.4 低溫脅迫下MAPK級聯(lián)途徑參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵基因表達(dá)分析

2.4.1 低溫脅迫對牛皮杜鵑MAPK級聯(lián)信號途徑中關(guān)鍵基因的影響 結(jié)合圖2分析結(jié)果，最終確定從MAPK信號通路-植物、植物-病原互作、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基糖和核苷酸糖代謝、蛋白酶體、色氨酸代謝、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、乙醛酸和二羧酸代謝、過氧化物酶體這幾個代謝途徑尋找低溫脅迫下MAPK級聯(lián)途徑參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)生差異表達(dá)的關(guān)鍵基因。

MAPK信號通路-植物和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是低溫脅迫下牛皮杜鵑信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中2個最重要的途徑，參與多種植物代謝活動。對這富集在2條代謝通路的差異基因進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，在這2條代謝通路中，上調(diào)基因的數(shù)量都大于下調(diào)基因的數(shù)量，說明牛皮杜鵑這2條代謝途徑中的大部分關(guān)鍵基因的表達(dá)受低溫脅迫影響顯著。

結(jié)合表3與圖5結(jié)果，在MAPK級聯(lián)信號途徑中，低溫脅迫激活了MAPK17/18，然后以逐級磷酸化的方式激活MKK3、MPK1/2以及下游脅迫適應(yīng)基因，其中MAPK17/18、MKK3和MPK1/2基因表達(dá)量發(fā)生上調(diào)，脅迫適應(yīng)基因表達(dá)量發(fā)生下調(diào)。結(jié)果表明，牛皮杜鵑MAPK級聯(lián)信號途徑中的關(guān)鍵基因受到低溫脅迫的顯著影響。

2.4.2 低溫脅迫下牛皮杜鵑MAPK級聯(lián)途徑參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控 ABA作為一種主要的逆境激素，在植物面臨低溫、干旱、高鹽等非生物脅迫時，其含量在短時間內(nèi)會明顯上升，通過激活多條途徑中相關(guān)基因的表達(dá)來維持自身生理狀態(tài)的穩(wěn)定。在本研究中，如圖3所示，在外界環(huán)境信號刺激下，通過啟動類胡蘿卜素生物合成過程來開啟ABA合成系統(tǒng)，通過去磷酸化作用使得PP2Cs抑制SnRK2s活性，但受低溫脅迫的影響導(dǎo)致ABA含量升高，解除了這種抑制作用，使得SnRK2得到釋放，最終SnRK2促使下游AREB/ABF轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，誘導(dǎo)ABA響應(yīng)基因的表達(dá)。

而在低溫脅迫下ABA的PYR/PYL-PP2C-SnRK2信號通路中的大部分基因的表達(dá)量都發(fā)生上調(diào)，推測牛皮杜鵑在低溫脅迫下可以通過激活脫落酸合成相關(guān)基因，合成大量的脫落酸，促進(jìn)氣孔關(guān)閉，種子休眠，通過改變ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)基因的表達(dá)量，增強(qiáng)牛皮杜鵑抵抗低溫的能力。

3 討論

3.1 低溫脅迫對牛皮杜鵑MAPK級聯(lián)途徑的影響

對擬南芥和其他植物的研究中發(fā)現(xiàn)，MAPK級聯(lián)是植物響應(yīng)逆境脅迫的一條重要代謝途徑[10]。在研究非生物脅迫對玉米的抗氧化防御機(jī)制的影響時發(fā)現(xiàn)，在低溫處理下，MAPK級聯(lián)途徑受到抑制后，玉米中抗氧化酶活性均不同程度減弱，對低溫信號反應(yīng)遲鈍[11]。在本研究中，MAPK級聯(lián)途徑各組分在響應(yīng)低溫脅迫的過程中，先激活了MAPK17/18，然后以逐級磷酸化的方式依次激活MKK3、MPK1/2以及下游脅迫適應(yīng)基因，其中MAPK17/18、MKK3和MPK1/2基因表達(dá)量發(fā)生上調(diào)，脅迫適應(yīng)基因表達(dá)量發(fā)生下調(diào)。這些結(jié)果說明牛皮杜鵑MAPK級聯(lián)信號途徑中的關(guān)鍵基因受到低溫脅迫的顯著影響，并通過調(diào)節(jié)MAPK級聯(lián)途徑中相關(guān)基因的表達(dá)量來應(yīng)對低溫環(huán)境對其造成的不良影響。

3.2 低溫脅迫對牛皮杜鵑MAPK級聯(lián)途徑參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響

大量研究表明，植物在面臨低溫等非生物逆境脅迫時，會引起植物自身ABA的累積效應(yīng)[12-13]，而MAPK級聯(lián)作為參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑之

一，更是控制著細(xì)胞的諸多生命活動[14]。PP2C在非脅迫條件下可通過去磷酸化使SnRK2失去活性，進(jìn)而使得ABA信號傳遞終止[15]。而一旦接受外界或植物自身信號刺激并激活A(yù)BA合成相關(guān)基因誘導(dǎo)合成ABA之后，ABA與受體蛋白結(jié)合并在與PP2C互作時便可抑制PP2C活性以達(dá)到釋放SnRK2的目的，使得SnRK2恢復(fù)活性繼而磷酸化下游的AREB/ABF，將上游信號向下傳遞[16]。在本研究中，低溫脅迫下ABA的PYR/PYL-PP2C-SnRK2信號通路中的大部分基因的表達(dá)量都發(fā)生上調(diào)，推測低溫脅迫可以通過激活MAPK級聯(lián)途徑，進(jìn)而影響ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)基因的表達(dá)量的變化，使其在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序的方法對低溫脅迫下牛皮杜鵑MAPK級聯(lián)途徑參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的關(guān)鍵基因進(jìn)行分析，推測低溫脅迫可以激活MAPK級聯(lián)途徑中3個蛋白激酶家族中的關(guān)鍵基因，并調(diào)控了ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，從而激活A(yù)BA調(diào)控MAPK信號過程來應(yīng)對低溫脅迫環(huán)境。

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