周余華　唐義明　趙明明

摘要：在低溫脅迫條件下，分析克恩氏冬青細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)和Ca2+分布與抗寒性的關(guān)系。結(jié)果表明：隨著低溫脅迫的增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器受損程度也增強(qiáng)，到-16 ℃時，細(xì)胞膜系統(tǒng)出現(xiàn)了嚴(yán)重的損傷，同時細(xì)胞內(nèi)Ca2+沉淀量隨溫度的降低而增加。

關(guān)鍵詞：克恩氏冬青；低溫脅迫；葉片細(xì)胞；超微結(jié)構(gòu)；Ca2+分布

中圖分類號： Q945.78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0166-03

克恩氏冬青（Ilex×koehneana ‘Emily Bruner）為冬青屬常綠闊葉小喬木，是近期引進(jìn)的歐洲冬青雜交品種。許多冬青屬在低溫脅迫條件下有較好的耐寒性，可以引種到北方地區(qū)[1]，一般來說，植物細(xì)胞內(nèi)Ca2+分布及超微結(jié)構(gòu)會隨著低溫的變化而呈一定的相關(guān)性[2]，Ca2+作為胞內(nèi)第二信使調(diào)節(jié)著植物體內(nèi)的許多代謝和發(fā)育過程，因而起重要作用[3-6]。為進(jìn)一步研究克恩氏冬青的生態(tài)適應(yīng)性及其栽培和推廣的制約因素，于2012年對克恩氏冬青的耐寒性進(jìn)行系統(tǒng)研究，解析不同溫度條件下克恩氏冬青的解剖結(jié)構(gòu)和低溫脅迫的關(guān)系，從而深入研究克恩氏冬青的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，為克恩氏冬青選育及栽培提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

2012年6月將6種克恩氏冬青扦插于南京林業(yè)大學(xué)內(nèi)，待生根后及時上盆，放置于樹木園溫室內(nèi)待用。

1.2 方法

將樣品在25 ℃下放置1周進(jìn)行預(yù)冷，然后移至人工氣候室（-40～25 ℃），以5 ℃為1個階梯逐級降溫，分別降到0、-8、-16 ℃時各維持48 h，及時采取低溫處理好的植物頂端葉片迅速切成0.5 mm×0.5 mm的組織塊，并沉入到用 0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH值7.2）配制的2%多聚甲醛和2.5%戊二醛混合液中，室溫黑暗初固定6 h；然后用含2%焦銻酸鉀的緩沖液（pH值 7.6）洗滌3次，每次約0.5 h；再轉(zhuǎn)移到含2%焦銻酸鉀的緩沖液（pH值7.6）配制的1%鋨酸中，在4 ℃冰箱內(nèi)固定過夜。將2次固定過的組織塊用重蒸水洗滌4次后，再用pH值為10.0的重蒸水（用0.1 mol/L KOH 調(diào)節(jié)pH值）洗滌2次，每次約0.5 h。隨后經(jīng)系列冷乙醇脫水，環(huán)氧丙烷過渡，Epon812（環(huán)氧樹脂）包埋，LKB-V型超薄切片機(jī)切片，切片經(jīng)0.5%醋酸雙氧鈾染色，在H-600 型透射電子顯微鏡下觀察照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同低溫脅迫下克恩氏冬青葉片細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

2.1.1 0 ℃條件下克恩氏冬青葉片細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

由圖1可知，葉綠體仍然緊貼細(xì)胞壁排列，細(xì)胞核大部分較正常，少部分細(xì)胞核的核膜變得模糊，同樣近一端分布，液泡中有少量高電子密度的嗜鋨物質(zhì)分布；葉綠體中嗜鋨顆粒含量仍然較少且不含淀粉粒，其中葉綠體類囊體片層排列雖然規(guī)則、有序，但少部分清晰可見，大部分已模糊不清，線粒體略正常。

2.1.2 -8 ℃條件下克恩氏冬青葉片細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

由圖2可知，葉綠體仍然緊貼細(xì)胞壁排列，細(xì)胞核較正常，仍然近一端分布，液泡中含少量高電子密度的嗜鋨物質(zhì)；葉綠體中嗜鋨顆粒含量仍較多，同樣不含淀粉粒，其中類囊體片層排列仍然規(guī)則、有序；同樣，葉綠體大部分類囊體片層排列規(guī)則、有序且清晰可見，少部分葉綠體類囊體片層模糊，線粒體略正常。

2.1.3 -16 ℃條件下克恩氏冬青葉片細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

由圖3可知，葉綠體已不貼細(xì)胞壁排列，葉綠體及其他細(xì)胞器散落在細(xì)胞中；細(xì)胞中含有很少量的高電子密度嗜鋨物質(zhì)，多數(shù)葉綠體被膜消失，所含嗜鋨顆粒含量較多，不含淀粉粒，其中葉綠體的類囊體片層擴(kuò)張并且不清晰，細(xì)胞核、線粒體受損（圖3中的箭頭所指的部位為受損部位）。

2.2 低溫條件對克恩氏冬青葉片中Ca2+分布的影響

2.2.1 0 ℃條件下克恩氏冬青葉片中Ca2+的分布情況

由圖4可知，在0 ℃低溫下，克恩氏冬青葉片中的細(xì)胞間隙有Ca2+沉淀，在細(xì)胞壁外側(cè)、葉綠體膜和液泡膜上的Ca2+沉積比細(xì)胞器上多，細(xì)胞核上有少量沉淀。

2.2.2 -8 ℃條件下克恩氏冬青葉片中Ca2+的分布情況 由圖5可知，在-8 ℃低溫脅迫下，克恩氏冬青葉片的細(xì)胞壁外側(cè)、細(xì)胞間隙上有Ca2+沉積，大多情況下葉綠體、細(xì)胞壁、液泡上有少量沉積。

2.2.3 -16 ℃條件下克恩氏冬青葉片中Ca2+的分布情況

由圖5、圖6可以看出，在-16 ℃低溫處理下，Ca2+沉淀明顯多于-8 ℃低溫處理。類囊體片層或消失或模糊不清，葉綠體游離到細(xì)胞內(nèi)，不再緊貼細(xì)胞壁，且多數(shù)嚴(yán)重腫脹，細(xì)胞中液泡內(nèi)、細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中、細(xì)胞壁上有少量Ca2+沉積（圖6）。

3 結(jié)論與討論

隨著氣溫越來越低，克恩氏冬青葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯變化。在 0 ℃條件下，克恩氏冬青葉綠體呈長橢圓形且多數(shù)緊貼細(xì)胞壁分布，細(xì)胞核靠近一端，葉綠體片層清晰可見，液泡和葉綠體中有少量高電子密度的嗜鋨物質(zhì)分布，不含淀粉粒?？傮w來說，葉片細(xì)胞較正常，葉色較正常。在 -8 ℃ 條件下，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常，葉綠體稍有膨脹，片層彎曲，嗜鋨顆粒增加，出現(xiàn)了較多的環(huán)狀片層。在-16 ℃條件下，葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，嗜鋨顆粒增多且變大，細(xì)胞內(nèi)大部分細(xì)胞器散亂于細(xì)胞內(nèi)并變得模糊。可見，隨著低溫脅迫的增強(qiáng)，細(xì)胞核、葉綠體等細(xì)胞器受損程度也增強(qiáng)，細(xì)胞膜系統(tǒng)出現(xiàn)了嚴(yán)重的損傷，主要有葉綠體膜、細(xì)胞膜或解體或模糊不清。在0、-8 ℃脅迫下，克恩氏冬青葉片的基本結(jié)構(gòu)沒有改變，能適應(yīng)此低溫；而到-16 ℃時，細(xì)胞內(nèi)線粒體受到破壞，說明此時植物體已發(fā)生凍害。克恩氏冬青細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，說明與其抗寒性密切相關(guān)。試驗(yàn)中細(xì)胞內(nèi)的線粒體、葉綠體同樣是對低溫比較敏感的2個細(xì)胞器，而質(zhì)膜則是低溫傷害的首要部位[7]，這說明植物與低溫的適應(yīng)性具有很重要的意義。

克恩氏冬青細(xì)胞內(nèi)Ca2+分布隨溫度的變化而變化。在 0 ℃ 低溫脅迫下，細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+濃度很低；到-8 ℃低溫條件時，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯增加；到-16 ℃時，克恩氏冬青細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度增加，并沉淀成聚集狀態(tài)分布，此時細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度已經(jīng)超出植物的承受能力，Ca2+濃度平衡被打破，從而破壞和擾亂細(xì)胞正常的結(jié)構(gòu)與功能。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+變化通過啟動細(xì)胞內(nèi)生理生化過程，導(dǎo)致植物的外部抗寒性反應(yīng)，起著傳遞和放大信號的作用[8]。此外，Ca2+濃度過度增加會擾亂以無機(jī)磷為基礎(chǔ)的能量代謝系統(tǒng)[9]。由 Ca2+信使誘發(fā)的這一系列變化致使植物發(fā)生低溫傷害。

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